温泉土壤宏基因组文库构建及普鲁兰酶筛选

[目的]构建温泉土壤宏基因组文库并进行普鲁兰酶活性筛选,以期获得高活力、耐高温的新型普鲁兰酶基因.[方法]采用间接法提取温泉土壤样品中宏基因组DNA,经Sephadex G200（含2％ PVPP）凝胶柱和电洗脱两步纯化后,扩增16S rRNA序列,通过序列比对和系统发育进化树分析温泉土壤微生物的多样性;然后以pCC1FOS为载体构建温泉土壤宏基因组文库,并对所获得的宏基因组文库进行活性筛选.[结果]利用宏基因组技术提取温泉土壤样品中微生物的基因组DNA,构建了一个约含1 146个克隆的温泉土壤16S rRNA文库,经遗传进化分析,发现温泉土壤样品中的大部分微生物未被研究过,主要来源于厚壁菌门（Firmicutes）,其次为恐球菌—栖热菌门（Deinococcus-Thermus）和变形杆菌门（Proteobacteria）.用提取获得的宏基因组DNA成功构建了温泉土壤微生物宏基因组Fosmid文库,文库约含2.7万个克隆,平均插入片段长度为40.0 kb,文库外源DNA总容量为1.2×10^9bp;通过活性筛选共获得9个可表达普鲁兰酶活性的克隆.[结论]宏基因组文库技术是获取极端环境微生物新酶的有效手段,可为进一步挖掘普鲁兰酶的应用潜力及研究其耐热机理奠定基础.     

牛瘤胃未培养细菌中一个β-葡萄糖苷酶基因umbgl3A的克隆及鉴定

通过构建牛瘤胃未培养细菌的宏基因组文库,共获得12 000个克隆,文库外源DNA总容量为4.2×108 bp,筛选得到九个表达β-葡萄糖苷酶活性的克隆,并对其中的一个表达β-葡萄糖苷酶活性的克隆pGXN1009进行亚克隆,将β-葡萄糖苷酶基因定位在4.3 kb的片段上.测序结果表明在4.3kb的片段上有一个全长为1956 bp的ORF,编码一个可能的β-葡萄糖苷酶基因umbgl3A,其编码产物与一个来源于小鼠大肠未培养细菌的β-葡萄糖苷酶(GenBank Acession NOAAX16378.1)一致性为63%、相似性为79%;与哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)的β-葡萄糖苷酶(GenBank Acession NOZP-00308419)的一致性为50%、相似性为67%.利用SMART软件对Umbgl3A结构组件预测表明,Umbgl3A包含一个家族3糖基水解酶(glycosyl hydrolase)功能域和一个家族3C糖基水解酶功能域.遗传进化分析表明umbgl3A基因可能是来自牛瘤胃微生物噬纤维菌属未培养的一个种.     

稻田土壤细菌宏基因组文库构建

为了从土壤宏基因组文库中筛选获得具有微生物农药活性的化合物及其基因簇,本研究构建了稻田土壤细菌宏基因组文库.采用直接裂解法提取土样DNA并对其纯化,之后RFLP-PCR分析土样DNA中细菌16S rDNA 基因的多样性,最后以提纯的土壤DNA为外源片段,以Fosmid载体构建了土壤宏基因组文库.提取纯化后的DNA片段大于23kb,RFLP-PCR分析土样DNA具有丰富的遗传多样性,构建获得的土样宏基因组文库约含10 000个克隆子,文库容量为3.56×10(8)bp.本研究掌握了构建土壤宏基因组文库的方法,构建的宏基因组文库可为后续的文库筛选以及获得绿色环保的微生物农药奠定了基础.     

宏基因组技术在筛选未培养微生物中新型酶的研究进展

介绍了宏基因组文库的构建及酶基因的筛选方法,对瘤胃、土壤及其他环境中微生物宏基因组文库的构建和酶基因的筛选研究进行了综述,同时就宏基因组技术在未培养微生物研究中的应用进行了展望。     

