玉米Ubi-1启动子驱动挪威鼠Hspa4基因植物表达载体的构建

根据Genbank中挪威鼠（Rattus norvegicus）Hspa4基因序列(登录号：NM 153629)和玉米Ubi-1启动子序列(登录号：DQ141598 )设计引物,采用RT-PCR和PCR技术分别进行克隆。测序及同源性分析结果表明：Hspa4基因片段含有2530bp,编码840个氨基酸;获得的启动子Ubi-1序列大小为1992bp;克隆的序列与相应原序列同源性分别为99.96％和99.55%。以植物表达载体pCAMBIA1301质粒为基础,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1301-Ubi-Hspa4,为利用Hspa4基因改良植物抗逆性打下了基础。     

棉花Bax inhibitor-1基因启动子的克隆及初步验证

为研究克隆自陆地棉的GhBI-1A和GhBI-1B基因的表达差异及其响应不同物生和非生物胁迫的分子机制,利用BD GenomeWalkerTM Universal Kit的染色体步移技术得到了2个棉花GhBI-1A和GhBF1B基因5’端上游的启动子序列,长度分别为1650bp和2001bp.生物信息学分析表明,GhBI-1A和GhBI-1B的启动子序列均存在TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件,GhBI-1B启动子中还含有真菌诱导应答元件.以表达载体pBI101为基础,用所克隆的2个棉花GhBI-1基因启动子序列与GUS报告基因融合,构建新的植物表达载体并转入农杆菌.用叶盘法侵染烟草进行瞬时表达,结果表明2个启动子均能够驱动报告基因的表达.     

水曲柳SnRK2B基因和启动子的克隆及分析

为了研究水曲柳中同源SnRK2转录因子的功能,在水曲柳干旱响应转录组中寻得SnRK2B的同源序列并克隆得到SnRK2B转录因子基因全长,将其命名为FmSnRK2B。使用SiteFinding-PCR法扩增获得SnRK2B启动子序列,并对FmSnRK2B基因编码区及其启动子进行生物信息学分析和启动子顺式调控元件分析。结果表明,克隆得到的全长序列包含完整的开放阅读框1074bp,编码357个氨基酸。启动子顺式作用元件分析结果表明,其启动子区包含脱落酸应答元件ABRE及胁迫相关元件HSE、MBS等。干旱胁迫下,FmSnRK2B基因的表达随胁迫时间的延长先增加后降低,表明其参与植株的抗逆过程。本研究对进一步揭示水曲柳的抗逆机制具有重要意义。     

青花菜转录因子基因BoNAC1的克隆与表达分析

为明确青花菜NAC转录因子基因的序列特征和表达特点,本研究以青花菜为试验材料,在克隆Bo NAC1转录因子基因的基础上,采用RT-q PCR研究该基因的表达,以明确其在核盘菌和根肿菌侵染下的表达模式。结果表明,Bo NAC1含2个内含子,长度分别为1 832 bp和670 bp,编码区全长为1 035 bp,编码344个氨基酸,含1个NAM结构域;系统发育树分析结果表明,Bo NAC1与来自芸薹属的NAC亲缘关系最近,并与其他十字花科NAC聚为一组,而与豆科、蔷薇科NAC的亲缘关系相对较远,在系统发育树上处于不同的分支。基因表达分析结果表明,Bo NAC1的表达受核盘菌的诱导,在12 h和24h时的表达量最高,分别为对照的6.28倍和7.03倍;Bo NAC1的表达还受根肿菌的诱导,15 d和20 d时的表达量最高,分别为对照的4.23倍和4.11倍,表明该基因可能参与核盘菌和根肿菌的应答反应。本试验对青花菜Bo NAC1基因的克隆与表达分析,为Bo NAC1基因的功能鉴定和生产应用奠定了理论基础。     

