一个用于体外鉴定野油菜黄单胞菌Ⅲ型效应物的报告质粒的构建

许多革兰氏阴性植物病原细菌通过Ⅲ型分泌系统(T3SS),将效应物蛋白分泌并转运进入植物体内,从而引起植物发病或过敏反应.效应物是病原细菌和植物分子互作的关键物质.全基因组筛选鉴定Ⅲ型效应物蛋白并研究其功能,对于解明病原菌的致病机理、寄主范围和进化具有重要意义.利用avrBs1作为报告基因,将其过敏反应诱导结构域(AvrBs159-444)克隆到不含启动子的穿梭质粒pLAFR6上,构建一个用于Ⅲ型效应物转运体外鉴定的报告质粒pLJB,并以已经鉴定为效应物基因的XC-1553的启动子验证该报告质粒,证明pLJB工作正常.该报告质粒为进一步进行全基因组筛选鉴定野油菜黄单胞菌Ⅲ型效应物提供材料.     

一个新的体外快速鉴定十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物的报告质粒的构建

植物病原菌侵染寄主的过程就是病原菌和寄主植物相互作用的过程。在这个相互作用过程中,Ⅲ型分泌系统和Ⅲ效应物与病原菌致病密切相关。大部分革兰氏阴性植物病原菌通过Ⅲ型分泌系统定向的把效应物蛋白传递到宿主细胞,效应物蛋白进入植物体引起致病或过敏反应。本研究将百日咳杆菌的腺苷酸环化酶基因连接至含启动子的pLAFRJ载体上,从而构建出一个新的体外快速鉴定Ⅲ型效应物的报告质粒pJ-JA,并用已鉴定为Ⅲ型效应物基因的十字花科黑腐病菌XC1553的启动子和信号区验证该报告质粒,证明这个系统是可以工作的。该报告质粒为进一步精确筛选鉴定十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物提供了材料。     

含有增强型绿色荧光蛋白报告子的载体系统的构建

将增强型绿色荧光蛋白基因编码序列克隆到不含启动子的载体pLAFR6上,构建报告质粒pLZY。将野油菜黄单胞菌的已知效应物基因xopXccN启动子和分泌转运信号区序列克隆到pLZY,重组质粒导入野油菜黄单胞菌,阳性克隆细胞在荧光显微镜下呈现绿色荧光。阳性克隆接种萝卜叶片,在共聚焦激光扫描显微镜下检测观察到在植物细胞内发荧光,而含有pLZY的野油菜黄单胞菌对照菌株菌体和植物细胞内都检测不到绿色荧光,证明报告质粒pLZY工作正常。该报告质粒为研究目的基因在不同宿主中的表达和研究植物病原细菌Ⅲ型效应物蛋白的植物亚细胞定位提供了材料。     

一个可用于鉴定野油菜黄单胞菌正向调控hrpX基因的报告质粒的构建

过敏性反应与致病性基因(hrp)所编码的Ⅲ型分泌系统(T3SS)是植物病原细菌的决定性致病因子。在黄单胞菌属中,HrpG是目前已知的hrp基因表达的最高层面的调节蛋白,至今尚未鉴定到野油菜黄单胞菌调控hrpG表达的基因。本研究利用hrpX启动子和蔗糖敏感型sacB基因构建了hrpX表达报告质粒。实验结果表明该报告质粒可用于筛选鉴定正向调控野油菜黄单胞菌hrpX表达的基因。该报告质粒的构建,为研究hrp基因表达调控机制,揭示植物病原细菌的致病机制提供了有效的材料。     

PchsA驱动的烟草orf25基因表达载体构建及遗传转化

为研究orf25基因的功能及其与烟草雄性不育性的相关性,通过PCR方法从质粒p UC57-Pchs A中扩增了花特异性启动子Pchs A,并以其取代植物表达载体p BI121中的组成型启动子Ca MV35S,然后将orf25基因插入到Pchs A启动子下游,构建由Pchs A启动子驱动的orf25基因表达载体,测序结果显示植物表达载体p BI121-Pchs A-orf25构建成功。将该表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,采用根癌农杆菌介导法遗传转化雄性不育烟草MS革新3号,共获得76株转基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株为18株,转化率为23.7%。研究结果证明目的基因orf25已整合到烟草基因组中,为进一步探究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌B11基因文库的构建及与拮抗物质的生物合成相关基因的克隆

