鸡Mx基因的克隆与原核表达

本研究旨在通过克隆鸡Mx全基因序列进而进行该基因的原核表达,获得具有生物学活性的蛋白.利用poly Ⅰ:C诱导鸡胚成纤维细胞Mx基因表达,克隆了Mx基因全长cDNA序列,将开放阅读框(ORF)连接构建于表达质粒pGEX-4t-2中获得重组表达载体pGEX-Mx,转化Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导后检测.表达产物检测显示该蛋白的相对分子量为75 ku.说明获得了Mx基因的高效表达,为进一步进行Mx基因的活性检测以及利用Mx蛋白进行抗病毒转基因的研究奠定了基础.     

鸡Mx基因的表达及其抗血清的制备

Mx蛋白已被证明具有抗A型流感病毒、Thogoto病毒和水泡性口膜炎病毒等的生物活性.本研究通过PCR扩增,将Mx基因克隆至pMD18-T载体;经测序验证后将Mx基因克隆到原核表达载体pProExHTa和pcDNA3.1中.以构建的重组质粒pProExHTa-Mx转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达,以切胶纯化方式回收了Mx融合蛋白,加佐剂乳化,免疫新西兰白兔制备抗血清;SDS-PAGE和western blot分析表明:Mx基因在大肠杆菌中以融合蛋白形式稳定表达,表达产物的相对分子量约80 ku,与预期值相符;抗血清能与Mx蛋白发生特异性反应.以真核表达重组质粒pcDNA3.1-Mx转染293T细胞,间接免疫荧光试验结果表明:原核表达蛋白免疫动物制备的抗血清与真核表达的Mx蛋白发生良好的免疫反应,表明用原核表达的Mx蛋白具有真核表达Mx蛋白相似的免疫学活性.抗血清的制备为鸡Mx蛋白的功能研究、Mx蛋白在转基因动物机体中表达的检测奠定了基础.     

鸡Mx基因的原核表达及表达蛋白抗病毒活性初步研究

将鸡Mx基因克隆入pET一32a载体,筛选鉴定后将重组阳性质粒转化到大肠埃希菌株BL21进行诱导表达,表达产物用west,ern blot鉴定,并经镍亲和层析法纯化及透析复性,得到的蛋白用微量细胞病变抑制法检测其抗病毒活性.结果显示,构建的载体经PCR扩增得到长度为2 118 bp的特异片段,测序结果证实与鸡Mx基因同...     

鸡抗病毒Mx蛋白修饰及其真核表达载体的构建

利用高保真RT-PCR的方法从Poly（I）·Poly（C）诱导的鸡成纤维细胞总RNA中扩增出鸡全长Mx cDNA,扩增产物克隆到pMD19-T Simple载体上,利用PCR突变技术将其第2 032位的碱基由G突变为A,经克隆测序证实突变成功后,将已突变的Mx基因插入真核表达载体,通过PCR、酶切鉴定插入片段正确,提取质粒转染COS-Ⅰ细胞进行RT-PCR鉴定。结果表明：正确克隆了鸡Mx基因,并成功对该基因进行PCR诱变修饰,构建了能够表达鸡Mx基因的重组真核表达载体,为Mx基因体内外表达及生物学活性的进一步研究奠定了基础。     

LacS基因原核表达载体构建及重组蛋白表达

克隆得到硫矿硫化叶菌中的糖苷酶基因LacS,利用原核表达载体pASK-IBA-2构建重组质粒pASK-IBA-2-LacS,酶切和测序鉴定证实LacS基因成功插入且基因阅读框正确。重组质粒pASK-IBA-2-LacS转化大肠杆菌Rosseta,去水四环素诱导后,菌液裂解离心亲和层析获得重组蛋白,western blot证实LacS在大肠杆菌Rosseta能高效表达。     

猪Mx1基因真核表达载体的构建及表达

根据GenBank中猪Mx1基因序列设计并合成引物,对Mx1基因ORF区全长1 992个碱基进行扩增。将扩增片段与pVax1载体连接,构建pVa-Mx1-ORF真核表达载体。将构建的表达载体导入BHK-21和HEK-293细胞进行表达,用RT-PCR和间接免疫荧光对表达产物进行鉴定。结果表明,所构建的pVa-Mx1-ORF表达载体在BHK-21和HEK-293细胞中成功表达。     

猪Mx1基因及分段基因真核表达载体的构建和鉴定

试验旨在通过对猪Mx1基因及其分段基因的真核表达载体的构建和鉴定,为进一步研究Mx1基因的功能奠定基础。试验以猪Mx1的基因序列为基础,以真核表达质粒pXJ41为载体,依据Mx1的蛋白结构进行分段,添加了Flag标签,构建了Mx1及Mx1分段基因的真核表达质粒,分别命名为pXJ41-Flag-Mx1、pXJ41-Flag-G、pXJ41-Flag-GMD、pXJ41-Flag-MDL4、pXJ41-Flag-GED。然后通过免疫印迹试验检测上述质粒在HEK-293T细胞中的表达情况,通过间接免疫荧光试验鉴定目的蛋白在细胞内的定位情况。免疫印迹试验成功检测到了Mx1及Mx1分段基因的蛋白条带,间接免疫荧光试验检测到各目的蛋白定位于细胞质。上述真核表达质粒可在HEK-293T细胞中成功表达,Mx1及其分段真核表达质粒的构建和成功表达及定位对进一步探索Mx1的功能及机制奠定了基础。     

