贵州烟田马铃薯Y病毒优势株系全序列克隆及系统进化分析

为了解马铃薯Y病毒在贵州烟田的发生和流行规律,对2013—2015年采集到的贵州省多个烟区呈现典型茎脉坏死症状的疑似受马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)侵染的烟草样品进行单斑分离和病毒鉴定,并以现有PVY序列信息为参考,设计了4对PVY特异引物,经过RT-PCR扩增、T载体连接、序列测定以及序列拼接,并利用MEGA软件进行系统进化分析。结果发现PVY福泉分离物(PVY Fuquan isolate,PVY-FQ)和PVY大方分离物(PVY Dafang isolate,PVY-DF)为优势株系并获得了PVY-FQ和PVY-DF的全基因组序列。PVY FQ整条基因组由9 699个碱基组成,编码多聚蛋白的开放阅读框位于第188~9 373nt;PVY DF整条基因组由9 706个碱基组成,编码多聚蛋白的开放阅读框位于第190~9 375nt。2条序列的基本特征与已报道PVY基因组一致。对PVY-FQ和PVY-DF全序列与已报道PVY序列进行系统进化分析发现,PVY-FQ与PVY NTN株系具有较高的亲缘关系,而PVY-DF与PVYN具有较高亲缘关系。     

Tomato mottle mosaic virus: Characterization,resistance gene effectiveness,and quintuplex RT-PCR detection system

Tomato mottle mosaic virus(ToMMV), an economically important species of the genus Tobamovirus, causes significant loss in yield and quality of tomato fruits. Here, we identified the Shandong isolate of ToMMV(ToMMV-SD) collected from symptomatic tomato fruits in Weifang, Shandong Province of China. ToMMV-SD caused symptoms such as severe mosaic, mottling, and necrosis of tomato leaves, yellow spot and necrotic lesions on tomato fruits. The obtained full genome of ToMMV-SD was 6 399 nucleotides(ac...     

Quantitative analysis of the interaction of heterologous viruses with Plum pox virus in C5 HoneySweet transgenic plums

Stone fruits are an important crop in most parts of the world and are heavily challenged by several viruses including Plum pox virus(PPV), Prune dwarf virus(PDV), Prunus necrotic ringspot virus(PNRSV), and Apple chlorotic leaf spot virus(ACLSV). We validated the PPV resistance in C5 plum plants(commercially known as Honey Sweet) grown in the Czech Republic for more than 16 years in a field trial experiment under natural environmental conditions. We quantified single(PPV-Rec) and mixed viruses(PPV-Rec+ACLSV, PPV-Rec+PDV and PPV-Rec+ACLSV+PDV) in C5 transgenic plums inoculated for the period 2016 to 2018. The accumulation of PPV-Rec was high(～5.43 E+05 copies) compared with that of ACLSV(～8.70 E+04 copies) in the inoculated graft of C5 transgenic plants. Leaves close to the inoculum sources showed a differential level of virus titre in single and mixed infections(～10 to ～5×10~2 copies). C5 plants with permanent virus pressure showed 10~3-to 10~5-fold fewer copies of viruses than those of the inoculated graft. We observed high accumulation of conserved mi RNAs such as mi R167, mi R69 and mi R396 in C5 plants co-infected with PPV, ACLSV and PDV that are associated with its resistance against viruses. Overall, i) C5 transgenic plums showed high resistance to PPV infection, and a low level(～32 copies) of PPV only accumulated in some grafted plants, ii) high accumulation of PPV was found in inoculated grafts in single PPV infection and mixed infections, iii) heterologous virus infection sustained by ACLSV or PDV did not suppress PPV resistance, and iv) high and low conserved micro RNAs accumulated in C5 plants.     