枯草芽孢杆菌菌株B 11对广泛的植物病原真菌和细菌都具有拮抗作用。以柯斯质粒pW EB∷TNC为载体构建了枯草芽孢杆菌菌株B 11的基因文库,文库含9 000个克隆。文库克隆中插入的DNA片段平均为42.1 kb,该文库含有菌株B 11基因组中任一基因的概率为99.99%。采用平板活性检测法筛选文库,筛选到1个对茄青枯假单胞菌菌株P 13具有拮抗活性的文库克隆GXN 9527,该克隆的重组质粒pGXN 9527含有50 kb的菌株B 11的DNA。文库克隆对革兰氏阴性植物病原细菌如水稻黄单胞菌水稻变种也具有拮抗活性,而对革兰氏阳性细菌如地衣芽孢杆菌和植物病原真菌如尖孢镰刀菌西瓜专化型、立枯丝核菌、水稻稻灰梨孢菌则没有拮抗活性。分别含有pGXN 9527的18、12、9、8 kb B amHⅠ片段的亚克隆对P 13均没有拮抗活性,说明编码该拮抗物质的生物合成基因很可能成簇存在。     

一个玉米Pht1家族磷转运蛋白基因克隆和功能分析

从耐低磷玉米自交系178中分离和鉴定高亲和力磷转运蛋白质基因,为开展磷高效分子育种奠定理论基础。本研究以水稻和拟南芥中鉴定的磷转运蛋白基因为基础,运用生物信息学方法,对玉米进行全基因组预测及系统进化分析;并运用克隆、实时荧光定量PCR和亚细胞定位方法对其家族成员进行深入研究。结果表明,从玉米自交系B73全基因组序列中筛选出37个磷转运蛋白候选基因,并被聚类为五大家族。从耐低磷材料中扩增了一个属于Pht1家族成员ZmPht1;9的全长cDNA,该基因编码区长1620bp,编码539个氨基酸,含有典型的MFS超家族蛋白的保守结构域和12个跨膜结构;荧光定量PCR分析表明,在低磷胁迫下,该基因的相对表达量显著增加,且叶片中的表达量高于根系,同时在基因型之间也存在差异;原生质体转化的亚细胞定位结果显示,ZmPht1;9表达蛋白主要分布于细胞膜上。ZmPht1;9编码位于细胞膜上的高亲和力磷转运蛋白,对调节磷素的动态平衡起重要作用。     

十字花科黑腐病菌中调控致病相关基因hpaS的XC_2486基因鉴定

十字花科黑腐病菌hpaS影响致病性、HR其编码产物分别与HpaR2、HrpG形成双组分系统。为了深入了解hapS的表达调控机制,本研究将hpaS的启动子与蔗糖敏感基因sacB融合,构建了hpaS的表达报告质粒pL6sacB3670并导入十字花科黑腐病菌野生型菌株8004中,获得了报告菌株8004/pL6sacB3670。然后利用转座子EZ：Tn5对该报告菌株进行诱变,筛选到一株转座子EZ：Tn5插入基因组的克隆。通过测序定位分析发现该克隆是由转座子EZ：Tn5插入到编号为XC_2486的ORF所产生的。然后将hpaS启动子与报告基因gusA融合的报告质粒pL6GUS3670分别导入野生型8004和XC_2486的突变体239C02中,测定比较pL6GUS3670的GUS表达水平,结果显示在突变体背景下GUS表达水平明显比在野生型背景下降低。这表明XC_2486正调控hpaS的表达。对XC_2486突变体239C02进行致病性和过敏反应检测发现,XC_2486与致病性相关,与HR无关。     

番茄EBF2基因的克隆、亚细胞定位与遗传转化

为研究番茄EBF2基因的功能,利用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增了全长EBF2基因,将其与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合表达载体,在烟草原生质体中进行瞬时表达。结果表明,该基因定位于细胞核内。将该基因定向克隆到植物表达载体pCambia1301,构建成由组成型启动子CaMV35S启动的植物表达载体pCambia1301-EBF2,通过农杆菌介导方法转化MicroTom番茄。经PCR及GUS组织染色检测,外源基因已整合到番茄基因组中。     

