小鼠miR-151-3p靶基因筛选和鉴定

采用生物信息软件系统分析miR-151-3p的保守性,并筛选出与小鼠肌肉发育和肿瘤发生相关靶基因:蛋白激酶3(serine/threonine kinase 3,Akt 3),Twist碱性螺旋-环-螺旋转录因子(twist basic helix-loophelix 1,Twist 1)和T型电压依赖性钙通道α1g亚基(calcium channel,voltage-dependent,T type,alpha 1g subunit,Cacna1g)。采用实时定量PCR及双荧光素酶报告基因检测技术对以上靶基因进行初步验证,结果表明,超表达miR-151-3p显著抑制Akt 3mRNA表达,而Twist 1和Cacna1g mRNA表达变化不显著;双荧光素酶报告系统分析发现,miR-151-3p显著抑制野生型Akt 3报告载体相对荧光素酶活性,突变Akt 3 3′UTR与miR-151-3p结合的位点后,相对荧光素酶活性得到恢复,而Twist 1和Cacna1g基因双荧光素酶报告载体无此现象,结果证实Akt 3是miR-151-3p的靶基因。     

鸭脂肪生成相关的miR-184-3p分析及关键靶基因筛选

为筛选miR-184-3p影响鸭脂肪生成的关键靶基因,本研究首先利用在线数据库预测miR-184-3p靶基因,并对靶基因进行富集分析和蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interaction,PPI）网络构建,寻找网络图中有意义的模块,然后分析靶基因在脂肪中的表达,再依据microRNA对靶基因负相关的作用机制筛选关键靶基因。最后,通过RNA22 v2对筛选结果进行评估。结果表明：1）共获得225个靶基因。2)GO富集分析显示,靶基因参与细胞和大分子生物合成过程的负调控过程;KEGG富集结果包含Notch信号传导途径、动物线粒体自噬和内吞作用3条显著通路。3)PPI网络图共筛选4个核心基因;4）表达谱分析共筛选到4个基因,DVL3(Dishevelled segment polarity protein 3)、HOXA9(homeobox A9)、LIFR(LIF receptor subunit alpha)和SPECC1L(Sperm antigen with calponin homology and coiled-coil domains 1 like);而R...     

与植物抗逆相关的miR-398-3p基因家族进化分析及靶基因预测

通过生物信息学方法对miR-398-3p基因家族进行序列分析和靶基因预测。结果表明,大部分miR-398-3p基因分布在不同的染色体上,miR-398-3p序列在不同物种间具有高度的保守性。进化分析结果表明,miR-398-3p基因家族的成员呈现为7个分支,个别物种miR-398-3p的不同成员具有较远的亲缘关系;miR-398-3p的靶基因具有超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、花粉特异性蛋白质SF3、锌指蛋白WIP2、C2H2型锌指家族蛋白等功能,参与植物的生物和非生物胁迫及生长发育调控过程。     

绵羊miR-376e-3p的靶基因预测与GO功能分析

[目的]研究miRNA对脂肪代谢的调节作用,在一定程度上揭示脂肪代谢的分子机制。[方法]本研究选取实验室前期高通量测序结果中的miR-376e-3p进行研究,其在不同脂尾型绵羊尾部脂肪组织中差异表达显著,是脂肪代谢的关键miRNA。用3种软件对miR-376e-3p进行靶基因预测,并对预测结果进行GO通路富集分析。[结果]MiR-376e-3p有25个潜在的靶基因,其中21个基因富集到3种分子功能,23个基因富集到14个生物学过程中,其中Vldlr具有脂蛋白粒子受体活性。[结论]推测miR-376e-3p可能通过调节其潜在靶基因Vldlr参与脂肪代谢。为进一步研究miR-376e-3p和Vldlr在绵羊脂肪代谢中的作用奠定了基础。     

