检测K88~+肠毒素性大肠杆菌PCR方法的建立

以K8 8菌毛结构基因保守序列为靶序列 ,设计合成了一对可扩增长 2 0 1bp的目的片段的引物 ,成功地建立了检测肠毒素性大肠杆菌(ETEC)K88菌毛基因的PCR方法。进行了PCR方法的特异性试验和敏感性试验。对K99+ ,F41 + ,987p+ 参考菌株和鼠伤寒沙门氏杆菌 ,链球菌 ,金黄色葡萄球菌和猪肺疫巴氏杆菌的检测结果均为阴性 ;该检测方法的敏感度可达 1 0个细菌。用此方法对 1 0株腹泻仔猪粪便分离物进行检测 ,结果有 2株阳性 ;与血清学检测的结果一致。结果表明此方法特异性和敏感性都很高 ,可用于临床K88+ 肠毒素性大肠杆菌病的快速诊断和流行病学调查     

产肠毒素性大肠杆菌K88与K99菌毛蛋白的串联表达

根据GenBank中发表的E.coli K88、K99基因序列,分别设计合成1对引物.利用PCR技术,以大肠杆菌C83907和C83644的质粒为模板分别扩增不含信号肽的K88及K99基因.通过分离、纯化、限制性核酸内切酶酶切,连接和转化,构建了含K88-K99串联表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pETK88CK99).结果显示,经酶切,PCR鉴定和DNA序列分析,证实了构建的重组质粒pETK88CK99中含有K88K99融合基因,且基因序列和阅读框架均正确.经过SDS-PAGE分析,串联表达蛋白含量占菌体蛋白的40%左右,经Western blotting检测,该串联表达蛋白能被大肠杆菌K88、K99标准血清识别.结果表明,构建的重组菌株可以作为预防新生仔猪大肠杆菌性腹泻基因工程疫苗的候选菌株.     

肉品中肠毒素性大肠杆菌和肠沙门菌多重PCR检测方法的建立

利用肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的LT-A、ST-1毒素基因和肠沙门菌的iroB基因设计3对引物,建立能同时检测ETEC和肠沙门菌的多重PCR方法。结果:多重PCR扩增出了预计的PCR产物,本方法的特异性为100%、灵敏度达10~10~2CFU/mL,用建立的多重PCR方法对30份临床可疑腹泻样品进行检测并与生化试验比较,结果两种方法检出大肠杆菌和沙门菌的阳性符合率达100%。     

猪源肠毒素性大肠杆菌菌毛基因多重PCR检测方法的建立

为了对猪源产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）的4种主要菌毛（K88、K99、F41和987p）进行快速检测和分型，建立了检测4种菌毛的多重PCR方法。首先设计合成4对4种菌毛特异性的引物，然后用4种菌毛参考ETEC菌株优化了多重PCR方法。该方法对K88、K99、F41和987p 4种菌毛的扩增产物分别为201，314，380和459bp。对4种扩增产物分别进行酶切鉴定，结果均得到与预期一致的2个片段。对各个参考菌株不同组合的检测结果为100％符合。结果表明，该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性，可用于ETEC性腹泻的辅助诊断及ETEC菌毛抗原分型检测。     

牛产肠毒素性大肠杆菌病的防治

<正>1发病原因和机制产肠毒素性大肠杆菌有两个毒力因子,既能吸附到肠上皮细胞黏膜表面,又能产生肠毒素,据此可以将它与非致病性大肠杆菌区分开。黏附是由一种被称之为菌毛的丝状结构蛋白介导的,这种丝状结构蛋白有时也被称为纤毛或黏附素,它能与肠上皮细胞膜上的特异性受体结合。与EPEC(肠致病性大肠杆菌)和EHEC(肠出血性大肠杆菌)能和肠上皮细胞的肠腔面紧密接触不同,菌毛介     

仔猪肠毒素性大肠杆菌病的防治

大肠杆菌病是由致病性大肠埃希氏菌的某些血清型引起的以新生和幼龄动物为主的肠道传染病病原菌。临床表现以腹泻、败血症、赤痢样症候及肠毒血症为特征。     

产肠毒素性大肠杆菌菌毛的研究进展

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)常引起仔猪腹泻,在世界范围内造成了严重的经济损失。ETEC的致病作用与其具有粘附性菌毛和肠毒素密切相关,ETEC菌株的菌毛可与宿主黏膜上皮细胞表面的相应受体结合,并在局部组织定居、繁殖和产生毒素,损伤小肠黏膜,使小肠吸收分泌功能失常而致腹泻。本文针对ETEC菌毛的生物学特性、表达条件、免疫原性等方面作一概述。     

产肠毒素性大肠杆菌疫苗研究概况

产肠毒素性大肠杆菌（简称ETEC）是引起仔猪腹泻的主要病原之一。在家畜中,尤以初生幼畜特别易感。并引起生长发育迟缓,生产能力低下,甚至造成死亡。给畜牧业造成很大损失。ETEC肠毒素基因和菌毛蛋白（黏附素）基因对于ETEC的致病性起主要作用。除了灭活疫苗、减毒疫苗、结合多糖疫苗和亚单位疫苗外,新近出现的DNA疫苗、转基因植物疫苗为疫苗的研制提供了新的思路。本文概述并评价了各类产肠毒素性大肠杆菌疫苗．并简要介绍了产肠毒素性大肠杆菌疫苗最新的进展。     

生物素标记LT基因探针检测产肠毒素性大肠杆菌

用碱变性法提取重组质粒pEWD299,经Hind Ⅲ酶切后,进行琼脂糖凝胶电泳,用电洗脱法回收LT基因850bp的核酸片段,再用二步法缺口翻译反应制备生物素标记的LT基因探针.通过菌落杂交试验表明,在严格去蛋白和RNA的条件下,该探针与试验中所有产LT和ST,或仅产LT的ETEC发生杂交反应;而与所有仅产ST的ETEC、侵袭性大肠杆菌(EIEC)、普通大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠耶尔森氏菌、霍乱弧菌均无杂交反应.其检测提纯的LT—DNA的敏感性水平为25pg,检测食品模拟标本中产LT大肠杆菌的敏感性达到130个细菌/g的水平.     