睾丸酮丛毛单胞菌teiR基因载体构建及在大肠杆菌中的表达

提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)基因组DNA,利用PCR扩增teiR基因,将扩增产物克隆到pKtac2(含强启动子tac)和pK18中,构建重组质粒pKtac2-teiR和pKteiR100。将重组质粒分别转化大肠杆菌(Escherichia coli)HB101, 提取细菌总蛋白,ELISA测定细菌总蛋白中teiR基因的表达量,结果表明: 含tac强启动子的pKtac2-teiR重组质粒具有更高的转录活性;将p6(含3a-HSD/CR基因)分别和重组质粒(pKtac2-teiR和pKteiR100)共转化大肠杆菌(Escherichia coli)HB101, 测定细菌总蛋白中3a-HSD/CR 和teiR基因的表达量,结果表明: 在大肠杆菌中teiR可以明显促进3a-HSD/CR 的表达, pKtac2-teiR与p6共转化后teiR基因的表达量比pKteiR100与p6共转化后teiR基因的表达量高,但是pKtac2-teiR与p6共转化后的3a-HSD/CR的表达量低于pKteiR100与p6共转化后的3a-HSD/CR的表达量。     

含禽源启动子的禽流感病毒核蛋白表达载体的构建及其免疫原性的检测

为了研究禽流感病毒核蛋白（nucleoprotein,NP）在鸡体内所引起的免疫反应,将其NP基因从重组质粒pVAX-NP上酶切后亚克隆至含禽源启动子的真核表达载体pCAGGS中,经筛选鉴定后获得重组子pCAGGS-NP,将鉴定正确的阳性重组子体外转染真核细胞,利用间接免疫荧光法检测目的基因的瞬时表达;采用腿部肌肉注射途径将重组子免疫SPF鸡,利用ELISA检测免疫后血清抗NP蛋白抗体效价。结果表明,该重组子无论在体外还是体内均能正确表达禽流感NP蛋白,且所表达的蛋白均具有良好的免疫原性。     

基于生物化学和基因组学方法的Bacillus velezensis19573-3生防潜力评价

  【目的】  筛选具有防病促生功能的芽孢杆菌优良菌株,为植物病原菌生物防治提供生态绿色、环境友好的菌种资源。  【方法】  采用菌丝生长速率抑制法和离体叶片防效筛选拮抗多种病原菌的高效菌株,通过HPLC法检测抑菌活性物质,借助基础生物学及UPLC-MS法,测定其产生植物激素等代谢物能力水平,并初步解析其促生防病相关特性。通过Biolog系统鉴定、多序列系统进化和全基因组序列分析,明确菌株19573-3的分类地位,并对其可能产生的相关次级代谢产物基因簇进行注释分析。  【结果】  菌株19573-3对于灰霉菌、腐霉菌、疫霉菌、镰刀菌等多种病原真菌具有良好的拮抗能力,具有广谱抑菌活性,且该菌株对番茄灰霉病有显著的防效,经HPLC检测发现该菌株能够产生抑菌活性物质丰原素 (fengycin)。此外,该菌株兼具产生纤维素酶、蛋白酶和铁载体的能力,还可产生水杨酸、细胞分裂素和生长激素等与植物促生密切相关的物质。通过生理生化指标、16S rRNA与gyrA基因序列系统进化分析以及基于基因组水平的ANI分析鉴定,菌株19573-3属于贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillus velezensis)。B. velezensis 19573-3基因组全长3990203 bp,G+C含量为46.56%,共编码基因4164个,编码区总长度占全基因组的比例90.03%,染色体上存在86个tRNA,27个rRNA和8个sRNA。利用antiSMASH预测菌株B. velezensis 19573-3基因组中可能存在合成丰原素 (fengycin)、表面活性素 (surfactin)、铁载体 (bacillibactin) 等与拮抗和促生相关的13个次级代谢产物合成基因簇。  【结论】  细菌19573-3属于Bacillus velezensis,对引起植物病害的灰霉菌、腐霉菌和疫霉菌等多种病原真菌均具有良好的拮抗能力,菌株代谢物显示了根际促生和生物防治功能。19573-3菌株由一个环状染色体构成,不含质粒,基因组全长3990203 bp,G+C含量为46.56%。在B. velezensis 19573-3基因组序列之中,注释到了一个长度为37669 bp的基因簇,包含fenA、fenB、fenC、fenD、fenE、fenF等基因,负责产生丰原素 (Fengycin),注释到了合成铁载体 (bacillibactin) 的基因簇以及与生长激素合成相关的基因ysnS和yhcX,从基因角度证实了B. velezensis 19573-3具备产生激素的能力。     