蓝猪耳胚珠磷脂酶C基因TfPLC1启动子的克隆及载体构建

应用衔接头PCR技术，以蓝猪耳全基因组DNA分别经DraI、EcoRV、PvuII、SmaI消化后与衔接头连接产物为模板，用衔接头引物和TfPLC1基因的特异引物经过多轮的巢式PCR，先后克隆到两个大小为798bp、813bp的TfPLC1基因上游序列；经测序、blastn比较分析和拼接得到一个蓝猪耳TfPLC1基因的启动子序列，共1432bp。序列分析表明它含有类似于TATA box和CAAT box的元件，在其远端上游区域还有多个AT富含区，而且还含有多个胚乳特异表达启动子的元件。将该启动子全序列和5’端缺失的700bp序列与PBI121分别构建了植物表达载体PPP1326和PPP700，用于转化蓝猪耳，以验证该启动子的功能。该启动子的克隆对于研究蓝猪耳胚珠TfPLC1基因的表达调控及功能具有重要意义。     

抗二氟沙星单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR技术,从抗二氟沙星单克隆抗体X1杂交瘤细胞株总RNA中扩增VH和VL基因片段,克隆入pUC18载体,测序进行（X1）可变区基因的克隆及序列分析。通过互联网检索发现VH和VL基因与Ig同源,分别符合小鼠IgVH和Igκ基因特征。VH基因全长363bp,编码121个氨基酸;VL基因全长为348bp,编码11...     

菜心组蛋白乙酰转移酶基因BrcuHAC1克隆与表达分析

为揭示组蛋白乙酰化修饰在十字花科作物抽薹发育表观遗传调控中的功能,以油青49和油青甜菜心80天的菜心为材料,通过PCR和RACE方法克隆了菜心BrcuHAC1基因c DNA和g DNA全长序列,并进行生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR方法检测目的基因的时空表达特性。结果表明,克隆获得了BrcuHAC1基因全长6 061 bp,包括CDS区5 067 bp,编码1 688个氨基酸。对应的g DNA全长为7 376 bp,含有15个外显子和14个内含子,最长的外显子长度为1 599 bp,内含子的长度范围为50~210 bp。启动子序列中含有多个基本转录元件和顺式作用元件,如光反应元件、脱落酸响应元件、参与厌氧诱导的增强子元件等。多序列比对结果表明,BrcuHAC1的氨基酸序列中含有高等植物HAC1基因的6个保守结构域。系统发育分析结果显示,菜心与油菜、甘蓝、白菜处于同一分支,其亲缘关系最近。时空特异性分析结果表明,BrcuHAC1在菜心的根、茎、花、叶中均有表达,其中在花中表达量最高,叶次之,根最低;BrcuHAC1从苗期至完全抽薹开花期的表达量呈现上升趋势,说明BrcuHAC1在菜薹花发育过程中可能起到一定的调控作用。本研究结果为揭示组蛋白乙酰转移酶调控菜心抽薹分子机制提供了一定的理论依据。     

玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因的克隆与表达

玉米大斑病菌（Setosphearia turcica）属半知菌亚门丝状真菌，是严重威胁玉米生产的重要植物病原真菌。本研究克隆了玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因Stgb-1。Stgb-1基因全长1296bp，由5个外显子和4个内含子组成；开放阅读框（ORF）为1056bp，编码351个氨基酸，蛋白质计算分子量为39.081kDa。STGB1蛋白推导氨基酸序列与Cochliobolus heterostrophus（100%）、Cryphonectria parasitica（80%）、Aspergillus fumigatus（81%）等丝状真菌的G蛋白β亚基编码基因均具有较高的同源性。同时，利用RACE技术和Genomic Walking技术获得了Stgb-1基因3’-末端cDNA和DNA的3’端侧翼序列，BlastN结果表明其cDNA 3’-UTR为136bp，poly(A)由9个A构成。此外，构建了pET28a-Stgb-1原核表达载体，SDS-PAGE检测和Western blot鉴定结果表明，目的蛋白在E.coli BL21菌株中已成功实现了诱导表达，为进一步研究蛋白结构与功能的关系奠定了基础。     

