盐胁迫下双峰驼结肠组织环境适应能力研究

我国北方中西部畜牧地区的水源多为高含盐量水源,普通家畜不能适应这样的水源,从而影响了北方地区畜牧业的发展。双峰驼(Camelidae bactrianus)作为适应北方高盐水源的物种,其盐适应机制尚不清楚。本研究针对双峰驼盐适应能力,对大量进食食盐与正常条件下双峰驼的结肠组织进行转录组测序及数据分析,从转录组学角度了解大量进盐环境下骆驼结肠组织对盐环境的适应机制。结果显示,进盐组测得reads 52 882 246条,对照组测得51 533 346条;进盐组reads总比对率为86.41%,唯一比对率为84.61%;对照组总比对率为92.48%,唯一比对率为91.62%;进盐组与对照组共获得差异表达基因2 450个,其中上调表达基因1 136个,下调表达基因1 314个。基因本体(Gene Ontology, GO)分析显示,进盐组下调表达基因显著富集的term共17条,上调表达基因显著富集的term共28条。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析显示,下调表达基因显著富集到的包括剪接体、RNA转运、基础转录因子、真核生物中核糖体的生物合成、RNA降解、氧化磷酸化和蛋白输出功能通路。上述结果表明,在盐胁迫条件下,结肠组织下调表达的基因多于上调表达基因,具有统计意义的生物功能分析显示,下调表达基因多参与RNA过程和蛋白质合成通路。这些基因有利于骆驼在高盐环境下减少RNA的合成,降低结肠组织的代谢速率。本研究对区域特色畜牧品种的盐适应机制进行解析,为高含盐水源畜牧地区育种、提高区域资源利用率提供分子理论依据。     

扇贝性腺和肠组织表达序列标签的初步识别*

构建了扇贝(Placopecten magellanicus)的性腺和肠组织cDNA文库,并对96个克隆进行部分测序,获得82个表达序列标签(ESTs)序列.序列同源性搜索结果表明,72个EST序列与GenBank中的已知序列具有很高的同源性(e<10-8).其中19个序列属于rRNA基因;53个序列分别属于44个不同的基因.在44个基因中,有36个是编码已知功能的蛋白质基因,8个与未知功能的开放阅读框具同源性(假定蛋白);此外,44个基因全部是首次在扇贝中鉴定的基因;基因的功能分类显示,36个已知功能的基因分别属于基因表达与蛋白质合成、细胞结构、物质运输、代谢、细胞调节和信号传导等6大类.     

干旱胁迫下白花柽柳抑制性消减文库的构建分析

本试验构建了PEG6000渗透胁迫下白花柽柳的抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)文库。文库克隆的重组率为95 % ，插入片段大部分集中在100～1000 bp之间。通过对文库阳性克隆的随机测序，并对表达序列标签（expressed sequence tag, EST）分析得到了100个与干旱胁迫相关的EST片断，它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除、蛋白代谢、跨膜转运和离子平衡及光合作用等方面。此结果对今后进一步研究这些基因的功能奠定了基础。     

花生茎全长cDNA文库的构建与分析

为挖掘花生茎中重要的功能基因,了解花生茎生长发育的分子机理,以闽花6号为材料,利用SMART技术成功构建了花生茎不同生育时期混合的全长cDNA文库,并对文库的部分序列进行了测序及分析。结果表明,该文库原始库容为1.25×106cfu·mL-1,重组率达100%,插入片段大小为750~2 000 bp,平均插入片段大小为1 000bp,达到文库质量要求。随机挑选50个单克隆进行5'端测序,共获得50条有效序列。通过与NCBI非冗余蛋白质数据库进行比对和注释,获得已知功能基因或具推测功能的基因29个,未知功能基因9个,新基因12个,其中47个(94%)基因为花生未报道的基因。因此,该文库的构建为克隆和研究花生茎部重要表达基因,从分子水平上揭示花生茎的生长发育规律提供了基础。     