猪产肠毒素性大肠杆菌野生株K88菌毛蛋白结构基因的克隆与序列测定

根据报道的猪产肠毒素性大肠杆菌阳8茵毛结构基因DNA序列，在其保守区用Goldkey软件设计了1对引物，经PCR扩增从20株野生分离株质粒中得到17个大小在815bp左右的阳性产物，经纯化、连接、转化、筛选及核酸序列测定与分析，确认所克隆的外源基因与报道的K88菌毛(亚单位K88ab、K88ac、K88ad)蛋白结构基因序列一致，表明该菌毛蛋白结构基因的保守区间没有发生变异。     

化学诱变剂和紫外线对K88抗原工程菌及产肠毒素性大肠杆菌质粒作用的比较

某些产肠毒素性大肠杆菌可致仔猪黄痢病,危害养猪业。猪源性产肠毒素性大肠杆菌有两种致病因子,其一为肠毒素,其二为粘附因子(即纤毛抗原)。后者有K_(88)、K_(66)、987P和F_(41)四个血清型,但以K_(88)纤毛抗原产生菌居多。现已知道K_(88)基因和肠毒素基     

产肠毒素性大肠杆菌毒力相关质粒研究进展

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的许多致病因子是由质粒作编码,因此,人们对其毒力相关质粒的研究非常重视。这里就有关方面研究进展做一简要综述。 ETEC毒力相关质粒可以分为三类,即R质粒、产肠毒素质粒和粘附因子。 一、R质粒:R质粒即抗性(Resistance)质粒,包括抗药性质粒和抗某些金属的质粒。这类质粒大小不等,可以从几个Kb到几十个Kb,质粒拷贝数也不同,有的是严紧型,有的为松驰型。 多数R因子由两个部分组成,一部分为抗菌素的抗性基因,这使宿主菌产生对抗生素抗性,同时也是人工构建的基因工程载体的理想筛选标记;另一     

产肠毒素性大肠杆菌肠毒素的研究概况

本文分析了大肠杆菌耐热肠毒素 (heat-stable,ST)和不耐热肠毒素 (heat- labile,LT)生物学特性、分子水平机制及其应用价值。一方面着重讲述 LT作为粘膜免疫佐剂的研究前景 ,利用体外定点突变方法构建不同的突变株并且均具有不同程度的佐剂活性 ,是霍乱毒素 (Choleratoxin,CT)很有希望的替代品。另一方面讲述ETEC基因工程亚单位疫苗的研究概况。ETEC只有 LT、ST两类肠毒素 ,通过不同方式构建融合基因探讨对 ETEC性腹泻防治效果。目前 ,这两方面均卓有成效 ,但还有许多的难点需进一步的研究     

产肠毒素性大肠杆菌K99菌毛蛋白抗原基因的克隆与表达

应用PCR从产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）中扩增出不含信号肽序列的K99菌毛蛋白基因片段，克隆测序后，将该片段连接到E.coli表达载体pET28a( )中，转化E.coli表达菌株BL21（DE3），筛选得到可诱导表达K99抗原的工程菌株。经IPTG诱导，分离纯化K99重组蛋白，以其免疫新西兰大白兔，获得重组蛋白的兔抗血清；免疫印迹分析表明，此重组蛋白制备的抗血清能与标准的K99强毒株姓明显的抗原抗体反应。     

共表达K88/987p菌毛产肠毒素性大肠杆菌的分离鉴定及其卵黄抗体的制备

为制备针对一些大型养猪场产肠毒素性大肠杆菌(enterotrxigenic Escherichia coli,ETEC)分离株的特异性卵黄抗体(egg yolk immunoglobulin,IgY),试验对从这些养殖场分离的ETEC分离株菌毛基因类型进行了PCR鉴定,纯化该分离株的菌毛蛋白免疫蛋鸡制备IgY,对该IgY的效价、特异性和体外抑菌效果进行了检测。结果表明,该分离株具有K88和987p 两种菌毛基因,纯化后的分离株菌毛具有较强的免疫原性,经3次免疫后产生的IgY对K88和987p全菌和菌毛的效价可达到1:64 000,分离株菌毛IgY能特异地与K88和987p反应,与K99、F41无交叉反应,5 mg/mL分离株菌毛IgY在体外具有很好的抑菌效果。     

新型凝集技术快速检测产肠毒素性大肠杆菌菌毛的研究

为建立以彩色二氧化硅微球(CSN)为载体,快速检测产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)菌毛K88ab、K99、987p和F41的新型凝集技术,本研究采用反相微乳液法制备二氧化硅微球,将其与菌毛单因子血清偶联制成免疫彩色二氧化硅微球(ICSN),通过优化反应条件建立了快速检测ETEC菌毛的方法。特异性试验结果显示,ICSN只与携带其对应菌毛的菌株发生反应,与携带其它菌毛的菌株无交叉反应;敏感性试验结果显示菌液的最小检出浓度为1.0×10~6cfu/m L~5.1×10~6cfu/m L;稳定性试验显示4℃保存30 d,ICSN特异性、敏感性无明显变化;双盲样品检测准确率为100%。本研究有助于ETEC菌毛的快速检测和幼畜大肠杆菌性腹泻的诊断。