采用多基因联合方法鉴定福建长乐和福清产区马铃薯Y病毒株系组成

【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯生产上危害较为严重的病毒,也是制约马铃薯可持续发展的主要病毒之一。论文旨在开发一套简便、准确、快速的PVY分子鉴定技术,并采用该技术及时查明福建省部分产区PVY病害的发生、分布及PVY株系组成。【方法】采用ELISA方法对采自福建省长乐市、福清市马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行检测,并根据文献报道的PVY P1、VPg和CP基因保守区设计3对简并引物,对ELISA检测后的阳性样品进行基因扩增、克隆,并将获得的序列进行核苷酸序列一致性、重组位点、基因型分布和系统发育分析。【结果】ELISA检测结果表明,17份样品中有13个样品与PVY抗体呈阳性反应,其他呈阴性反应。13个阳性样品均能成功扩增出3个与P1、VPg和CP基因预期大小一致的特异片段。BLAST比对分析显示P1、VPg和CP基因与文献报道的已知PVY分离物的核苷酸序列一致性分别为72%—99%、85%—99%和88%—99%。P1、VPg和CP 3个基因联合序列分析显示,FQ01分离物与PVY~(N-Wi)株系的核苷酸序列一致性最高,FQ08分离物与PVYE株系的核苷酸序列一致性最高,CL01、CL02、CL05和CL13 4个分离物与PVY~(NTN-NW)株系SYR-I型的核苷酸序列一致性最高,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12 7个分离物与PVY~(NTN-NW)株系SYR-II型的核苷酸序列一致性最高。重组分析显示,除CP基因外,长乐市和福清市两个产区的PVY分离物的P1和VPg基因中均检测到显著的重组信号。基因型统计分析结果显示,长乐产区的P1基因为N型(60%)和N×O重组型(40%),VPg基因均为N×O重组型,而CP基因均为O型,而福清产区的P1基因为N型(25%)和N×O重组型(75%),VPg基因为N×O重组型(87.5%)和O型(12.5%),而CP基因除了一个分离物为N型外,其他均为O型。系统发育分析显示分离物FQ01与PVYN-Wi株系聚为一簇,FQ08与PVYE株系聚为一簇,CL01、CL02、CL05和CL13与PVY~(NTN-NW)株系SYR-I型聚为一簇,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12与PVY~(NTN-NW)株系SYR-II型聚为一簇,表明在系统发育关系上,分离物FQ01与PVYN-Wi株系最近,FQ08与PVYE株系最近,CL01、CL02、CL05和CL13与PVY~(NTN-NW)株系SYR-I型最近,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12与PVY~(NTN-NW)株系SYR-II型最近。【结论】PVY在福建省长乐市、福清市马铃薯种植区普遍存在,重组株系已成为田间的主流株系,且PVY~(NTN-NW)已成为优势重组株系。     

加工番茄上CMV与BBWV的ELISA检测及相关性分析

[目的]探讨加工番茄上2种病毒的侵染方式及其积累量的相关性。[方法]以黄瓜花叶病毒（CMV）和蚕豆萎蔫病毒（BBWV）为研究对象,用针对CMV和BBWV的单克隆抗体对田间表现病毒病症状的115个加工番茄自然病株进行间接ELISA检测,通过复合侵染病株上2种病毒的积累量分析两者之间的相关性。[结果]CMV和BBWV在加工番茄上的侵染率分别为73．0％和59．1％,并且2种病毒常复合侵染,复合侵染率达53．9％。BBWV单独侵染率很低,其侵染方式主要是与CMV复合侵染。CMV和BBWV在病株上的带毒量分析结果表明,2种病毒在病株上的积累是相互影响的,为正相关关系。[结论]该研究为病毒互作机制研究提供了理论基础。     

PVYNTN-NW榆林分离物的全基因组序列测定与分析

【目的】马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）是马铃薯病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）代表成员,是马铃薯和烟草生产中分布最为广泛并造成严重经济损失的病毒之一。研究旨在揭示PVY榆林分离物ShX14的全基因组特征,并准确判断其株系分子类型。【方法】根据已经报道的PVY不同基因保守区设计11对简并引物,采用片段重叠法从感染 PVY的马铃薯病叶中扩增、克隆获得榆林分离物ShX14的全长序列,并对其序列特征、重组位点、系统发育关系等进行分析。同时,应用系统发育与性状关联分析（phylogeny-trait association analysis）评估PVY分离物与株系的关联性。【结果】测序获得的ShX14分离物核苷酸序列全长为9 724 nt（不含3′端的多聚腺苷酸尾）。该病毒基因组含有一个9 186 nt的开放阅读框,编码3 061个氨基酸的多聚蛋白（polyprotein）。在P3顺反子中+2相位上也发现由移码（reading frame shift）产生的PIPO蛋白。全基因组序列比较分析显示,ShX14分离物与HN2、SYR-NB-16分离物（PVY^NTN-NW株系SYR-I型）的核苷酸、氨基酸序列的一致性分别为98%-99%和98%-100%。该分离物的P1、HC-Pro/P3和CP基因的5′端均检测到显著的重组信号,重组位点分别位于2 318、5 674 和8 385 nt,与PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）的重组位点相似。系统发育分析结果显示该分离物与HN2、SYR-NB-16分离物相聚成簇,表明其在系统发育关系上,与PVY^NTN-NW株系（SYR-I 型）的亲缘关系最近。系统发育分析与性状关联分析结果显示该分离物与PVY^NTN-NW株系（SYR-I 型）的关联系数（association index, AI）、简约分值（parsimony score, PS）和最大单系分支（maximum monophyletic clade, MC）3个统计检验均显著,表明其与PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）存在显著的关联性。同时,应用多重RT-PCR成功扩增出约为1 000、600和400 bp的3个特异性片段,与PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）的特异条带大小相一致。这些结果也进一步确定该分离物属于 PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）。【结论】ShX14 分离物为N×O重组分离物,属于PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）,为后续深入开展该分离物的生物学等研究奠定了基础。     

