茶树生长素合成酶基因YUCCA10克隆与表达分析

【目的】探究YUCCA10基因在正常花和不育花中的表达规律,为深入探索YUCCA10基因和生长素合成对茶树花器官发育的调控机制提供理论基础。【方法】前期研究茶树正常花与不育花转录组差异时,获得一条与YUCCA10基因高度同源的基因序列,利用‘云茶1号'茶树全长转录组数据库以及PCR技术克隆验证茶树YUCCA10基因,并对其生物信息学特征进行分析,同时运用qRT-PCR技术研究其表达特征。【结果】经验证YUCCA10基因含有1个1137 bp的开放阅读框,编码379个氨基酸,分子量为42.63 kDa,等电点为8.88,茶树YUCCA10蛋白具有NADPH结合位点和FAD结合位点,与多种植物YUCCA10蛋白同源。qRT-PCR分析CsYUCCA10在正常花中随着花的生长发育表达量增加,而在不育花的花瓣、雄蕊、雌蕊以及不同发育期中的表达均低于正常花。【结论】茶树CsYUCCA10基因在不育花中不能正常合成,从而影响了花的发育导致不育。     

茉莉酸合成关键酶基因FaOPR3调控草莓果实成熟

为了研究茉莉酸(Jasmonic acid,JA)合成路径关键酶基因FaOPR3在草莓果实成熟中的作用,测定了八倍体红颜草莓果实成熟过程中内源JA含量,并用外源茉莉酸甲酯(Me JA)涂抹草莓果实观察其果实着色情况及测定相关酶基因的表达,同时使用瞬时基因表达对草莓果实进行FaOPR3基因的超表达和干扰。结果显示草莓果实中内源JA含量从小绿果期到白果期急剧上升,到果实成熟后开始下降。草莓果实涂抹外源JA,能够促进果实发育和成熟。FaOPR3基因的过量表达可诱导果实内源JA含量的增加,并且可诱导色素合成基因FaCHS、FaCHI、FaF3H、FaUFGT、FaDFR的表达量上升。而FaOPR3基因干扰后果实内源JA含量降低,并且抑制相关色素代谢基因表达。说明FaOPR3基因能够促进草莓果实着色和成熟。     

过量表达RdreB1BI对草莓果实品质及相关基因的影响

【目的】研究外源基因RdreB1BI转入对‘红颊’草莓果实品质及相关基因表达的影响,揭示RdreB1BI在草莓果实品质调控中的作用及分子机理。【方法】以5个转RdreB1BI株系及非转基因‘红颊’草莓全红期果实为材料,测定果实纵横径、单果重、可溶性糖、可溶性蛋白、抗坏血酸等风味物质及花青苷、总黄酮、总酚等着色物质的含量。应用BLASTn、GENEFINDER和PlantCARE等生物信息学方法分析外源基因和7个次生代谢产物合成途径相关基因（RdreB1BI、Fractin、FvC4H、FvCCR2、FvGST、FvF3H、FvDFR和FvMYB306）的结构,并预测基因启动子作用元件。采用qRT-PCR定量法检测相关基因表达量,应用7300 system软件和2^-△△Ct法分析数据。对生理生化及分子数据进行方差及相关性分析,综合讨论RdreB1BI的转入对‘红颊’草莓果实品质及相关基因表达的影响。【结果】转基因‘红颊’草莓株系与野生型果实单果重的范围为11.75-15.42 g,纵径和横径的范围分别为35.12-40.42 mm及28.73-32.6 mm,仅株系8果实纵径显著大于株系7,其余指标间差异不显著。其中转基因株系1和7的花青苷含量显著高于野生型;转基因株系1、7及8总黄酮含量显著高于野生型;各转基因株系的总酚含量均显著高于野生型。转基因株系1、7和8果实的可溶性糖含量显著高于野生型（21.70 mg·g^-1 FW）,分别为野生型的2.87、3.39和3.35倍。可溶性固形物含量与可溶性糖含量呈正相关（r=0.811^*）,但样品果实的可溶性固形物含量间不存在显著性差异。转基因株系草莓成熟果实果肉中氨基酸含量为0.2580-0.3950 g/100 g FW,野生型果实的氨基酸含量为0.5151 g/100 g FW,显著高于各转基因株系草莓果实;转基因株系1和7的可滴定酸含量显著高于野生型;转基因株系1果实的抗坏血酸含量为168.35 mg/100 g FW,显著高于野生型（92.50 mg/100 g FW）。转基因株系9及10果实的可溶性蛋白含量分别为25.97和25.86 mg·g^-1 FW,显著高于野生型（22.93 mg·g^-1 FW）。RdreB1BI、FvCCR2cinnamoyl-CoA reductase 2-like）和FvMYB306（myb-related protein 306）在各转基因株系中表达量显著高于野生型。分析发现差异表达基因启动子区域包含多种高等植物顺势调控元件,主要有对真核生物起增强基因转录效率的CAAT-box和核心启动子元件TATA-box。同时还包含G-Box、G-box、MBS、ARE、5UTR Py-rich stretch等能影响各基因对光的响应、在苯丙烷代谢途径中起调节作用的顺式作用元件。【结论】RdreB1BI调控相关基因参与转化体果实发育和成熟,提高光的有效性,活化黄酮类生物合成通路关键基因,差异基因中均包含大量光诱导响应元件,FvCCR2及FvMYB306的表达促进了总黄酮、酚类物质及花青苷等次生代谢物的合成。转入RdreB1BI使草莓果实的多项营养成分和着色物质含量显著增加,改善了草莓的果实品质。     