抑制miR-29a-3p表达对小鼠巨噬细胞凋亡的影响及机制

【目的】研究miR-29a-3p下调表达对小鼠巨噬细胞凋亡及相关基因表达的影响,为探讨结核病发病机制、研发新的诊断与治疗方法提供依据。【方法】将重组抑制载体p EZX-AM02-miR-29a-3p转染RAW264.7细胞,24、36和48 h荧光显微镜观察转染效率,Real time-PCR法检测miR-29a-3p及凋亡相关基因caspase3、caspase7、caspase8、Bcl-2、Mcl-1和Bax的表达水平,流式细胞术检测RAW264.7细胞的凋亡率。【结果】重组抑制载体转染后,细胞内miR-29a-3p表达水平明显下降;而caspase7、caspase8、Bcl-2、Mcl-1和Bax等基因的表达出现不同程度的上调;流式细胞术分析发现随着转染时间延长,细胞凋亡率增加,且36 h凋亡率最高。【结论】p EZX-AM02-miR-29a-3p重组载体可抑制小鼠巨噬细胞中miR-29a-3p的表达,通过靶向上调caspase7、caspase8、Bcl-2和Mcl-1等基因的表达促进巨噬细胞的凋亡。     

NELL1和FMO3基因mRNA在绵羊肝脏与脂肪组织中的表达

旨在探究不同营养水平及不同生长阶段脂尾型绵羊NELL1和FMO3基因mRNA的组织特异性表达模式。选择健康、体质量相近的9月龄滩羊、同羊、哈萨克羊和西藏羊(羯羊)各3只,活体采集尾部脂肪样品。选择健康4月龄滩羊112只随机分为4组,公母各半,每组4个重复,每个重复7只羊。根据体质量增加目标分为3个阶段:22~28kg,28~35kg,35~40kg,每个阶段各组分别饲喂不同营养水平的日粮。每个生长阶段结束时采集肝脏、肾周脂肪、尾脂、皮下脂肪的组织样品,提取样品总RNA,采用实时荧光定量PCR的方法分析NELL1和FMO3 mRNA的表达差异。结果表明,FMO3 mRNA在哈萨克羊尾脂中的表达量最高,在同羊、滩羊、西藏羊尾脂中依次下降,且差异显著;NELL1 mRNA在西藏羊尾脂中的表达量最高,在滩羊、同羊、哈萨克羊中的表达量依次下降;营养水平和月龄对尾脂和肝脏中NELL1和FMO3 mRNA的表达水平有显著影响,而对皮下脂肪和肾周脂肪中NELL1和FMO3 mRNA的表达影响不显著。表明FMO3mRNA的表达水平与脂肪沉积呈正相关,而NELL1 mRNA的表达水平与脂肪沉积呈负相关;NELL1与FMO3对绵羊尾脂和肝脏中的脂肪沉积起调控作用,为进一步揭示脂尾型绵羊体内脂肪沉积的调控机制提供理论基础。     

miR-423-5p在牛肌肉组织中表达及其靶基因预测

miR-423-5p在细胞中具有重要的生物学功能,如在肌细胞中能影响细胞的增殖.根据miRBase及NCBI网站显示的相关信息利用分析软件对miR-423在各物种之间的同源性进行了分析.取成年西门塔尔牛体内的骨骼肌、小肠、心脏组织利用茎环荧光定量PCR进行miR-423-5p表达量检测,将牛骨骼肌卫星细胞(MDSCs)...     

绵羊甲状腺miR-370-3p靶向COL4A3基因调控繁殖力性状的初步研究

为探讨小尾寒羊甲状腺组织中与繁殖功能相关的miR-370-3p与COL4A3的靶向关系,本研究利用miRDB与Targetscan网站预测了miR-370-3p的靶基因,并取其交集进行功能富集分析,通过RNAhybrid与Targetscan网站预测绵羊miR-370-3p与候选靶基因的结合位点;随后检测了miR-370-3p与COL4A3基因在小尾寒羊甲状腺组织中的相对表达量。构建psiCHECK2-COL4A3-3′UTR-野生型/突变型双荧光素酶载体,并将其与miR-370-3p mimics/mimics NC共转染至HEK293T细胞并检测荧光活性。结果显示：1)miR-370-3p的靶基因可富集到孕酮介导的卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路、Ras信号通路和FoxO信号通路等与动物繁殖有关的信号通路中。2)miR-370-3p可与COL4A3基因3′UTR区域结合,且两者在小尾寒羊甲状腺组织中表达呈相反趋势。3)共转染psiCHECK2-COL4A3-3′UTR-野生型和miR-370-3p mimics组的荧光素酶活性显...     