桃PGIP基因及其启动子的克隆与分析

桃流胶病是一种严重危害桃树的真菌性病害,为研究PGIP基因在桃抗流胶病及抗其它真菌性病害中的作用,本研究以桃抗流胶病品种‘南京白沙’叶片为材料,对其PGIP基因及启动子序列进行克隆与分析。克隆测序获得了‘南京白沙’桃PGIP基因cDNA序列（GenBank登录号：HQ453972）和PGIP基因组DNA序列以及起始密码子上游453bp的启动子序列（GenBank登录号：HQ453974）,并将该PGIP基因命名为PpPGIP2。‘南京白沙’桃PpPGIP2序列分析显示,该DNA序列具有完整的阅读框,无内含子,与GenBank中登录的李属PGIP基因序列同源性在93%～98%之间,与测序完成的桃全基因组中该基因的序列同源性为96%;PpPGIP2编码的氨基酸序列分析显示,该氨基酸序列含有2个典型的亮氨酸重复序列,信号肽为第1～第24个氨基酸残基;PGIP基因的序列聚类图显示,除了科、属、种间的同源性差异外,桃的种内PGIP基因同源性也有较大差异;PpPGIP2启动子序列分析发现3个抗病相关元件,分别为：GT1CONSENSUS、SEBFCONSSTPR10A和WBOXATNPR1,另外还有与激素调控、胁迫有关的调控元件。本研究对‘南京白沙’桃PGIP基因和启动子的克隆与分析,将为进一步研究桃PGIP基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3（AP3）在花瓣和雄蕊中特异性地表达;AP3基因编码转录因子,与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育。研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子。因此,AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用。本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana）AP3基因启动子序列（U30729）设计了一对特异性扩增引物,基于PCR技术,用高保真的KOD-plusDNA聚合酶扩增了长度为1767bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子,并命名为pAtAP3,其Gen-Bank登录号为FJ619533。Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%,与Col生态型拟南芥BAC克隆T12E18（AL132971）9264~11030之间的碱基序列相似性达100%,且该段序列的下游基因编码AP3蛋白（CAB81799）,说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子。PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等。本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3：：GUS,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。     

生长素内流载体基因CkLAX3参与柠条锦鸡儿干旱胁迫响应的分析

植物干旱胁迫进程往往伴随着生长抑制类激素如脱落酸、乙烯的参与,而近年研究表明,生长素也可以响应干旱胁迫。本研究通过染色体步移、生信分析和亚细胞定位等方法,对CkLAX3基因在干旱响应中的作用进行了分析鉴定。研究经PCR扩增获得一个全长为1 398 bp的柠条生长素内流载体基因CkLAX3。生信分析发现,该序列编码465个氨基酸,分子量为52.47 kDa,其编码的蛋白为稳定的疏水性蛋白,二级结构主要由α螺旋组成,具有10重跨膜结构。亚细胞定位结果表明CkLAX3定位于细胞质膜。进化树分析结果表明,CkLAX3与红三叶、鹰嘴豆等植物LAX3基因亲缘关系较近。联合染色体步移和高效热不对称交错PCR (HiTail-PCR)方法克隆得到CkLAX3基因的未知启动子区序列总计1 352 bp。对启动子序列上的顺式作用元件进行分析发现,CkLAX3基因启动子区存在大量干旱响应元件、光响应元件、激素响应元件等。进一步对干旱处理的柠条锦鸡儿进行定量分析发现,CkLAX3的表达量受干旱胁迫诱导,推测该基因在干旱胁迫下发挥重要作用。本研究为进一步探索生长素在调节干旱胁迫应答过程中的作用机制提供了基础。     

翘嘴鳜肌球蛋白轻链3b基因（MLC3b）的分子克隆和特征分析

翘嘴鳜以其优良肉质性状近期已成为中国极具商品价值和大力推广的人工养殖名贵鱼类之一。为了解其控制优良肉质性状的遗传基础,本文采用同源克隆RT-PCR方法,获得该鱼肌球蛋白轻链MLC3b基因cDNA序列,该基因cDNA序列为453bp,编码150个氨基酸残基,通过PROSITE tools软件预测显示,该轻链具有两个保守的EF-手相结构和一个C-末端保守序列,且该MLC3轻链N端没有高等脊椎动物特有标志序列。MLC3b基因cDNA序列与MLC3a编码区的同源性达97.7%。本研究结果将为名贵鱼类肉质结构基因及功能的研究提供分子生物学基础。     

