川乌头F3′5′H基因的cDNA克隆与表达分析

利用RT-PCR结合RACE技术,从川乌头(Aconitum carmichaeli Debx.)花朵中克隆到1个类黄酮-3′,5′-羟基化酶基因的cDNA全长序列,全长1720bp,包含1个编码506个氨基酸的开放阅读框,命名为Ac-F3′5′H(GenBank登录号:JN635708)。序列分析表明Ac-F3′5′H编码的氨基酸序列中包含有已确定的保守基序,包括CYP基序、I螺旋区和血红素结合区等。氨基酸序列比对显示Ac-F3′5′H与其它物种的F3′5′H有很高的序列相似性。以川乌头18SrRNA基因(FJ748878)为内参,通过半定量RT-PCR对Ac-F3′5′H的时空表达模式进行了分析,结果显示Ac-F3′5′H随花朵发育,表达量呈递增趋势,并且在正在开放的花朵中达到最高,而在根、茎、叶中不表达,推测该基因可能在调节川乌头蓝色花朵形成中发挥作用。     

调控观赏植物花色的类黄酮3'羟化酶基因研究进展

综述了类黄酮3′羟化酶基因(F3′H)调控观赏植物花色的分子机理及近年来的研究进展,总结了类黄酮生物合成途径中F3′H的作用,F3′H基因的分离克隆及鉴定方法、表达模式及其对花色的影响,并提出未来研究的展望,以期为进一步明确F3′H基因调控花色的分子机理研究以及可能的花色定向育种提供参考。     

川乌头F3′5′H 基因的cDNA 克隆与表达分析

 利用RT-PCR 结合RACE 技术,从川乌头（Aconitum carmichaeli Debx.）花朵中克隆到1 个类黄酮–3′,5′–羟基化酶基因的cDNA 全长序列,全长1 720 bp,包含1 个编码506 个氨基酸的开放阅读框,命名为Ac-F3′5′H（GenBank 登录号：JN635708）。序列分析表明Ac-F3′5′H 编码的氨基酸序列中包含有已确定的保守基序,包括CYP 基序、I 螺旋区和血红素结合区等。氨基酸序列比对显示Ac-F3′5′H 与其它物种的F3′5′H 有很高的序列相似性。以川乌头18S rRNA 基因（FJ748878）为内参,通过半定量RT-PCR对Ac-F3′5′H 的时空表达模式进行了分析,结果显示Ac-F3′5′H 随花朵发育,表达量呈递增趋势,并且在正在开放的花朵中达到最高,而在根、茎、叶中不表达,推测该基因可能在调节川乌头蓝色花朵形成中发挥作用。     

百合APX基因的克隆及转LlAPX提高拟南芥耐盐性

从铁炮百合‘白天堂’（Lilium longiforum‘White Heaven’）组培苗叶片中克隆得到一个抗坏血酸过氧化物酶基因（APX）的cDNA序列,全长1 074 bp,推断其编码251个氨基酸。系统进化树分析表明APX在进化过程中保守性很高。通过构建过表达载体,转化拟南芥,其APX酶活性提高了4.7 ~ 7.8倍,AsA含量提高了1.5 ~ 2.3倍,其种子耐盐性提高。     

低温胁迫下新铁炮百合幼苗叶片活性氧的产生及保护酶活性的变化

试验通过在不同低温胁迫时间以及恢复时间内,对新铁炮百合幼苗叶片内的超氧阴离子自由基O2的产生速率、POD和SOD活性以及膜脂过氧化产物(MDA)含量进行了测定.结果表明:不同程度的低温胁迫对新铁炮百合细胞内活性氧代谢的平衡均产生不同程度的破坏,上述指标通过明显的变化来减轻损伤程度,从而增强了新铁炮百合幼苗的抗低温能力.     