绵羊miRNA-411a与其靶基因FLT3的相互作用

miRNAs是一类长约22 nt的非编码单链小RNA分子,主要与靶基因的3′UTR结合参与生物体基因的表达和调控过程。已经证实许多miRNA通过对靶标的调控,在支原体肺炎感染过程中起重要作用。为验证miRNA-411a与预测的靶基因 FLT3间存在相互作用,采用生物信息学方法分析预测其二级结构,利用荧光定量PCR技术分析miRNA-411a的正常表达和过量表达后靶基因 FLT3的相对表达量,双荧光素酶报告基因试验验证两者的相互作用。结果表明,miRNA-411a与其靶基因 FLT3能形成典型的二级茎环结构;在过量表达miRNA-411a后,其靶基因 FLT3的表达量显著降低。综上所述,miRNA-411a是通过与 FLT3的3′UTR结合而发挥作用,确定 FLT3是miRNA-411a的靶基因。     

MiR-433-3p靶向调节绵羊BCKDHB表达

【目的】通过理论预测与试验验证,旨在揭示miR-433-3p对BCKDHB的调节机制。【方法】利用Target Scan、miRanda和DIANA-micro T 3个在线软件,以BCKDHB的序列预测与BCKDHB有靶标关系的相关miRNAs。为了验证理论上的预测结果,用设计好的BCKDHB 3′-UTR的特异性引物进行PCR扩增,得到目的片段并进行割胶回收和纯化,并将Pmir-GLO与目的片段同时使用Xho Ⅰ和Xba Ⅰ两个限制性内切酶进行双酶切,再用T4连接酶连接双酶切之后的目的片段和Pmir-GLO,成功构建BCKDHB 3′-UTR的双荧光素酶报告载体。从公司购买miR-433-3p的过表达载体mimics和阴性对照载体NC,设置miR-433-3p过表达、阴性对照、空白对照3个组,分别将2组载体和双荧光素酶报告载体利用lipofectamineTM3000转染试剂共转染至miR-433-3p过表达、阴性对照组的HEK-293T细胞中,空白对照组中的HEK-293T细胞正常培养,之后分别检测3组细胞中的荧光活性,得到萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性,以海肾荧光素酶活性为内参计算萤火虫荧光素酶的相对活性。便于了解miR-433-3p和BCKDHB在绵羊前体脂肪细胞中的调控机制,对采取的绵羊尾部前体脂肪细胞进行离体培养。用过表达miR-433-3p的方法探索miR-433-3p在绵羊前体脂肪细胞中对BCKDHB的调控,提取过表达miR-433-3p前后细胞的总RNA和总蛋白,利用RT-qPCR检测过表达miR-433-3p前后的miR-433-3p和BCKDHB m RNA的表达量、以及利用Western blotting技术检测BCKDHB在过表达前后的蛋白水平。为了解绵羊前体脂肪细胞分化过程中BCKDHB和miR-433-3p表达量的变化,用RT-qPCR检测前体脂肪细胞分化过程中BCKDHB和miR-433-3p的时序表达。为增加结果的可信度,还对分化过程中不同时段的细胞进行了照片采集和油红O染色。【结果】miR-433-3p在BCKDHB3′-UTR的第8—28个碱基处存在理论上的结合位点。通过比较过表达组,阴性对照组,对照组的相对荧光活性发现过表达miR-433-3p后,BCKDHB 3′-UTR重组双荧光载体的相对荧光活性降低(P0.01),说明miR-433-3p可以与BCKDHB 3′-UTR特异性结合,验证了预测结果的准确性。在绵羊前体脂肪细胞中过表达miR-433-3p后,通过比较过表达组和阴性对照组BCKDHB的m RNA和蛋白的相对表达量,发现过表达组BCKDHB m RNA和蛋白的相对表达量低于阴性对照组(P0.05),说明miR-433-3p在绵羊前体脂肪细胞中对BCKDHB有负调控作用。在诱导绵羊前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的过程中,从采集到的图片和油红O染色的结果发现此过程中脂滴聚积得越来越多,油红O染色验证了脂滴的聚集。另外,在分化过程中检测到miR-433-3p和BCKDHB m RNA的表达量呈现负相关关系。【结论】这些结果充分说明miR-433-3p通过与BCKDHB 3′-UTR的结合负调节该基因及其编码蛋白的表达,为进一步研究BCKDHB调节绵羊脂肪代谢的分子机理提供了科学依据。     