醋酸对草莓果实成熟影响及其生理机制

【目的】为了研究有机酸对草莓果实成熟的影响及开发成熟调控技术。【方法】首先分析草莓果实发育期间pH值的变化;其次以清水为对照,用0.5%的醋酸对草莓大绿果进行喷施处理并结合酶联免疫法检测处理后草莓果实中内源激素水平的变化。【结果】结果表明,随着草莓果实的着色成熟,pH逐渐增加。同对照相比,0.5%醋酸处理显著抑制草莓果实的成熟;除GA_3外,0.5%醋酸处理显著促进了多种激素的积累,如IAA、IPA、GA4、ZR、MeJA、ABA和BR,尤其ABA和IAA成倍数增加。【结论】醋酸可有效延缓草莓果实的成熟,这种作用与ABA和IAA密切相关。     

氮素处理对成熟草莓果实芳香成分的影响

采用溶剂萃取法提取经不同氮素水平处理后的成熟草莓果实芳香成分，进行气相色谱-质谱联用仪(GC／MS)分析。结果表明：高量氮肥、中量氮肥、低量氮肥、不施氮肥四个处理分别检测出27种、29种、28种、26种芳香成分，各占总峰面积的94．01％，91．45％，94．79％，94．53％。各处理成熟草莓果实中特征芳香成分丁酸甲酯、丁酸乙酯、己酸甲酯、2，5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮、2，5-二甲基-4-甲氧基-3(2H)-呋喃酮等的相对含量存在差异；中量氮肥处理时特征香气成分总含量最高，不施氮肥时总含量最低。     

草莓果实发育成熟过程中超微弱发光的变化

试验以红颜草莓为材料,探讨草莓果实发育成熟过程中超微弱发光的变化及与果实发育成熟的关系。试验结果表明:草莓果实在发育成熟过程中,叶绿素含量、果实硬度、可滴定酸含量均呈现下降趋势,花青素含量、可溶性固形物含量及可溶性糖含量呈现上升趋势;超微弱发光强度随着果实的发育成熟呈逐渐下降的趋势,且超微弱发光与叶绿素、果实硬度呈显著正相关,与花青素、可溶性糖呈显著负相关。以上结果说明在果实发育过程中,随着成熟程度的增加,超微弱发光强度逐渐下降。     

ABA对草莓果实成熟和软化的调节

以‘法兰地’草莓为试材,研究草莓果实生长发育过程中内源脱落酸(ABA)含量、FaNCED基因表达量的变化以及外源ABA、去甲二氢愈创木酸(NDGA)和乙烯利处理对果实成熟软化的影响。结果表明:在草莓果实成熟过程中ABA含量和FaNCED表达量出现2次高峰,分别是花后35d(转色期)和花后45d(果实完熟期)。外源ABA促进FaNCED基因的表达及ABA的积累,促进草莓果实的成熟和后熟软化,NDGA处理表现出相反效果,喷施乙烯利表现不明显,推测ABA在草莓果实成熟和后熟软化中可能起着重要作用。     