蓝猪耳胚珠磷脂酶C基因TfPLC1启动子的克隆、序列分析及植物表达载体的构建

应用衔接头PCR技术,以蓝猪耳(Torenia fournieri)全基因组DNA分别经DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和SmaⅠ消化后与衔接头连接产物为模板,用衔接头引物和TfPLC1基因的特异引物经过多轮的巢式PCR,先后克隆到2个798和813bp的Tf-PLC1基因上游序列;经测序、blast比较分析和拼接得到一个蓝猪耳TfPLC1基因的启动子序列,共1432bp。序列分析表明它含有类似于TATAbox和CAATbox的元件,在其远端上游区域还有多个AT富含区,而且还含有多个胚乳特异表达启动子的元件。将该启动子全序列和5'端缺失的700bp序列与PBI121分别构建了植物表达载体PPP1326和PPP700,用于转化蓝猪耳,以验证该启动子的功能。     

小金海棠Fe3+-螯合还原酶MxFRO2基因启动子的克隆与表达分析

通过染色体步移法从小金海棠（Malus xiaojinensis）基因组中克隆了三价铁螯合还原酶（ferric chelate reductase, MxFRO2）基因翻译起始位点上游1 738 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子片段中存在光响应元件G-box、生长素应答元件、铜元素响应元件、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件。从TAIR网站获得了拟南芥（Arabidopsis thaliana）中8个FRO基因上游的启动子序列,通过PlantCARE分析了其与MxFRO2启动子的异同。根据在线预测结果,克隆了翻译起始位点上游1 644 bp（MxFul）和259 bp（MxD1）两段序列,构建了其与GFP融合的瞬时表达载体,并将重组质粒通过PEG介导法分别转化拟南芥叶片原生质体,结果表明,小金海棠MxFul和MxD1两段启动子序列都能驱动GFP蛋白在拟南芥原生质体中的瞬时表达。     

番茄NAC转录因子SlNAP2的克隆、表达及功能分析

为了探究NAC转录因子在番茄生物胁迫响应中的功能,本试验通过逆转录PCR(RT-PCR)技术从番茄中克隆得到一个NAC转录因子基因SlNAP2,其cDNA全长（ORT）1 227 bp,包含142 bp的5′非编码区和257 bp的3′非编码区以及一个长度为828 bp编码275个氨基酸的开放阅读框（ORF）,含1个NAM结构域。同源序列比对及系统进化树分析结果表明,SlNAP2与潘那利番茄SpNAP2亲缘关系最近,并与其他茄科NAC聚为一组,而与菊科、葫芦科、葡萄科、大戟科、杨柳科NAC的亲缘关系较远,在系统发育树上处于不同的分支。生物信息学分析结果显示,SlNAP2相对分子质量为31 877.23 Da,理论等电点pI为8.56,该基因编码的蛋白不存在跨膜结构。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明,SlNAP2基因表达具有组织特异性,在番茄茎中的表达量最高,并参与了番茄对青枯菌胁迫及水杨酸和茉莉酸刺激的响应。利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术发现,沉默SlNAP2后降低了植株对青枯病的抗性,表明SlNAP2在番茄抗青枯病过程中起正调控作用。本研究为深入探讨SlNAP2基...     

金柑LEAFY同源基因克隆与全序列分析

通过PCR扩增,从融安金柑基因组DNA中克隆出一条2 361 bp的DNA片段,该DNA克隆含有1个2 081 bp的LEAFY同源基因全长序列(FcLFY)。金柑LEAFY同源基因包含2个内含子和3个外显子,编码398个氨基酸。比对结果表明,金柑LEAFY同源基因与甜橙、枳的LEAFY同源基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均为98%。该研究为今后从分子水平上研究金柑开花调控机理打下了坚实的基础。     