应用Solexa测序技术分析棉花不同抗病品种的数字表达谱

棉花枯萎病是一种危害严重的世界性病害,构建棉花枯萎病不同抗病品种的基因表达谱将为进一步研究棉花抗枯萎病的分子调控机制及筛选抗枯萎病相关基因奠定基础.本研究选用高抗枯萎病的陆地棉品种中棉所12和高感枯萎病的陆地棉品种新陆早7号为材料,利用Solexa高通量测序技术分析棉花幼苗根部组织中的基因表达情况.Solexa高通量测序后构建了多达350万个reads的标签文库,根据已知序列信息,显著差异表达基因1 080个,其中上调基因302个,下调基因778个.基因功能分析表明,已注释的显著差异表达基因可划分为分子功能、生物过程和细胞组件3个功能注释本体,并进一步细分为37个功能类别.鉴定出112条代谢通路,注释了1 238个显著差异表达基因,共涉及氨基酸代谢、多糖的生物合成和代谢、脂类代谢、能量代谢及信号转导等方面.在植物激素信号转导通路分析中,涉及到26个已知功能基因,4个基因编码AP2/ERF转录因子,4个基因与LRR类受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶或蛋白激酶有关,5个基因与蛋白磷酸酶2C有关,而这些基因都参与植物的抗病反应.随机抽取5个基因进行实时荧光定量PCR验证,其结果与测序结果一致.本研究初步揭示了棉花枯萎病抗感品种在转录组水平上的表达差异,获得了大量差异表达基因.     

茭白冷藏期间蛋白质表达谱的变化

为探讨茭白冷藏期间衰老的分子机理,应用蛋白质组学技术,研究了茭白冷藏期间蛋白质表达谱的变化。结果显示,双向电泳胶上共检测到大约650个蛋白点,其中35个蛋白表达量存在2.0倍以上显著(p0.05)差异,经过串联飞行时间质谱分析,成功鉴定出29个蛋白,根据其功能可分为6类,即代谢(20.7%)、细胞结构(27.6%)、抗胁迫(20.7%)、衰老(6.9%)、蛋白质合成(13.8%)和功能未知蛋白(10.3%);其中:代谢相关蛋白3个上调表达、3个下调表达,细胞结构相关蛋白6个上调表达、2个下调表达,抗胁迫相关蛋白4个上调表达、2个下调表达,衰老相关蛋白2个上调表达,蛋白质合成相关蛋白4个及功能未知蛋白3个均下调表达。这些差异表达蛋白的功能分析表明,茭白采后衰老机理可能涉及物质代谢过程的调整、能量代谢途径的改变、活性氧清除能力的减弱以及细胞结构的解体。     

松墨天牛幼虫cDNA文库的构建及EST分析

松墨天牛（Monlchamus alternatus Hope）是林业重大害虫。本研究运用SMART技术构建了松墨天牛幼虫cDNA文库,库容量为1.09×10^6,文库滴度为5.45×10^6 pfu/mL,重组率为97.8%,平均插入片段大小约为1 000 bp,构建的文库质量较好。随机选取1 022个克隆进行测序,获得了1 012条表达序列标签（ESTs）,序列在GenBank中登录号为JZ143720～JZ144731。EST序列经过聚类拼接得到411条非重复单一序列,其中216条序列有功能注释。在216条有功能注释的序列中,有181条（83.80%）参与＂分子功能＂,122条（56.48%）参与＂细胞成分＂,168条参与＂分子生物学过程＂（77.78%）。研究结果为克隆和分析松墨天牛新的功能基因奠定了基础。     

