银杏果仁抗菌蛋白的分离纯化及其基因克隆和原核表达初步研究

通过40%及80%(NH4)2>SO4>分级盐析,CM Sephorose F.F.离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析;从银杏(Ginkgo biloba)种仁中分离纯化到一种表观分子量约为12 KD的抗菌蛋白.经过MALDI-TOF-MSPMF鉴定表明,该蛋白与一种新型抗菌蛋白Gnk2(ginkbilobin-2)具较高匹配率(P<0.05);根据ESI-MS/MS内肽氨基酸测序结果设计简并引物,扩增该蛋白基因一段,经比对发现与Gnk2基因序列相似性也达99%.按照Gnk2基因序列设计同源引物,利用RT-PCR克隆该抗菌蛋白全长基因,提交GeneBank(Accession No.FJ865399),并以此构建原核表达载体pGEX-GK2-1转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),SDS-PAGE和Western blot分析表明,融合蛋白在大肠杆菌中能够高效表达.     

人Irisin基因的克隆、原核表达及重组蛋白的纯化

鸢尾素(Irisin)是新发现的一种肌肉因子,其前体是Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5(fibronectin typeⅢdomain-containing protein 5,FNDCS).为实现人(Homo sapiens) Irisin的原核表达,通过反转录PCR得到人肌肉组织总RNA的cDNA,并以特异性引物扩增得到人FNDC5基因的cDNA序列.以特异性引物扩增将人Irisin基因序列引入NdeⅠ和Xho Ⅰ酶切位点,经双酶切后插入原核表达载体pET-30a中,构建重组质粒并转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3) pLysS.通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl dulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)检测,用镍柱纯化目的蛋白,并用Western blot方法鉴定.DNA序列分析结果显示,克隆的人Irisin基因序列和NCBI公布的序列一致,并成功构建了pET-30a-Irisin重组表达载体;SDS-PAGE电泳检测和Western blot结果表明,表达蛋白分子量约为14kD,与预期大小一致;实现了人Irisin的可溶性表达,得到了较高纯度的目的蛋白,为进一步研究人Irisin蛋白的结构、功能及应用提供了理论依据.     

GDA2基因的克隆、原核表达与融合蛋白的纯化

摘要：GDA2（G2 pea dark accumulated gene）是与G2豌豆（Pisum sativum L.）短日照条件下不衰老现象紧密相关的基因之一。实验用cDNA差示分析法（representational difference analysis, RDA）得到一个短日照下特异表达的G2豌豆cDNA，并命名为 GDA2。核酸序列分析表明，该cDNA全长1 120 bp，最大的开放阅读框为642 bp，编码一个由213个氨基酸构成的分子量约为24 kD的蛋白质，与GDA1的同源性为36%。在GDA2的cDNA两端分别引入Bgl Ⅱ与XhoⅠ的酶切位点，用PCR方法将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经过酶切筛选和测序鉴定，得到所需的表达载体pGEX-GDA2。将pGEX-GDA2导入E.coli BL21菌株，经IPTG诱导，得到分子量约51 kD的 GST-GDA2融合蛋白，并利用Glutathione Sepharose 4B亲和柱对该融合蛋白加以纯化。GDA2-GST融合蛋白的表达和纯化工作，为深入研究GDA2蛋白的结构与功能以及该基因同衰老的关系打下良好的基础。     

牛nanog基原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

从6周龄的胎牛(Bos taurus)原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT-PCR扩增nanog基因,将其克隆到PMD-18T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEx-KG-nanog,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛nanog基因编码序列.重组质粒转化大肠杆菌JM109(Escherichia coli),在不同的培养温度(25、30和37℃)和不同浓度的IPTG(0.10、0.25、0.50、1.00和2.00mmol/L)诱导下均获得了表达,结果表明,培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western blot检测证实该蛋白约60kD,并具有GST抗原活性,证实目的蛋白为Nanog蛋白.     

牛nanog基因原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

从6周龄的胎牛（Bos taurus）原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT-PCR扩增nanog基因,将其克隆到PMD-18T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEX-KG-nanog,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛nanDg基因编码序列。重组质粒转化大肠杆菌JM109（Escherichia coli）,在不同的培养温度（25、30和37℃）和不同浓度的IPTG（0．10、0．25、0．50、1．00和2．00mmol／L）诱导下均获得了表达,结果表明,培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western blot检测证实该蛋白约60kD,并具有GST抗原活性,证实目的蛋白为Nanog蛋白。     