A novel strategy to enhance resistance to Cucumber mosaic virus in tomato by grafting to transgenic rootstocks

Cucumber mosaic virus(CMV) can infect a wide range of host species. For the lacking of CMV resistant varieties of tomato, RNA interference(RNAi) can be used as a fast and effective method for the generation of transgenic resistant varieties. In this current study, five intron-spliced hairpin RNA(ihp RNA) plant expression vectors aimed at five genes of CMV have been constructed. Transgenic tomatoes were obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation with expression vectors. Highly resistant generations of transgenic plants were employed as rootstocks and grafted onto non-transgenic tomatoes that resulted in the successful transfer of resistance to the scions. Using a novel method of plant cuttings for rootstock propagation, we obtained large quantities of disease-resistant material. Further, this method produces scions that can remain undetectable for transgenic resistance marker genes that may provide novel approaches to evade collective concerns about genetically-modified organism(GMO) biosafety.     

过表达酵母PAC1增强转基因大豆对大豆花叶病毒的抗性

【目的】大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的dsRNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,为抗SMV转基因大豆新品种选育提供依据。【方法】采用酶切连接技术,将PAC1连接到双元表达载体pCAMBIA3300中,构建植物表达载体pCAMBIA3300-PAC1。目的基因启动子为组成型强启动子CaMV 35S,终止子为NOS,筛选标记为草铵膦抗性基因BAR。采用农杆菌介导转化法,将PAC1导入栽培大豆品种Williams82。在利用PAT/BAR试纸、PCR及除草剂（500 mg·L^-1 Basta）喷施检测基础上,通过Southern杂交技术进一步分析外源基因在转基因大豆中的整合情况和拷贝数。采用人工摩擦接种法,对T₂和T₃代转基因大豆株系进行田间抗SMV鉴定农艺性状调查,分析转基因大豆对SMV抗性及遗传稳定性。并利用qRT-PCR技术分析接种SMV 28 d后转基因大豆中SMV积累水平。【结果】共转化2 600多个外植体,获得耐草铵膦（5 mg·L^-1）大豆再生植株76株。PCR检测结果表明,其中65株能够扩增出目的条带,大豆遗传转化效率为2.48%。对T₁-T₃代转基因大豆株系喷施除草剂表明,在500 mg·L^-1 Basta处理7 d后,转基因植株表型没有明显变化,而对照（非转基因大豆）植株叶片则黄化枯死。Southern杂交结果表明,外源基因以低拷贝的方式(1-2个)整合至大豆基因组中。摩擦接种SMV SC-3鉴定表明,在接种35 d后,对照出现严重花叶、皱缩等典型SMV发病症状,而转基因大豆仅部分叶片表现出轻微的花叶症状,其病情指数降低至11.11-22.22,较对照（病情指数36.81-46.24）显著降低,且SMV抗性在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。qRT-PCR分析表明,在接种SMV SC-3株系28 d后,转基因大豆中SMV CP表达水平较对照极显著下降。农艺性状调查表明,在未接种SMV条件下,转基因大豆在叶形、花色、种皮色、种脐色、株高、节数、结荚高度、生育期及百粒重等方面与对照没有显著差异。【结论】PAC1过表达显著抑制了SMV的积累及症状发展,增强了转基因大豆对SMV的抗性水平。     

密度与氮素互作对带状套作玉米产量的影响

为探究增密后对带状套作玉米产量的调控效应,分别设置种植模式、密度、施氮量三因素裂区田间试验,主因素为种植模式：带状套作玉米(A₁)和单作玉米(A₂),副因素为种植密度：60 000(B₁)和75 000株/hm²(B₂),副副因素为施氮水平：0(C₁)、225(C₂)、300(C₃)、375 kg/hm²(C₄),连续2年的短期定位大田试验,测定并分析各生育时期2种种植模式下玉米的产量、干物质积累、叶面积指数及叶绿素含量。结果表明,随着密度从60 000增至75 000株/hm²,单作和带状套作玉米分别增产5.36%和5.87%,带状套作玉米增产幅度较单作玉米高8.69%;在2种密度条件下,带状套作玉米施氮量达到300和375 kg/hm²时,产量较不施氮处理增加15.94%和14.28%,单作玉米施氮量达到225和300 k...     