小鼠Nudt9基因原核载体的构建及其生物信息学分析

利用分子克隆的方法,将小鼠Nudt9基因克隆至原核表达载体,并进行PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定;再运用DNAMAN和DNATAR对基因进行同源性分析及抗原肽分析,同时在线分析小鼠Nudt9蛋白的信号肽、跨膜区域、结构域、N-糖基化位点以及磷酸化位点。本研究成功获得重组pET28a-Nudt9质粒,并从基因及氨基酸组成上分析该蛋白的特性,从而挖掘出一些基因及蛋白生物信息。     

金黄地鼠（Mesocricetus auratus）朊蛋白基因的克隆及其原核表达

采用RT-PCR技术从金黄地鼠(Mesocricetus auratus)脑组织获得朊蛋白基因(Prion protein nucleic acid,PRNP)开放阅读框(Open reading frame,ORF),截去其N端信号肽(66 bp)和C端GPI锚定位点(69 bp)形成朊蛋白编码区PRNPx;将编码区重组于融合表达质粒Pet-DsbA中,并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中经IPTG诱导表达,并经Western-blot验证。结果表明,金黄地鼠PRNP基因ORF区全长为765 bp,编码254个氨基酸的前体蛋白,核苷酸序列与已发表金黄地鼠序列(M14054)同源性为99.87%,其第116个氨基酸发生了同义突变由GCT变为GCC;朊蛋白在大肠杆菌得到高效表达,产物是相对分子质量为47 000的融合蛋白。     

鸡白介素18基因原核表达质粒构建

根据已发表的江西土鸡白介素 -1 8(Ch IL-1 8) c DNA编码基因序列设计引物 ,用PCR技术从 p MDCh IL-1 8质粒扩增出编码鸡IL-1 8成熟蛋白基因 ,重组于 p BV2 2 0表达载体上 ,将重组质粒转化大肠杆菌 JM1 0 9(DE3 ) ,转化子经温度诱导的表达产物 ,SDS-PAGE电泳鉴定约 2万 ,N端开头 1 5个氨基酸序列测定分析 ,证明获得了鸡 IL-1 8成熟蛋白 ,为今后深入研究鸡 IL -1 8的生物学特性及其临床应用打下了基础     

鸡干扰素-α基因原核表达载体的构建及高效表达

干扰素（IFN）-α因其具有很强的抗病毒活性而备受关注。本研究根据GenBank上公布的鸡IFN-α核酸序列设计1对引物,用PCR方法扩增出鸡IFN-α基因,并将其克隆到原核表达载体pET-32a及pET-30a-DsbA上,得到重组质粒pET-32a-IFN-α及pET-30a-DsbA-IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞,经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析,结果表明pET-30a-DsbA-IFN-α表达量较高,表达的融合蛋白分子质量约40.4 ku,表达产物主要以包涵体形式存在,且表达的融合蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。     

猪Mx1基因真核表达载体的构建、鉴定及其表达

为获得转Mx1基因的阳性陆川猪成纤维细胞,本研究以干扰素诱导猪成纤维细胞Mx1基因表达,提取细胞总RNA,RT-PCR获得编码猪Mx1蛋白的cDNA;以pMSCV-IRES-GFP为骨架构建猪Mx1基因表达载体pMSCV-IRES-GFP-Mx1,并利用脂质体2000介导重组质粒转染陆川猪胎儿成纤维细胞,通过荧光观察和PCR检测分析结果表明Mx1蛋白基因整合进入陆川猪胎儿成纤维细胞。     

鸡白细胞介素2原核表达载体的构建及表达产物的鉴定

将鸡白细胞介素2(IL-2)的cDNA克隆到原核表达载体pET-30a( )上，构建原核重组表达质粒pET-IL-2，并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，37℃用IPTG诱导3.5h后，SDS-PAGE检测表明，表达蛋白以包涵体的形式存在。将诱导后的工程菌超声波裂解，离心后的沉淀用PBS洗涤5～6次，得到高纯度的目的蛋白。     