ITGB1基因表达与鹅肥肝形成的关系

为探究ITGB1基因与鹅肥肝形成的关系,选取30只70日龄健康朗德公鹅,随机分为填饲组与对照组并进行24 d填饲.运用ITGB1基因序列进行生物信息学分析,采用RT-qPCR技术检测不同填饲阶段(填饲12d与24d)鹅肝脏中ITGB1基因的表达水平,同时,使用不同剂量的脂肪肝形成相关因子(胰岛素、葡萄糖、油酸、亚油酸和棕榈酸)处理鹅原代肝细胞,检测ITGB1基因的表达水平.结果 发现:全长CDS共2418 bp,编码805个氨基酸,与鸭的同源性高于98％,可编码1种亲水性蛋白;与对照相比,填饲12d与24 d时,鹅肝脏中ITGB1基因的表达均显著上调(P＜0.05);0.5 mmol·L-1油酸、亚油酸和棕榈酸均能显著地诱导鹅原代肝细胞中ITGB1基因上调(P＜0.05);200mmol·L-1葡萄糖能极显著地诱导鹅原代肝细胞中ITGB1基因上调(P＜0.01);此外,0.2 mmol·L-1胰岛素也能在一定程度上有诱导其表达上调的趋势(P=0.098).结果 表明,ITGB1基因表达上调与鹅肥肝形成密切相关,受脂肪肝形成相关因子诱导,提示ITGB1基因表达上调可能会促进鹅肥肝的形成.     

清远麻鸡miR-142-3p分析及其关键靶基因的筛选

为分析清远麻鸡不同组织中miR-142-3p的表达情况,并筛选其在脾脏中的关键靶基因,本研究利用在线数据库预测鸡miR-142-3p靶基因,并对靶基因进行GO和KEGG富集分析以及构建蛋白-蛋白互作网络。利用在线公共数据库,分析脾脏相对于其他组织的miR-142-3p表达量;再根据miRNA表达量与其靶基因表达量负相关机制,对miR-142-3p靶基因与脾脏中相对其他组织显著下调基因取交集,筛选潜在靶基因。结果表明：1）预测获得85个靶基因,GO富集分析显示,靶基因参与多种高分子化合物的合成与转运过程。2）KEGG结果显示富集到MAPK、Notch、Wnt等多条与抗肿瘤免疫相关的信号通路。3）PPI网络共筛选到4个Hub基因。4）miR-142-3p在脾脏中的表达量极显著高于肝脏、肺脏、胸肌、心脏和肾脏（P<0.01）。5）共筛选到TWF1、MYH10、NFIB、FNBP1L和FERMT2 5个靶基因。综上,鸡miR-142-3p在脾脏中很可能通过TWF1、MYH10、NFIB、FNBP1L和FERMT2 发挥生物学功能。本研究为解析鸡miR-142-3p的功能及其分子机制提供了参考和依据。     