Viroid-induced phosphorylation of a host protein related to a dsRNA-dependent protein kinase

Viroids are very small, unencapsidated RNAs that replicate and induce severe disease in plants without encoding for any proteins. The mechanisms by which the viroid RNA regulates these events and interacts with host factors are unknown. An Mr 68,000 host-encoded protein has been identified that is differentially phosphorylated in extracts from viroid-infected and mock-inoculated tissues. This phosphoprotein is immunologically related to a double-stranded (ds) RNA-dependent protein kinase from virus-infected, interferon-treated human cells. Further, nucleotide photoaffinity labeling indicates that the protein has an ATP binding site. This protein is similar to dsRNA-dependent protein kinases implicated in mammalian systems in the regulation of protein synthesis and virus replication.     

中草药提取物防治番茄花叶病试验初报

以对人和动物病毒病具有明显疗效的３４种中草药对由番茄花叶病毒（ＴｏＭＶ）引起的番茄病毒病进行室内防治试验,初步筛选出大黄、蒲公英、贯众、板蓝板、黄芩,重楼、紫金牛、射干８种有防治效果的中草药,这些中草药提取物不仅能使番茄植株体内的病毒浓度降低,而且还能推迟发病,降低植株的病情指数。同时,体外钝化试验表明,这８种中草药提取物对ＴｏＭＶ具有不同程度的钝化作用。     

适于烟草脆裂病毒诱导的本氏烟基因沉默分析的对照载体构建(英文)

对烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)诱导的基因沉默分析体系中目前最常用的对照载体——空pYL156载体(pYL156∷00)对沉默处理后番茄和本氏烟(Nicotiana benthamiana)植株的病毒症状和生长影响进行分析.结果表明:pYL156∷00沉默处理后的番茄和本氏烟植株均表现出严重的系统性病毒症状,生长受到显著抑制,因此,pYL156∷00并不是一个用于TRV诱导的番茄和本氏烟基因沉默分析的好的对照载体;为获得更好的对照载体,试验构建了2个新的对照载体pYL156∷NIRi和pYL156∷eGFP,它们分别通过在pYL156∷00载体多克隆位点插入253bp菜豆亚硝酸还原酶基因内含子序列和400bp eGFP基因片段而获得,对这2个对照载体对沉默处理后本氏烟植株的病毒症状和生长情况的影响与pYL156∷00进行比较分析.结果表明:pYL156∷00沉默处理后的植株表现出较严重的系统性病毒症状,生长受到显著抑制,其中26.7%植株死亡;pYL156∷NIRi沉默处理后的植株也表现出明显的病毒症状以及生长受抑制现象,但与pYL156∷00相比,所受影响较小,只有13.3%植株死亡;而pYL156∷eGFP沉默处理后的植株不表现明显的病毒症状,植株生长也不受显著影响;病毒积累量检测结果显示,3个对照载体沉默处理的植株病毒症状和生长受抑制情况与植株体内TRV病毒的积累水平密切相关.这些结果表明,新构建的pYL156∷eGFP可以作为一个优越的对照载体应用于TRV诱导的基因沉默分析.     

NaCl胁迫对嫁接番茄生长和光合特性的影响

在NaC l胁迫下,对番茄嫁接苗和自根苗的生长和光合特性进行了比较。结果表明:NaC l胁迫能显著抑制自根苗和嫁接苗的生长,但嫁接苗受抑程度较轻;自根苗在NaC l胁迫前期(2 d和5 d),气孔因素是限制光合作用的主要因子,瞬间光合水分利用率显著提高,在胁迫后期(10 d),非气孔限制成为主导因子,瞬间光合水分利用率显著下降;嫁接苗在胁迫前期,光合作用受抑不明显,胁迫后期,气孔因素成为限制光合作用的因子,且整个胁迫期WUE变化不明显,表明嫁接苗有较强的耐盐性。     

Cucumber mosaic virus associated RNA 5: causal agent for tomato necrosis

A small replicating RNA, encapsidated with and dependent on, but not part of the viral genome, modifies disease expression depending on the host. In tomato plants, it causes a lethal necrotic disease which is probably the same as that which, in 1972, destroyed most of the field tomato crop in large regions of the French Alsace.     