齿肋赤藓乙醛脱氢酶基因ALDH21的克隆与表达分析

本文采用RT-PCR方法,从齿肋赤藓（Syntrichia caninervis）总RNA中获得ALDH21基因cDNA序列,连接到pMD19-T载体上并转化E.coli DH5α,阳性克隆经PCR鉴定后测序,将测序结果与GenBank中山墙藓（Tortula ruralis）和小立碗藓（Physcomitrella patens）相关基因序列进行同源性比对。结果表明,实验成功克隆了S.caninervis的ALDH21基因的cDNA序列（GenBank登录号：GQ245973）,为一个完整的ORF,其长度为1452bp。该序列与T.ruralis和P.patens的cDNA序列同源性分别为98%和78%,推导的氨基酸同源性分别为97%和87%。生物信息学分析表明该蛋白质分子量为52.98kD,等电点pI为5.96,编码483个氨基酸,具备ALDH21蛋白家族特征;半定量RT-PCR结果表明：ALDH21在干旱胁迫状态时的表达量显著高于水合状态,说明ALDH21基因可能参与干旱胁迫应答。本文为进一步研究齿肋赤藓ALDH21基因的抗旱机理提供理论依据。     

小麦穗型突变体表型及其转录组分析

为了明确突变体小麦穗型变化的分子机制,对源自扬辐麦4号的穗型突变体sui1进行表型分析,并在不同的穗生长阶段（孕穗期T1、灌浆期T2）,对突变体sui1与野生型的穗轴节和穗下节进行转录组分析。结果发现,相较于野生型,突变体的穗轴节、穗下节长度变短,株高降低,赤霉病发病程度加重。转录组分析结果表明,相同时期穗下节差异表达基因多于穗轴节,相同组织孕穗期差异表达基因多于灌浆期,筛选出差异表达基因2 526个,其中上调基因890个,下调基因1 636个;对差异表达基因进行基因本体论（GO）分类发现,不同组织的分子功能注释基因在两个时期富集相同,大部分集中在三磷酸腺苷（ATP）结合上;差异表达基因京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析结果发现,植物-病原体互作通路富集基因最多,不同时期生物中的碳固定通路富集因子最高,不同组织光合作用-天线蛋白通路富集因子最高;对差异表达基因进行植物-病原体互作通路基因筛选,筛选出相关基因160个,其中防御反应基因63个（39%）,蛋白激酶活性基因21个（13%）,二磷酸腺苷（ADP）结合基因18个（11%）,推测这些基因可能对小麦突变体sui1穗轴节及穗型...     

小麦成株抗条锈性抑制差减杂交文库构建及表达序列标签分析

以成株期抗条锈小麦(Triticum aestivum)品种兴资9104为材料,依照CLONTECH公司PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit方法构建了小麦成株期条锈菌(Puccinia striiformis)诱导的抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)cDNA文库。建库质量分析表明,接头连接效率高,插入片段平均300bp,文库质量较好。对文库中随机挑取的96个阳性克隆进行测序,用CAP3软件聚类拼接,得到unigenes41个。与GenBank已知序列进行Blastx分析表明,所得基因主要涉及植物的信号传导、转录调控、能量与代谢、蛋白质合成与代谢、膜转运、细胞生长分化等。利用RT-PCR对3条基因进行分析,明确其在抗病过程中的表达模式。     

甲基营养型芽胞杆菌WM7低温响应转录谱分析

为从分子水平揭示甲基营养型芽胞杆菌WM7低温响应机制,采用高通量测序技术对低温和常温培养的菌体进行转录组测序分析,对部分差异表达显著基因进行RT-qPCR验证。结果表明,共检测到2 029个差异表达基因,其中1 519个低温上调,510个低温下调。GO和KEGG分析显示,1 199个差异表达基因归属细胞组分、分子功能和生物过程3个部分,683个基因参与到225个代谢途径中,其中涉及基因最多的是磷酸戊糖途径、嘌呤和氨基酸合成途径。菌株低温响应主要与脂肪酸代谢、ABC转运体、转录调控、信号转导、碳氮代谢等途径相关。此外,检测到大量差异表达的未知功能基因,多个基因差异表达倍数均大于50倍。本研究从基因表达方面阐述了甲基营养型芽胞杆菌WM7低温响应机制,为全面揭示其低温生长机制奠定了理论基础,提供了基因信息。     