PCV2衣壳蛋白羧基端基因在T4噬菌体表面的展示

用PCR扩增猪圆环病毒II型广东分离株的衣壳蛋白羧基端基因,将PCR产物连接到重组型质粒pR上,转化DH5α细胞并筛选阳性克隆;重组质粒经PCR鉴定并测序后,转化E2菌,将重组E2菌与缺陷型噬菌体T4-Z1同源重组后,得到重组噬菌体,SDS-PAGE和Westernbloting分析,表明衣壳蛋白基因在噬菌体表面正确展示,表达的融合蛋白的分子量约为25Ku。     

利用拟南芥rd29A启动子驱动AtNHX1基因提高烟草耐盐性

拟南芥液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(AtNHXl)在植物耐盐机制中有重要作用.为了鉴定AtNHX1基因功能和创制耐盐烟草新种质,本研究用农杆菌介导法将rd29A启动子驱动的AtNHX1基因导入烟草(Nicotiana tabacum L.),获得72株卡那霉素抗性再生植株,17株在MS+85.5 mmol/L NaC1培养基上生长良好.对其进行PCR、Southern杂交和Northern杂交检测,证实AtNHX1基因已整合到烟草基因组中,并进行正常转录,且其转录受盐逆境的诱导.在含盐(85.5、171、256和342 mmol/L NaCl)培养基上进行对照植株和转基因植株生长及叶片丙二醛含量的分析,结果显示,转基因株系的生长势和根发生能力明显优于对照,且叶片丙二醛含量显著低于对照,表明rd29A启动子驱动AtNHX1基因的导入和表达可显著提高转基因烟草植株的耐盐性.结果提示rd29A启动子驱动的AtNHX1基因表达单元可在异源植物中正常转录和表达,可用于植物耐盐基因工程育种.     

埃及伊蚊TMOF同源基因表达载体构建及烟草转化

胰蛋白酶调节抑制因子（Trypsin-modulating oostatic factor, TMOF）可以有效地抑制昆虫中肠胰蛋白酶的活性。本文为了研究埃及伊蚊TMOF同源物基因在转基因植物广谱抗虫中的作用,利用人工合成的Aea-TMOF同源物基因,以改造过的pCAMBIA1301质粒为基本载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动Aea-TMOF基因的植物表达载体pCAMBIA1301+ Aea-TMOF。然后,采用冻融法转入农杆菌LBA4404菌株,通过叶盘法对烟草进行了遗传转化。经PCR和GUS染色检测,Aea-TMOF同源物基因已整合到烟草基因组中。     

高粱淀粉合成酶新基因SSV的鉴定与特征分析

淀粉合成酶(SS)是植物淀粉生物合成过程中的关键酶之一,目前已鉴定并揭示功能的淀粉合成酶有5个亚型。为利用丰富的基因组数据鉴定高粱基因组里的淀粉合成酶新亚型基因,本文利用生物信息学和分子生物学方法,首次鉴定并分离了编码高粱淀粉合成酶的新亚型基因Sb SSV,并对此基因的内含子-外显子结构、表达特性等进行了分析。结果显示,该基因的全长ORF为2 097 bp,其外显子数量、长度及内含子的位置分布等与玉米和水稻的直系同源基因基本一致,推导的蛋白具有细菌糖原合成酶和植物淀粉合成酶特有的糖基催化和糖基转移保守结构域。系统进化分析表明,Sb SSV与已知的SSIV亚型亲缘关系最近,推测本研究鉴定的Sb SSV基因编码高粱淀粉合成酶新亚型。定量PCR分析表达特性结果显示Sb SSV主要在高粱叶片中表达,其表达受光诱导,具有昼夜节律特性。研究结果可为深入揭示和完善植物淀粉合成代谢机制,以及改良植物产量和品质提供理论基础。     