外源乙烯利处理对草莓果实成熟与品质的影响

草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是蔷薇科草莓属多年生植物,具有味道好、营养价值高的特点,深受消费者喜爱。乙烯在草莓果实生长发育过程中具有关键作用,但其对成熟过程中品质成分的影响尚不清晰。为了明确乙烯对草莓果实成熟过程中品质成分变化的影响,通过使用外源乙烯利对不同发育时期的红颜草莓果实进行了处理。通过观察并检测处理后0、48、72 h草莓果实的外观表型、果实硬度、可溶性固形物含量、总酸含量和挥发性香气物质的变化。结果发现,外源乙烯利处理能够显著加快草莓果实的转色及色泽加深,降低果实硬度与总酸含量,促进绿果期、白果期和转色期果实可溶性固形物含量上升;与对照相比,绿果期和白果期果实在乙烯利处理后其挥发性物质的种类和总量变化差异不大,而转色期和全红期则呈现显著的差异,即相较于对照,处理后的草莓果实中含有的挥发性物质明显减少。综上结果表明外源乙烯利处理可以加速草莓果实成熟进程,促进果实着色,但却减少了果实香气含量,影响了挥发性组分的种类,降低了其香气品质。     

柿果实CCD1基因超表达和RNAi表达载体的构建

采用CTAB法提取小方柿果肉总RNA,根据带有不同酶切位点的引物获得目的基因柿类胡萝卜素裂解双加氧酶基因(DkCCD1),将扩增的目的基因序列与NCBI登录的基因序列进行核苷酸序列和氨基酸序列比对,发现核苷酸序列相似度均超过99%,氨基酸序列相似度均为100%,由此得到可用于后续试验的目的基因。将得到的目的基因与双元表达载体pCAMBIA1301连接,构建pCAMBIA1301-CCD1超表达载体和具有发卡结构的pCAMBIA1301-CCD1-RNAi表达载体,通过冻融法将载体导入农杆菌EHA105。PCR扩增结果表明:所构建的pCAMBIA1301-CCD1超表达载体和pCAMBIA1301-CCD1-RNAi载体已导入农杆菌,可用于后续的遗传转化研究。     

生长素酰胺水解酶基因在西瓜果实发育过程中的表达

生长素在植物果实发育与成熟过程中发挥重要作用,但生长素调控西瓜果实发育与成熟的分子机制尚不十分清楚。以含糖量低的野生西瓜PI296341-FR与含糖量高的栽培西瓜97103为试验材料,测定并比较了栽培与野生西瓜果实发育不同时期果实整组织游离态IAA的含量。结果表明:果实游离态IAA的含量随西瓜果实发育而上升,在授粉后18d达到峰值,后期逐步下降。含糖量高的栽培西瓜果实游离态IAA的含量在果实发育的各个阶段,均显著高于含糖量低的野生西瓜,说明果实游离态IAA的积累可能与果实成熟及含糖量积累相关。已有研究表明生长素酰胺水解酶(IAA-Leucine Resistant1-like Hydrolase,ILR1-like hydrolase,ILL)通过催化结合态生长素释放游离态生长素,是游离态生长素积累的限速酶。在西瓜全基因组上对ILL基因家族进行了系统进化树分析,通过qRT-PCR检测了西瓜各个组织的表达情况,发现西瓜果肉中只有4个ILL基因表达,并且栽培西瓜果肉中这4个基因的表达量均显著高于野生西瓜,其中,Cla017661在栽培西瓜果肉中的表达量最高,且与果实游离态IAA的含量变化趋势正相关,推测该基因对栽培西瓜游离态IAA的积累起关键作用,进而调控了西瓜果实的发育与成熟的进化。     

草莓FaAP1基因植物表达载体构建及在拟南芥中的超表达

为研究草莓AP1同源基因FaAP1的功能,构建了其植物表达载体pBI121-FaAP1,并导入到农杆菌菌株GV3101中。利用花序浸染法将该基因导入拟南芥,经抗性筛选、PCR检测表明获得了3个转化株系。结果显示,与对照相比,转基因株系明显早花,成花时间可提早10d以上;同时其营养生长受到抑制,植株个体矮小,莲座叶数目减少;在早花的同时,转化株系花器官异常,不能形成种子。表明草莓FaAP1基因参与了成花过程的调控。     

草莓果实酯类合成关键酶基因SAATB2和VAATW2表达特性分析

利用RT-PCR的方法,分别从凤梨草莓栽培品种‘红颜’和森林草莓白果类型的成熟果实中克隆酯类合成关键酶基因SAATB2和VAATW2。利用半定量RT-PCR和酶活性测定分别对SAATB2、VAATW2在不同组织和花后不同发育时间果实中的表达情况进行分析。结果发现,SAATB2主要在果实中表达,而VAATW2则在叶片和果实中都有表达,说明AAT在草莓组织中的表达特性存在种间差异。而SAATB2和VAATW2在果实发育期间具有相同的表达趋势,表达量随果实发育先升高后降低,最大表达量均出现在完全成熟前后,但达到最大值的时间略有不同。‘红颜’和森林草莓的果实挥发性酯类质量分数随果实发育升高,完全成熟时达到最大质量分数,与AAT基因表达量的变化基本一致。     