鸭早期胚胎发育相关基因消减文库的构建与分析

动物胚胎发育受到多个基因的表达调控,为探索鸭早期胚胎发育的分子机制,本实验构建了鸭早期胚胎发育相关基因的消减文库,筛选与鸭早期胚胎发育相关的候选基因.采集两个不同时段的鸭(Anas platyrhynchos)胚(6和20 h)分别作为驱动组(driver)和实验组(tester),通过由双链特异性核酸酶(designatedduplexspecific nuclease,DSN)介导的消减杂交方法,构建鸭早期胚胎发育相关基因的消减文库,并进行生物信息学分析.结果表明,在构建好的文库中随机挑选216个阳性克隆进行测序,最终共得到54条有效序列,平均长度为1 084 bp.将这些序列在GenBank中进行BLAST比对,其中44条有同源基因,基因注释(geneontology,GO)显示,这些基因与代谢、建立细胞定位、生物调节等各种生物途径相关,它们在鸭早期胚胎发育过程中的不同方面(如神经系统发育、免疫调节、转录调节等)都发挥着非常重要的作用.这些差异表达基因的分离与鉴定,有助于家禽早期胚胎发育的相关研究.     

大规模板栗疫病菌cDNA文库的特征和冗余序列的排除

低毒病毒/板栗疫病菌是一个研究病毒宿主相互作用的优良的实验系统.为了更好的了解病毒与宿主相互作用的机制,我们建立了一个野生型无病毒板栗疫病菌菌株EP155和受低毒病毒感染的菌株EP713的cDNA混和文库,以进行表达序列标签（EST）测定.对543个克隆的外源片段的分析表明,该文库克隆中含外源片段的比例为89.8%;通过小规模测序,发现空质粒与小片段克隆占测序总数的10.1%;表达丰度最高的4个克隆出现次数的总和占测序总数的9.6%.通过设计引物进行PCR和原位杂交,对cDNA文库2万多个克隆进行了筛选,共筛除了占总数19.7%的空质粒与小克隆和5.5%的高丰度克隆,为高效率的大规模EST测序准备了条件.     

高羊茅FaGI基因在拟南芥中异源表达及蛋白互作分析

为探究高羊茅FaGI基因的生物学功能,本研究利用酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀探究与FaGI互作的蛋白;通过农杆菌介导法将过表达载体p1300-FaGI遗传转化拟南芥,获得转FaGI基因拟南芥株系,以拟南芥野生型Col-0、过表达FaGI基因株系和gi突变体为材料进行转录组学测序并观察其开花表型。结果表明,利用酵母双杂交方法筛选出与FaGI互作的FaCO蛋白,并通过双分子荧光互补和免疫共沉淀证明了FaGI和FaCO在体内和体外存在互作关系;过表达FaGI基因拟南芥植株的开花时间比野生型Col-0提前约1.24 d;将FaGI-OE、gi与野生型比对,分别筛选出1 963和92个差异表达基因（DEGs）,与野生型植株相比,过表达FaGI基因株系的差异基因富集在与生长发育、光周期途径、激素合成和信号传导、碳代谢等相关生物过程和代谢通路。综上,FaGI影响光周期途径相关基因的表达,在长日照条件下过表达FaGI基因促进了拟南芥开花,同时该基因的功能具有多样性与复杂性,可作为高羊茅调控分子育种的目标基因。本研究结果为揭示FaGI基因的功能及其调控网络奠定了基础。     