gga- miR-17-5p在鸡骨骼肌和脂肪沉积相关组织及细胞中的表达差异及其关键靶基因的筛选

为探究gga-miR-17-5p在鸡脂肪沉积和肌肉发育中的作用,本研究以矮小品系S3（DW）和隐性白羽鸡（RR）为试验素材,分析gga-miR-17-5p在不同时期腿肌、肝脏、腹脂组织及细胞中的表达差异,并通过KEGG及蛋白互作分析筛选关键靶基因。结果表明：1）gga-miR-17-5p在腹脂、肝脏和腿肌组织中均可表达。在腹脂中,gga-miR-17-5p在0周表达有品种差异（P<0.05）,且2个品种在0周时显著高于其他周龄（P<0.05）;在肝脏中,gga-miR-17-5p在16周有品种差异（P<0.05）,S3系在16周显著高于其他周龄（P<0.05）,隐性白羽肉鸡在16周显著高于0周和8周（P<0.05）;在腿肌中,gga-miR-17-5p在0周有品种差异（P<0.05）,S3系在0周和2周显著于其它周龄（P<0.05）,隐性白羽肉鸡在0周显著高于其他周龄（P<0.05）。2）在脂肪细胞中,gga-miR-17-5p在肌内脂肪细胞诱导分化6 d后的表达显著高于增殖期和分化1 d（P<0.05）;腹脂细胞分化1 d的表达最低,显著低于增殖期、分化4 d和分化6 d（P<0.05）。3）在成肌细胞中,gga-miR-17-5p的表达量随分化时间的延长而升高,且分化6 d的表达显著高于增殖期（P<0.05）。4）KEGG及蛋白互作分析表明,PTEN、MAPK3、PIK3R1、BECN1和PLCB4是gga-miR-17-5p重要的靶基因。RT-qPCR结果表明,PTEN和PIK3R1在成肌细胞增殖期的表达显著高于分化期（P<0.05）。综上,gga-miR-17-5p的表达存在显著的品种和组织差异性,miR-17-5p很可能通过PTEN、MAPK3、PIK3R1、BECN1和PLCB4来影响肌肉发育和脂肪沉积,其中PTEN和PIK3R1尤为关键。本研究为深入研究gga-miR-17-5p的功能和机制提供了坚实的理论基础和数据支撑。     

miR-142-3p在MCF-7细胞中靶向调节AKT pathway活性机理

为探究miR-142-3p在MCF-7细胞中作用机理,采用RNA免疫共沉淀技术和双荧光素酶报告基因技术筛选及验证miR-142-3p作用靶基因;蛋白质免疫印迹技术验证靶基因及其介导的PI3K-AKT-mTOR信号通路蛋白表达量及通路活性;应用实时荧光定量PCR验证靶基因PTEN对miR-142-3p调节关系。结果表明,miR-142-3p靶向调节AKT和PTEN表达;miR-142-3p过表达组中PI3K-AKT-mTOR通路活性显著降低;miR-142-3p抑制组中PI3K-AKT-mTOR通路活性显著上升;抑制PTEN表达显著提高miR-142-3p表达量。因此miR-142-3p靶向调节AKT和PTEN表达继而抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路活性,PTEN与miR-142-3p存在调节关系。     

miR-192在尼罗罗非鱼应答碱度胁迫中的表达及靶基因

采用实时荧光定量、生物信息学、双荧光素酶报告和体内miRNA抑制的方法,探究miR-192在尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）应答碳酸盐碱度胁迫中的作用。结果如下：（1）实时荧光定量PCR实验表明,在急性碱度胁迫（6 g/L NaHCO₃）尼罗罗非鱼6 h后,鳃组织中miR-192的表达显著下调,溶质转运蛋白基因（solute carriers16A7,SLC16A7）表达显著上调（P<0.05）;（2）借助生物信息分析预测到SLC16A7可能是miR-192的靶基因;（3）利用双荧光素酶报告实验发现miR-192会与SLC16A7的3''UTR结合;（4）体内对miR-192抑制后,SLC16A7的表达显著上调（P<0.05）。证实了miR-192参与了尼罗罗非鱼应答碱度胁迫中的调控过程,SLC16A7是miR-192的直接靶基因,为探明miRNAs调控尼罗罗非鱼应答碱度胁迫的分子机制提供了一定的依据。