银杏类黄酮3’羟化酶基因的克隆与表达分析

利用简并PCR和RACE技术从银杏叶片中分离到黄酮3’羟化酶基因Gb F3’H的c DNA全长序列(Gen Bank No.:KP056747)。其全长为2 144 bp,含有一个1 671 bp的开放式阅读框(ORF),编码556个氨基酸序列,预测氨基酸大小为63.47 k D,等电点为7.71。蛋白质同源序列分析表明,Gb F3’H与其他物种F3’H同源性较低,而与菊苣(Cichorium intybus)同源性最高,为56.3%。同源建模分析显示Gb F3’H与P450家族蛋白的三维结构及活性位点高度相似,最终定位于微粒体膜上。进化树分析结果显示Gb F3’H与其他植物分化较早,序列差异较大。组织表达分析显示,Gb F3’H在银杏不同组织中都有表达,其中雄蕊表达水平最高,其次为成熟叶。诱导表达分析显示,Gb F3’H转录水平受UV-B、6-BA、SA、ABA和IAA影响诱导上调,而伤害处理对其表达量无明显影响。Gb F3’H诱导表达模式与调控银杏黄酮含量变化呈正相关,其上游调控序列存在与黄酮调控相关的顺式元件,意味着Gb F3’H可能参与了银杏黄酮类物质的合成代谢,并与黄酮类物质向花青素合成分流有关。     

农杆菌介导的几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因转化辣椒研究

以苗龄7～10 d的辣椒组培苗为被侵染的外植体,通过农杆菌介导几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因,研究基因型、外植体类型、抗生素浓度对辣椒遗传转化的影响,以期获得抗真菌病的转基因辣椒植株.结果表明:不同基因型间、外植体类型、抗生素种类和浓度对辣椒的遗传转化影响存在较大差异.以几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对辣椒进行了遗传转化,获得了3株抗性植株.     

东方百合高效转基因体系构建及EPSP基因的导入

以东方百合‘西伯利亚’无菌鳞茎超薄切片(0.5～1.0 mm)为试材,通过PIC和2,4-D不同浓度筛选愈伤诱导培养条件,采用超薄鳞片直接分化及愈伤分化2种转化方式,测试对Cef、Kan及Hgy的耐受性,分析不同干燥预处理以及MES、AS对转化效果的影响,并通过EPSP基因的导入,验证基因转化阳性率及转化效果,以期优化百合遗传转化的技术参数,建立高效遗传转化体系并进行EPSP基因的导入。结果表明：PIC对百合愈伤诱导有良好效果,MS+1 mg·L^-1 PIC+0.3 mg·L^-1 NAA为最佳愈伤诱导培养基;抗生素敏感性测试发现,培养基添加75 mg·L^-1 Kan或20 mg·L^-1 Hyg结合250 mg·L^-1 Cef适宜抗性筛选;超薄鳞片及愈伤在60 min和30 min的干燥预培养下,阳性率均显著提高;MS+10 mmol·L^-1 MES+200μmol·L^-1 AS为重悬液处理,超薄鳞片获得48.3%的高效转化率,优于愈伤...     

青岛百合LtXTH5的克隆及VIGS表达载体构建

以青岛百合(Lilium tsingtauense)的花被片作为试材,采用了RT-PCR的方法从青岛百合中分离到LtXTH5基因,并进行生物信息学分析和病毒诱导沉默表达载体的构建,研究了花发育基因LtXTH5的基本理化性质和载体构建方法,以期为后期LtXTH5生物学功能的验证奠定基础。结果表明:LtXTH5基因(登录号MN245449)的开放阅读框包含882 bp,编码293个氨基酸;生物信息学分析预测LtXTH5蛋白相对分子量为33.8 kDa,分子式为C₁₅₃₆H₂₂₈₃N₄₀₇O₄₃₆S₁₂,理论等电点(pI)为7.03,脂肪指数68.23,不稳定指数为31.68,LtXTH5是亲水性蛋白,具有信号肽;基序分析发现不同植物XTH中的保守基序数目不同,LtXTH5含有9个基序;序列比对结果表明LtXTH5氨基酸序列含有DEIDFEFLG催化活性位点和GH16_XET结构域,是典型的XTH家族成员;系统进化树分析表明LtXTH5与拟南芥AtXTH5亲缘关系...     

卷丹转基因体系构建及岷江百合LrCCoAOMT的导入

以卷丹(Lilium lancifolium Thunb.)无菌小鳞片为试材,通过切片处理、优化农杆菌侵染浓度与时间以及重悬液和共培养基成分,构建农杆菌介导的高效遗传转化体系。结果表明,MS+1.5 mg·L^-16-BA+0.5 mg·L^-1 NAA+30 g·L^-1蔗糖是切片芽分化的最佳培养基,添加100 mg·L^-1抗坏血酸能有效抑制褐化并促进不定芽增殖。MS+2.0 mg·L^-1 NAA+30 g·L^-1蔗糖是生根诱导的最佳培养基。抗生素敏感性测试发现,培养基中添加Kan 100 mg·L^-1或Hyg 75 mg·L^-1结合Cef 400 mg·L^-1适宜抗性筛选。GUS染色分析表明,以去除大量元素的改良MS+100μmol·L^-1AS和去除大量元素的改良MS+1.0mg·L^-16-BA+1.0mg·L^-1NAA+100...     