生长调节剂对草莓果实品质的影响

分别对丰香和章姬两个草莓品种喷施生长调节剂,研究生长调节剂对草莓产量和果实品质的影响。结果表明:生长调节剂对草莓生长有显著促进作用,低密度下能提高产量;果实品质得到显著改善,畸果率显著降低,果实可溶性固形物含量增加,而总酸含量下降。     

生长素和脱落酸在草莓果实发育过程中的作用

草莓果实是非呼吸跃变型果实,关于其发育成熟的机理研究较少。以八倍体草莓甜查理为试材,分析了果实发育过程中脱落酸ABA和生长素IAA的含量,同时用ABA和IAA处理转色期的草莓果实,发现ABA能加速果实着色软化,抑制IAA的积累;相反IAA抑制果实着色软化,抑制ABA的积累。进一步分析表明ABA能降低IAA合成代谢路径中基因的表达水平,而IAA能降低ABA合成代谢路径中基因的表达水平。ABA能促进果实成熟相关基因的表达,包括与果实上色有关的基因如查尔酮合酶等,和与果实软化有关的基因如伸展蛋白基因等;但IAA表现为抑制。果实上色与软化直接影响草莓成熟进程。这些结果说明ABA和IAA协同调控了草莓果实的发育进程,为以后草莓果实品质的改善和育种提供了思路。     

VIGS诱导MdHB-1沉默对苹果果实成熟的影响

为研究MdHB-1是否可调控苹果果实MdACO1表达及果实成熟进程,以‘澳洲青苹’果实为试材,通过病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术抑制果实MdHB-1表达,分析其对MdACO1表达情况和果实成熟相关指标的影响。结果显示,VIGS技术成功抑制果肉MdHB-1表达,使MdACO1表达量下调,果实的呼吸强度和乙烯释放速率受到显著抑制,果实硬度、可溶性固形物和可滴定酸质量分数的下降延缓。说明:MdHB-1不仅可以正向调控苹果果实MdACO1表达,还参与果实的成熟衰老过程。     

草莓蔗糖转运基因FaSUT5对“申阳”草莓果实糖分积累的影响

为了研究草莓蔗糖转运基因FaSUT5对申阳草莓果实糖分积累的影响,提取草莓果实总RNA并反转录为c DNA,并根据GDR数据库中已登录的栽培草莓FaSUT5的全长序列设计引物,对注射了过表达载体35s:SUT5和空载体农杆菌菌株的草莓果实进行了定量分析。研究结果表明:与注射空载体相比,注射了过表达载体的草莓果实中FaSUT5基因的表达量明显提高,蔗糖含量明显提高,而柠檬酸和苹果酸的含量显著下降。     

草莓蔗糖转运基因FaSUT5对“申阳”草莓果实糖分积累的影响

为了研究草莓蔗糖转运基因FaSUT5对"申阳"草莓果实糖分积累的影响,提取草莓果实总RNA并反转录为c DNA,并根据GDR数据库中已登录的栽培草莓FaSUT5的全长序列设计引物,对注射了过表达载体35s:SUT5和空载体农杆菌菌株的草莓果实进行了定量分析。研究结果表明:与注射空载体相比,注射了过表达载体的草莓果实中FaSUT5基因的表达量明显提高,蔗糖含量明显提高,而柠檬酸和苹果酸的含量显著下降。     

桃果实生长素结合蛋白ABP1的克隆及表达分析

ABP1是一种能够快速响应生长素信号的结合蛋白,参与细胞伸长、质膜极化、网格蛋白内吞及果实发育等生理过程。以‘24号’桃果实为试验材料,应用荧光实时定量PCR分析PpABP1在桃果实发育过程中的表达量变化,以及外施NAA对桃果实PpABP1表达量的影响。结果表明:PpABP1在桃果实中果皮和种子不同发育时期均有表达,花后52dPpABP1表达量均达到最大值;外施NAA对桃果实发育过程中PpABP1表达量的影响与发育时期相关,在桃果实硬核期,外施NAA会降低PpABP1在中果皮的表达。本试验初步证实桃果实发育过程中存在由ABP1介导的信号转导途径,PpABP1在桃果实中的表达存在发育特异性。