玉米NAC转录因子基因ZmNAM的克隆及表达分析

为探究候选基因ZmNAM的功能,本研究从甜玉米自交系1132及其变异系704中克隆得到该基因。生物信息学分析表明,ZmNAM的c DNA长度为1 548 bp,开放阅读框(ORF)为1 302 bp,编码一个由433个氨基酸残基组成的蛋白,蛋白具有亲水性,N-末端具有保守的NAC结构域,定位于细胞核中,具有9个糖基化位点和35个磷酸化位点;与自交系1132相比,变异系在非编码区与编码区中的C-末端转录激活功能域对应核苷酸序列中存在差异,可导致多个氨基酸发生变异。系统进化分析结果表明,玉米ZmNAM蛋白属于NAC转录因子家族中的VND亚族,与拟南芥中的At VND3亲缘关系最近;时空特异性表达分析表明,不同发育时期内ZmNAM在根中的表达量明显高于其他器官,说明ZmNAM基因可能在调控玉米根部的生长发育过程中发挥着重要作用。变异系704中ZmNAM在各个发育时期和发育器官中表达水平基本都明显高于自交系1132,其中在根中的表达水平差异最明显。本研究结果为深入研究ZmNAM基因在玉米生长发育过程中的作用提供了理论支持。     

鸡β-防御素基因的克隆与结构分析

通过RT-PCR扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的部分cDNA序列，大小分别为198、195和297bp。利用PCR技术扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因组DNA部分序列，大小分别为1176、1053和2454bp。经分析发现，2个内含子将鸡-β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的编码区分成3个外显子部分。第1个外显子编码绝大部分信号肽序列；第2个外显子编码信号肽羧基端极小部分序列、原片段序列与大部分成熟肽序列；第3个外显子编码小部分成熟肽序列。扩增到的鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的两个内含子长度，分别为482和496bp，183和675bp，980和1280bp。鸡β-防御素基因编码区结构的这种组成与哺乳动物的β-防御素基因的不同，在哺乳动物中为1个内含子将β-防御素基因编码区分成2个外显子部分。Blast比较发现，鸡β-防御素Ga1-1和Ga1-2基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．182上，并且这2个基因转录方向相反。Ga1-3基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．181和Contig42．182上，转录方向与Ga1-1基因相同。     

鸡爪槭ApPSY和ApPDS基因克隆及其表达分析

为了探究八氢番茄红素合成酶基因(PSY)和八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)在鸡爪槭叶片呈色中的作用机制,本研究以鸡爪槭黄金槭叶片为材料,采取RT-PCR技术,克隆得到ApPSY基因和ApPDS基因的cDNA序列,对其生物信息学进行初步分析,并检测了不同叶色品种及不同发育时期槭树叶片中基因的表达情况。结果表明,ApPSY基因cDNA序列长1 497 bp,有一个1 257 bp的完整开放阅读框,共编码418个氨基酸;ApPDS基因cDNA序列长1 974 bp,有一个1 692 bp的完整开放阅读框,共编码563个氨基酸。生物信息学分析表明,ApPSY和ApPDS蛋白质均为亲水性蛋白质,无信号肽和跨膜结构。进化树结果显示,鸡爪槭ApPSY、ApPDS与柚子、葡萄柚和甜橙的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析结果表明,在不同发育时期叶片中ApPSY基因在呈色期表达量最高,而ApPDS基因在小绿期表达量最高;在不同叶色品种叶片中ApPSY基因在黄金槭品种中的相对表达量最高,ApPDS基因则在橙之梦品种中的相对表达量最高。本研究结果为进一步阐明ApPSY和ApPDS基因在鸡爪槭中的生物学功能提供了理论依据。     

卡特兰ACO基因克隆与反义表达载体的构建

以卡特兰(Cattleya)花瓣为试材,提取其总RNA,并根据其他兰花的ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase, ACO)基因保守序列设计一对特异性引物,通过RT-PCR法克隆得到1条967bp的卡特兰ACO cDNA片断,共编码321个氨基酸残基。序列分析结果显示该克隆片断与已发表的其他兰花的ACO基因序列同源性很高,均在85%以上,尤其与原生种和其近亲属的同源性在95%以上。将克隆的卡特兰ACO片段反向连接到植物表达载体pBI121中CaMV35S启动子的下游,构建了卡特兰ACO基因的反义表达载体pBI121ACC,为进一步应用反义技术培养长花期卡特兰新品种奠定了基础,也为首次应用生物技术延长卡特兰花期做出了尝试。