农杆菌介导的百合遗传转化体系的建立

 通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法, 建立了凝望星空百合(Lilium ‘Star Gazer’) 愈伤组织和西伯利亚百合(Lilium ‘Siberia’) 叶片的遗传转化体系。试验结果表明: 以愈伤组织和叶片为受体, 均能取得较理想的转化效果; 根癌农杆菌OD600介于0.5～1.0时, 能获得较高的转化率; 40 mg·L ^{- 1}的潮霉素对愈伤组织和叶片有很好的筛选效果; 在共培养培养基中, 去除NH₄NO₃对提高百合转化效率有极显著的效果。对转基因百合进行PCR检测, 结果表明gus基因已整合到百合基因组中。     

超敏反应辅助蛋白基因(hrap) 转化番茄的研究

 将可以诱发植物对病原菌抗性的甜椒hrap基因置于35S启动子的驱动下, 经农杆菌介导引入番茄。再生植株经过含卡那霉素的培养基的选择, 后经PCR 检测和Southern杂交鉴定含有目标基因。Northern杂交检测其表达后, 初步的抗菌检验显示其提高了对青枯病原菌的抵抗力。     

麝香百合花发育基因LLGLO1在花蕾中的时空表达

 为了获得百合花发育相关的B功能基因LLGLO1在调控百合花发育过程中的重要信息,以麝香百合（Lilium longiflorum）未开放的花蕾为试材,以LLGLO1基因的特异片段为探针,应用RNA原位杂交技术,对LLGLO1基因在花发育各个阶段的时空表达动态进行了研究。结果表明,LLGLO1基因在外轮花被、内轮花被、雄蕊和心皮等4轮花器官中均有表达,但表达强度随不同的发育阶段而变化。长度2.0和3.0 cm的花蕾中LLGLO1基因的表达量明显高于0.5和1.0 cm的花蕾,说明随着花器官的发育成熟,该基因在各轮花器官中的表达量逐渐增加。     

枣果实黄烷酮-3-羟化酶基因(F3H)的克隆及生物信息学分析

以枣果实为试材,采用同源克隆的方法,利用转录组测序结果设计F3 H基因特异引物序列,成功克隆得到了枣果实F3 H基因全长,对其进行了生物信息学分析,并对该基因含量变化与花色苷的关系进行了研究。结果表明:F3 H基因全长1 336bp,编码367个氨基酸残基。根据基因序列比对结果,枣果实F3 H基因编码的氨基酸序列与龙眼(Dimocarpus longan)、橄榄(Canarium album)、荔枝(Litchi chinensis)及川桑(Morus notabilis)的一致性分别为90%、90%、89%、89%。半定量RT-PCR法分析表明,该基因在枣果实的红熟期表达量最大,其次为枣果实的半红期,而枣果实的绿熟期表达量最低;该基因表达量变化与花色苷含量变化一致。     

岷江百合蛋白激酶基因lilyABC1的克隆及在非生物胁迫下的表达特性分析

以野生型岷江百合（Lilium regale Wilson）为材料,克隆岷江百合蛋白激酶基因lilyABC1,分析其在非生物胁迫下的表达特性,为百合抗逆育种提供候选基因。结果表明：lilyABC1基因全长cDNA序列为2 333 bp,其开放阅读框（ORF）为2 007 bp。该基因编码668个氨基酸,预测lilyABC1蛋白分子量为74.84 kD,等电点为5.46,含有一个高度保守的结构域--STYKc。lilyABC1基因在岷江百合的叶片、鳞片、花蕾组织中均有表达,表达量依次为叶 > 花蕾 > 鳞片,其中不同时期的花蕾中的表达量基本一致。lilyABC1的表达受到NaCl、低温、高温以及黑暗胁迫的诱导,对PEG-6000的模拟干旱处理不敏感,表明lilyABC1基因可能对岷江百合适应高盐、低温和黑暗等非生物胁迫具有一定作用。