根癌农杆菌Ⅵ型分泌系统关键组分ClpⅤ型ATPase基因表达及活性位点分析

细菌Ⅵ型分泌系统（type Ⅵ secretion system,T6SS）是近年发现的一种分布广泛且与细菌致病性密切相关的新型分泌系统,ClpⅤ型ATPase是不同细菌T6SS中均含有的关键保守组分,据推测可能为底物蛋白的分泌提供动力,但对其生化功能尚未进行深入鉴定。在本研究中,我们克隆了根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）C58中的ClpⅤ型ATPase基因atu4344并在大肠杆菌中表达,酶学检测证实了其ATPase活性,定点突变分析发现K232/608和E299/675突变体均丧失ATPase活性,表明Walker A模体和Walker B模体与其活性密切相关。这是首次对植物病原细菌T6SS中的ClpⅤ型ATPase进行生化鉴定和突变分析研究。     

农杆菌VirD2蛋白的定位特异性改造

农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)VirD2蛋白具有与单链T-DNA(ssT-DNA)共价结合并将其转运至植物细胞核,将外源基因高效整合进核基因组的功能;如果将该蛋白改定位于质体,则有可能利用其将外源基因携带进质体,建立质体转化新方法.本研究对VirD2蛋白的定位信号进行了改造,采用重叠延伸PCR突变技术对Vir2的N端核定位信号(NLS)编码序列进行点突变,对C端编码序列实施缺失突变,并在合成的突变VirD2(mVirD2)基因3’端连接上增强绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因,在其5’端加上或不加源自拟南芥(A rabidopsis thaliana)冷调节基因(AtCOR15A)的质体定位信号肽编码序列,分别构成pt-mVirD2-eGFP和mVirD2-eGFP嵌合基因,由CaMV 35 S启动子控制,经农杆菌介导整合进烟草(ic otiana tab ac um)核基因组.荧光检验显示,mVirD2带质体定位信号时绿色荧光集中于叶绿体,mVirD2不带质体定位信号时绿色荧光弥散在细胞质中,且两者的细胞核均无荧光,表明pt-mVirD2-eGFP嵌合基因表达的蛋白具有质体定位特性,并失去了核定位能力.该结果为今后探讨利用pt-mVirD2融合蛋白将外源DNA主动定向牵引进质体,实现质体高效转化研究提供基础资料.     

笋瓜韧皮部蛋白基因启动子的克隆及其功能初探

笋瓜韧皮部蛋白ＰＰ２是一种特的结合几个丁质的凝集素,具有韧皮部组织特异性。为了研究该基因启动子在转基因植物中的表达特性,探索其在植物基因工程中潜在的应用价值,根据发表的序列,用ＰＣＲ方法从笋 瓜基因组中扩增得到了ＰＰ２基因启动子片段。     

睾丸酮丛毛单胞菌活化因子基因的质粒载体构建及表达

提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)的基因组DNA，利用PCR扩增activator基因，将扩增产物克隆到pKtac1(含强启动子tac)中，构建重组质粒pKtac1-act1和 pKtac1-act2。经酶切分析和测序，鉴定出正确的重组质粒pKtac1-act1和 pKtac1-act2。将重组质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli)HB101中，用酶联免疫分析方法测定细菌总蛋白质中的activator表达量；将pAX1(含3α-HSD/CR基因)分别和重组质粒(pKtac1-act1和pKtac1-act2)一起转化入E. coli HB101中，测定细菌总蛋白质中的3α-HSD/CR和activator的表达量。结果表明：重组质粒能明显提高activator的表达；pAX1与重组质粒共转化的蛋白质粗提物中，activator和3α-HSD/CR的表达量都显著提高。