小鼠抗病毒基因viperin的原核表达及其抗原性探索

Viperin是一种由Ⅰ型和Ⅱ型干扰素诱导的宿主蛋白,在进化上高度保守。本研究以小鼠脑组织为原材料,通过RT-PCR扩增得到包括完整open reading frame（ORF）的1 155 bp的viperin基因序列,成功亚克隆并构建了原核表达载体pET-32a-vip,将其转化到大肠杆菌Rosetta中进行原核表达。结果表明：原核表达的重组蛋白viperin主要以包涵体的形式表达,用镍离子亲和层析法获得纯度较高的viperin蛋白,为探讨原核表达的viperin抗原特性,将纯化的viperin蛋白免疫4周龄昆明小鼠,制备得到抗viperin多克隆抗体。经Western blot和IFA检测,该抗体能与真核细胞自然表达的viperin反应,特异性良好且效价高,表明原核表达的viperin具有良好的抗原性。获得的多克隆抗体为进一步研究viperin的抗病毒生物学功能奠定了良好的基础。     

应用自动诱导表达体系提高原核表达效率

自动诱导表达体系是依据T7表达菌株对于培养基中的碳源和能源的利用机制建立起来的,用于生产各种异源蛋白更加高效、便捷和经济。为提高重组蛋白在原核细胞中的表达效率,构建了以S基因抗原位点区作为目的基因的原核表达重组质粒pET-S1,并将其转化入大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）菌株。用IPTG诱导表达系统和自动诱导表达系统分别对目的蛋白进行表达。结果表明,目的蛋白最高表达量分别占菌体总蛋白的25.9 %和45.1 %,表明自动诱导表达系统可明显提高表达效率。     

牛Nanog 原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

本研究的目的是构建牛Nanog基因原核表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导其表达。从6周龄的胎牛原始生殖嵴中提取总RNA, 通过RT-PCR扩增Nanog 基因,将其克隆到PMD-18T载体,再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片断,定向克隆到 pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEX-KG -Nanog ,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛Nanog基因编码序列。重组质粒转化大肠杆菌JM109, 在不同的培养温度和不同浓度的IPTG诱导下均获得了高效表达,说明培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western Blotting 检测证实该蛋白约60KD, 大小合适,具有GST抗原活性,从而证实目的蛋白为Nanog 蛋白。     

杜氏盐藻磷脂酶C基因DsPLC的原核表达与纯化

为了进一步研究磷脂酶C的生理功能,利用RT-PCR技术扩增了Ds PLC的开放阅读框序列,并与质粒p GS21a连接,构建了原核表达载体p GS21a-Ds PLC。将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达出融合蛋白。经SDS-PAGE检测,融合蛋白在包涵体和上清中均存在。可溶性蛋白经His柱纯化后进行电泳分析,结果表明,在96k Da左右有单一的蛋白条带,说明融合蛋白得到有效纯化。蛋白印迹结果显示在96kDa左右有明显的杂交条带,初步证明纯化的蛋白是带有His标签的磷脂酶C。盐藻磷脂酶C的成功表达与纯化,为深入探讨磷脂酶C的性质及功能奠定了基础。     

Ⅰ群禽腺病毒33K基因的原核表达与鉴定

33K蛋白是Ⅰ群禽腺病毒（fowl adenovirus groupⅠ,FAVⅠ）的非结构蛋白,在感染的过程中起重要作用。为了构建原核表达载体pGEX-33K作为诊断抗原,本研究根据GenBank中FAVⅠ33K基因序列,设计1对特异性引物。用PCR方法扩增目的片段,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组质粒pGEX-33K。将其转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,pGEX-33K表达的分子量为36.7KD,表达产物主要以可溶性的形式存在于菌体中;最佳IPTG诱导浓度为0.75mmol/L,最佳诱导时间为4h;经Western Blot鉴定,pGEX-33K重组蛋白可与FAVⅠ阳性血清发生特异性反应,为FAVⅠ抗体ELISA鉴别诊断试剂盒的研究奠定基础。     

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）乙醛脱氢酶基因的特征分析

尖孢镰刀菌是木质纤维素生物转化乙醇极具潜力微生物菌种。对尖孢镰刀菌基因组中乙醛脱氢酶的研究有助于对其乙醇代谢途径和机理掌握。通过对尖孢镰刀菌基因组数据库的搜索,发现了23条假定乙醛脱氢酶,它们属于醛脱氢酶超家族,并根据其蛋白分子质量大小进行了系统命名。研究分析了这些蛋白的等电点、催化位点、磷酸化位点、亚细胞定位,进行了多序列比对和系统发育树构建,并获得了一条乙醛脱氢酶基因的核苷酸序列,这为尖孢镰刀菌乙醛脱氢酶基因的功能验证及乙醇代谢机理研究奠定了基础。     

胸腺素家族多肽在大肠杆菌中的表达

为提高胸腺素(又名胸腺肽,thymosin)的体外表达效率,本研究采用设计融合标签的方法对胸腺素α1和β4(Tα1,Tβ4)进行体外重组表达,通过超高效液相色谱-飞行时间质谱联用(LC/MS)法,对融合蛋白的完整分子量进行验证,利用反相超高效液相色谱法对不同表达载体的单位表达量进行测定.结果 表明,A 18-KEKE、...     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因的克隆与表达