嫁接番茄不同生育期抗病性及其与根际环境的关系

本试验对嫁接后番茄的根系特征、根际土壤微生物和抗病性进行了初步的研究。结果表明:嫁接番茄发病率和病情指数明显低于自根苗;嫁接番茄的根系活力、根系吸收面积与活跃吸收面积、根际土壤微生物数量与放线菌比例均显著大于自根苗,呼吸强度前期比自根苗低,后期较自根苗高。这表明嫁接番茄根系活力的增加,根系吸收面积增大,根际土壤细菌、放线菌比例增加是其抗病性增强的重要原因。     

不同年限设施菜地番茄细胞壁果胶Cd累积的研究

为探讨不同种植年限和设施菜地番茄细胞壁果胶Cd累积的关系,以种植年限为2年和14年设施菜地番茄为研究对象,测定了不同种植年限下番茄茎、叶细胞壁果胶含量,并对细胞壁果胶含量、果胶甲酯酶(PME)活性与种植年限及Cd累积量之间的相关性进行了分析。结果表明,随着种植年限的增加,番茄植株各器官Cd累积量均有所增加;种植14年设施菜地番茄茎中Cd累积量比种植2年的增加了24.55%,叶片中Cd累积量增加了45.96%;种植14年设施菜地番茄茎细胞壁Cd累积量增加了61.86%,叶片细胞壁Cd累积量增加了57.46%;不同种植年限设施菜地番茄茎和叶细胞壁果胶Cd含量也存在极显著差异(P0.05)。另外,随着种植年限的增加,番茄茎、叶细胞壁果胶含量和PME活性随之升高:与种植2年相比,种植14年设施菜地番茄茎中果胶含量提高了104.51%,叶片果胶含量提高了127.45%;种植14年设施菜地番茄茎中PME活性提高了10.56%,叶片PME活性提高了9.39%。果胶含量及PME活性和细胞壁Cd累积量呈正相关。研究发现不同年限设施菜地土壤全Cd和有效Cd含量有所不同,影响着番茄不同器官果胶含量及PME活性,说明细胞壁果胶在缓解番茄Cd毒害中起着一定的作用。     

3种棕榈科植物挥发物成分分析

[目的]探究3种棕榈科(Palmae)植物挥发物(VOCs)组分.[方法]采用活体植物动态顶空采集法收集长叶刺葵(Phoenix canariensis Chabaud)、丝葵[Washingtonia filifera(Lind.)H.Wendl.]和软叶刺葵(Phoenix hanceana OBrien)3种棕榈科植物VOCs,利用气相色谱-质谱联用法分析了这3种植物VOCs的主要成分.[结果]3种棕榈科植物挥发物组分有萜烯类、醇类、烷烃、酯类、酚类、醌类和醛类,且萜烯类和醇类等为主要成分.[结论]3种植物皆含有诱集椰心叶甲的关键化合物,该研究结果为棕榈科植物虫害的综合防治提供了理论依据.     

促生细菌挥发性有机物调控根部质膜H+-ATPase 活性提高植物耐碱胁迫能力

根际促生细菌的挥发性有机化合物（VOCs）可以促进植物生长并提高植物对盐、旱和病菌的抵抗力。分析了芽孢杆菌PDR1产生的VOCs对拟南芥耐碱胁迫能力的影响及其生理机制。在芽孢杆菌PDR1存在或不存在的条件下,对拟南芥进行培养;检测对照和碱胁迫条件下拟南芥根部的各种离子含量;用pH指示剂（溴甲酚紫）和pH计检测拟南芥的根际酸化能力;检测拟南芥根部质膜H⁺-ATPase活性。结果显示,芽孢杆菌PDR1的VOCs改善了同一空间中碱胁迫下拟南芥的根长和根部离子平衡;来自芽孢杆菌PDR1的VOCs增强了拟南芥根中质膜H⁺-ATPase的活性,并提高了拟南芥植物的根际酸化能力。研究结果将促进对芽孢杆菌调节拟南芥生长和抗逆性机制的理解,并为其在农业生产和生态保护中的广泛应用奠定基础。