鸡EED基因的原核表达与生物信息学分析

本研究旨在获得鸡胚胎外胚层发育（embryonic ectoderm development,EED）原核表达蛋白,并利用生物信息学方法探索其潜在生物学功能。以提取的3日龄雏鸡脾脏总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增鸡EED基因,将其克隆至pET-32a （+）载体,构建重组表达载体pET-32a-EED,转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中进行IPTG诱导表达;Western blotting检测经镍离子亲和层析法纯化的鸡EED蛋白,并利用在线软件对其进行生物信息学分析。结果显示,鸡EED基因序列全长1 341 bp,与参考序列（GenBank登录号：NM_001031376.1）相似性为99.85％;当诱导温度为28 ℃,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导剂诱导表达7 h时,可在重组菌裂解上清中纯化得到分子质量约70 ku的鸡EED融合蛋白。在线软件分析表明,鸡EED蛋白相对分子质量为50 377.92,理论等电点（pI）为6.54,为亲水蛋白,无跨膜结构域和信号肽序列,该蛋白序列与人多疏蛋白EED三级结构模板序列（6c23.1）相似,同样具有肿瘤靶点WD40结构域。结果表明,本研究成功获得大肠杆菌表达的鸡EED可溶性蛋白,且该蛋白具有重要的功能元件,可为深入探索鸡EED蛋白的生物学功能与调控机理提供材料。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因原核表达载体的构建与鉴定

本试验旨在构建能表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的重组质粒。用疑似患猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病猪的脾脏、肺脏病料提取RNA,根据PRRSV ORF5基因设计1对引物,进行RT-PCR扩增,将ORF5目的基因克隆到pMD19-T载体中,得到pMD19-ORF5重组菌。根据测序结果和表达载体特点,设计1对带有NcoⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物,扩增目的片段(dORF5),将其分别与pProEXHTb载体、pNZ8149载体连接,得到HTb-dORF5/DE3和pNZ8149-dORF5/NZ3900重组菌,分别用IPTG和Nisin诱导,再进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果显示,HTb-dORF5/DE3重组菌在1.5 mmol/L IPTG诱导时表达量最高,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,在约22 ku处有特异性条带,且具有反应原性;pNZ8149-dORF5/NZ3900重组菌在20 ng/mL Nisin诱导时表达量最高,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,在约19 ku处有特异性条带,间接免疫荧光试验有特异性绿色荧光。本研究成功构建重组质粒HTb-dORF5和pNZ8149-dORF5并获得表达,这为进一步研制预防PRRS疫苗奠定坚实基础。     

猪IL-18基因原核表达载体的构建及表达

以含新兴猪IL-18基因的真核质粒pcDNA3.1-pIL18为模板,扩增出新兴猪IL-18基因,将其定向克隆至原核表达载体pET32c和pET41c的SacⅠ和KpnⅠ位点,构建了原核表达载体pET32c-pIL18和pET41c-pIL18。经酶切和PCR鉴定,表明所构建的重组质粒为特异性新兴猪IL-18基因原核表达质粒。将该重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)细胞,筛选的阳性菌落经SDS-PAGE分析及Western-blotting分析,表明成功构建了表达重组猪IL-18的大肠埃希菌基因工程菌株。蛋白的可溶性分析表明,重组蛋白呈不可溶表达,在菌体内以不溶性的包涵体形式存在。     

Construction and Identification of PRRSV ORF5 Gene Prokaryotic Expression Vector

The present study was designed to construct recombinant plasmids,which could express porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) ORF5 gene.RNA was extracted from spleen and lung samples of the suspected pigs which were infected with PRRSV.According to PRRSV ORF5 gene,a pair of primers was designed for RT-PCR amplification.The ORF5 target gene was cloned into pMD19-T vector and then the recombinant pMD19-ORF5 was achieved.According to the sequencing results and the characteristics of expression vectors,a pair of primers with NcoⅠand XbaⅠenzyme cleavage sites was designed.Target fragment dORF5 was amplified and then connected to pProEXHTb and pNZ8149 vectors,respectively.And recombinant HTb-dORF5/DE3 and pNZ8149-dORF5/NZ3900 was induced by IPTG and Nisin,respectively,and analyzed by SDS-PAGE and Western blotting.Recombinant HTb-dORF5/DE3 induced by 1.5 mmol/L IPTG was expressed in the highest quantity.There were specific band at about 22 ku with reactionogenicity when it was tested by SDS-PAGE and Western blotting.Recombinant pNZ8149-dORF5/NZ3900 induced by 20 ng/mL Nisin was expressed in the highest quantity.There were specific band at about 19 ku with reactionogenicity when it was tested by SDS-PAGE and Western blotting.The IFA result showed specific green fluorescence.This study successfully constructed recombinant plasmids HTb-dORF5 and pNZ8149-dORF5 and expressed,the result laid a solid foundation for further development of PRRS vaccines.     

奶牛SRY基因核心保守区真核表达载体构建及序列分析

SRY基因是哺乳动物性别分化与控制的主导基因,参与有序的、多层次调控性别分化和控制的过程。本研究从牛血中提取总RNA,设计特异性引物,利用RT-PCR技术扩增出SRY基因HMG box基因片段,将该片段与pMD18-T载体连接并转化到大肠杆菌(E.coliTop)10中,提取质粒并用EcoRⅠ、AvrⅡ酶消化,将消化后的目的基因纯化并回收,与经同样的酶消化后并纯化回收的载体pPIC9K连接并转化到E.coliTop10,获得重组表达质粒pPIC9K-SRYHMG box,经PCR、酶切、测序验证了此载体构建成功,为下一步使用毕赤酵母表达SRY蛋白打下基础。