黄秋葵对南方根结线虫抗性的转录组分析

为了解黄秋葵抗南方根结线虫相关基因组学,利用Illumina Hi-seq TM2500高通量测序技术研究受南方根结线虫侵染后黄秋葵种质12C2转录组基因的差异表达。结果表明,接种南方根结线虫18 h后,从接种和未接种的黄秋葵种质12C2根尖中共获得71.49 Gb有效数据,Q30碱基百分比均达到94.0%以上。共获得2 318个差异表达基因(DEGs),包括1 156个上调基因,1 162个下调基因,其中功能注释基因2 202个。根据unigene库序列进行GO、KOG和KEGG注释,细胞壁代谢相关基因——内切葡聚糖酶基因家族、聚半乳糖醛酸酶基因家族、葡聚糖内-1,3-β葡糖苷酶基因家族和果胶裂解酶基因家族下调表达,植物激素代谢相关基因——生长素响应蛋白基因、生长素流入运输载体基因下调表达,茉莉酸合成酶基因上调表达,调控相关基因表达的WRKY和MYB转录因子基因家族上调表达,参与植物细胞的膜联蛋白基因家族上调表达,植物细胞周期蛋白基因家族下调表达。本研究结果为开展黄秋葵抗南方根结线虫基因组学和分子生物学研究奠定了基础。     

欧李叶片全长cDNA文库的构建和部分克隆的序列分析

采用SMART技术,构建了欧李(Prunus humilis Bunge)品系T8-1叶片全长cDNA文库,原始文库滴度达6.17×10~7 pfu/mL,库容达3.7×10~7,重组率达95%,平均插入片段大小约为1.2 kb.随机挑取400个单克隆进行5'端测序,共获得364个欧李ESTs.绝大部分ESTs的长度在500～1300 bp之间,平均长度为877 bp,其中具有完整ORF结构的序列有221条,占60.71%.通过与NCBI等非冗余核酸数据库和蛋白质数据库进行比对、查询和注释,获得已知功能基因或具推测功能的基因181个(339个ESTs),相似性较低的未鉴定基因5个(9个ESTs),新基因14个(16个ESTs).     

结球白菜结球前期基因表达序列标签（EST）分析

以结球白菜(Brassica rapa L.ssp．pekinensis)结球前期心叶为材料，构建了结球前期球叶cDNA文库，随机挑选克隆单向单次测序后，共得到1162条峰图良好和插入片段长度大于150bp的可用序列。BLASTX及BLASTN序列比对分析表明，94．8％(1102／1162)的表达序列标签(EST)可在蛋白质或核苷酸水平上找到同源类似物。同源性最大的蛋白质按物种来源分析后发现，大约77％的功能已知蛋白质来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)，另外还有60个EST与已发表的植物基因没有同源性，这一部分EST对于研究结球白菜独特的生理和形态发育途径以及开展基因组分子作图具有重要的意义。同源蛋白质按其功能进行分类表明，参与蛋白质合成过程的酶或蛋白质的EST数量最多，其次是参与能量代谢过程(包括光合作用)的EST序列。在核苷酸水平上，全部EST中只有51％的同源物来自拟南芥。对上述1162条EST进行片段重叠群分析(contig analysis)共获得895个非冗余片段重叠群，其中723个仅由一个EST组成(即singletons)，表明结球白菜结球过程中表达的基因种类繁多。大量EST的获得为进一步了解结球白菜结球机制及获取相关基因提供了重要的序列信息。     

干旱胁迫下新源1号新疆野苹果抑制性差减文库的构建与初步分析

为分离和鉴定新疆野苹果(Malus sieversii Roem.)根组织干旱胁迫条件下差异表达的基因,以苗龄为3个月的新源1号新疆野苹果水培苗为材料,应用20%PEG 6000溶液处理模拟干旱胁迫,利用抑制性差减杂交(SSH)的方法构建了新疆野苹果根组织干旱胁迫诱导表达差减文库(正库)和抑制表达差减文库(反库).正库和反库随机各挑菌500个,菌落PCR显示插入片段在250~1000 bp之间.测序鉴定后共得到268个有效UniESTs.经Blastx和Blastn等生物信息学方法分析表明全部的UniESTs按可能的生物学功能可被分为16个大类,包括新陈代谢、能量、转录、蛋白质合成、蛋白质修饰降解、DNA加工、细胞信号转导等.