蜘蛛丝具有极高的强度和韧度,工业和医学应用价值很高,但由于蜘蛛的不可驯养性使其应用受到限制。因此,本文尝试利用基因工程的方法获得蛛丝蛋白的表达。我们利用巢式PCR技术从大腹圆蛛Araneus ventricosus基因组中克隆了长度为837bp的拖牵丝蛋白基因（ASP）,并分别将其构建至原核表达载体pGEX-6p-1和真核表达载体pGFP-N2上,分别命名为pASG和pASN。pASG在大肠杆菌中16℃下24h诱导表达后,经蛋白质印迹证明成功地表达了GST-ASP融合蛋白;pASN转染昆虫sf9细胞48h后观察到了绿色荧光蛋白GFP的表达,表明ASP基因在大肠杆菌和真核细胞中分别得到了正确表达。本研究为利用基因工程的方法开发蛛丝蛋白的生产途径提供了有益的尝试。     

人肥胖基因在大肠杆菌中的表达及生物学活性检测

肥胖基因(ob)编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5!端的CCC转变为大肠杆菌(Escherichiacoli)常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆到原核表达载体pET5a,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.1mmol/LIPTG诱导,获得分子量约为16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的55%。重组蛋白纯化后,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

牛病毒性腹泻病毒E2结构蛋白的原核表达、纯化及鉴定

根据GenBank中已发表的牛病毒性腹泻病毒囊膜糖蛋白E2基因设计1对特异性引物,以Oregon CV24株为模板,PCR扩增目的片断后与pET-32a原核表达载体连接,转化大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物,结果表明重组E2蛋白在体外得到较好表达,表达的融合蛋白分子量为57.7 ku。可溶性分析表明重组E2蛋白以包涵体的形式存在,经镍柱His标签蛋白纯化后进行western-blot检测。结果表明：E2重组蛋白均具有反应原性,能与BVDV的阳性血清进行反应。     

重组马槟榔甜蛋白MabinlinⅡ在大肠杆菌中的表达

MabinlinⅡ是我国所特有且唯一的植物甜蛋白，在体外至今没有得到具有甜味的基因表达产物。本文根据己知马槟榔甜蛋白的序列设计引物克隆MabinlinⅡ基因，对基因进行剪切重组。将重组基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-30a（＋）中，构建了3个重组表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3），得到三株表达重组马槟榔甜蛋白的大肠杆菌工程菌。经IPTG诱导，3个重组MabinlinⅡ基因可在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达。     

细菌感染后大黄鱼脾脏组织中PcQM基因表达及PcQM在大肠杆菌中原核表达

本研究利用Real-time PCR方法,分析利用哈维氏弧菌和副溶血弧菌混合菌液攻毒12 h、24 h和48 h后,大黄鱼脾脏组织中PcQM基因表达的变化情况。结果表明,攻毒12 h后脾脏组织中大黄鱼PcQM基因表达量显著降低0.031±0.006,且差异极显著（p〈0.01）;攻毒24 h后,表达量显著增加16.240±2.822倍,且差异显著（p〈0.05）;攻毒48 h后脾脏组织中大黄鱼PcQM基因表达量显著降低0.115±0.025（p〈0.01）。初步推测,PcQM基因在大黄鱼免疫系统中起着重要的调控作用。本研究构建了PET28a（＋）/PcQM表达载体,进行体外表达。用Western-blotting分析,证实有一条约为25 kD的蛋白条带,表明PcQM蛋白体外表达成功。本研究为进一步研究PcQM蛋白免疫调节功能奠定了基础。     

杏山梨醇脱氢酶基因克隆及其在果实发育过程中的表达与酶活性分析

为研究杏山梨醇脱氢酶(SDH)的基因序列特征、在杏果实发育过程中的表达及其酶活变化,以金太阳杏为试验材料,采用同源克隆的方法克隆杏NAD+依赖的SDH编码基因的cDNA序列,命名为PaSDH,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析PaSDH在杏果实发育过程中的表达水平,检测酶活变化.序列分析结果表明,PaSDH...     

玫瑰黄链霉菌几丁质酶基因的克隆及拼接表达

应用PCR扩增克隆到玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)的几丁质酶基因chiC的整个催化域部分,将其与包含信号肽区、纤维素结合区、几丁质结合区三个结构功能域的链霉菌(S.lividans)chiC基因片段相连接,插入pET23b( )质粒上,构建表达载体pLCH,用来转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109(DE3),转化子进行破壁之后在胶体几丁质酶培养基上表现活性。