β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因在粟酒裂殖酵母中的表达及功能分析

【目的】克隆绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因,并在粟酒裂殖酵母细胞中进行表达分析。【方法】利用PCR技术,从绿色木霉中克隆纤维素酶β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,再通过XhoⅠ和NotⅠ2个酶切位点与粟酒裂殖酵母表达载体pREP5N连接,构建酵母真核表达载体,利用电转化方法转化粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞,并在SP-Q01中进行表达分析,最后采用DNS法测定表达产物的酶学活性。【结果】PCR扩增得到2 380bp的bglⅠ基因序列,包括完整的CDS序列和信号肽序列,编码序列与已报道的里氏木霉纤维素酶基因序列相似性为100%;对酵母转化子进行诱导培养后,SDS-PAGE电泳检测得到大小为76ku的目的蛋白条带,在SP-Q01细胞中重组酶活性最高达155U/mL,最佳培养时间为72h,产生酶活的最适温度为60℃。【结论】成功克隆出了绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,该基因能在粟酒裂殖酵母细胞中成功表达,为绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的深入研究和应用奠定了基础。     

肠道微生物宏基因组文库构建及酯解酶基因筛选

利用宏基因组学方法,以人肠道微生物样品为原材料,构建了1个约30 000个克隆的fosmid文库.以三丁酸甘油酯为底物,通过功能筛选,获得1个酯解酶阳性克隆.对该阳性克隆构建亚克隆,挑选具有酯解酶活性的阳性亚克隆进行测序分析,最终获得1个肠道微生物来源的酯解酶基因(GenBank登录号:JQ972699).结果表明,文库克隆的平均插入片段约为40 kb,没有重复插入片段克隆.获得的酯解酶基因推演蛋白与Pyramidobacter piscolens W5455的patatin样磷脂酶同源性最高,氨基酸一致性为95％.生物信息学分析结果表明该基因可能通过Vd型分泌方式进行分泌并发挥功能.本研究是通过构建人肠道微生物宏基因组大片段文库并结合重组子功能筛选获得酯解酶的首次报道,可为食品工业提供新的酯解酶来源和筛选方法.     

番茄灰霉病病株根际土壤宏基因组文库的构建

利用宏基因组DNA提取试剂盒提取番茄灰霉病病株根际土壤微生物宏基因组DNA,经PstⅠ和HindⅢ双酶切,回收1-5kb大小的片段,与经过相同酶酶切的PblueScriptⅡKS（＋）质粒载体相连接,转入大肠杆菌DH5a,构建了番茄灰霉病病株根际土壤微生物宏基因组文库。     

有机磷污染土壤和活性泥中有机磷降解酶基因和微生物多样性研究

采用珠磨法直接从受有机磷污染的土壤和活性泥样品中提取和纯化宏基因组DNA。根据有机磷降解酶基因保守区设计引物,从宏基因组中扩增有机磷降解酶基因片段。回收扩增产物后,构建了以pEASY-T3为载体的有机磷降解酶基因片段文库。从文库中随机挑选克隆进行DNA序列测定,并分析测序结果,评价有机磷污染土壤和活性泥中有机磷降解酶基因的多样性和新颖性。结果显示,88%土壤来源序列与GenBank中同类酶序列相似性在44%~65%之间,97%活性泥来源序列与GenBank中同类酶的相似性在23%~77%之间,且序列多样性极为丰富,显示在有机磷污染土壤和活性泥中含有丰富和新颖的有机磷降解酶基因资源。同时采用PCR-DGGE的方法对有机磷污染土壤和活性泥中微生物多样性进行了初步研究。     

稻瘟病抗性鉴定田土壤宏基因组文库构建及分析

从稻瘟病抗性鉴定田中提取土壤微生物宏基因组DNA,EcoRⅠ和BamHI双酶切后插入到经同样双酶切的pSK 载体中,转化至DH5α感受态细胞,构建了土壤微生物宏基因组文库。随机挑选了9个克隆测序,并通过NCBI的Blastx分析了序列可能所属的物种和基因。结果其中有6个能与库中序列达到较大匹配,3个的分析结果表明可能是新基因,说明所建文库的生物多样性和新基因数较丰富。     

叶围微生物宏基因组文库的构建和分析

宏基因组文库技术是开发利用未培养微生物基因资源的有效途径。采用CTAB-SDS法直接从植物叶面沉积样品中提取基因组DNA,构建了以puc19为载体的基因组文库,共获得8126个阳性克隆,文库DNA总容量约30.1MB,平均插入片段长度为3.8kb。叶围微生物基因组文库的成功构建,对于以后研究植物和叶围微生物的关系有重要意义。     

宏基因组技术构建土壤宏基因组文库研究进展

土壤中大部分的微生物不能被培养,从而限制了对土壤微生物的开发利用,宏基因组技术可以解决这一难题,成为开发微生物资源的一种工具.阐述了宏基因组文库的构建、土壤宏基因组文库的特点及筛选文库获得的一些成果,并分析了构建土壤宏基因组文库存在的问题.     

多粘类芽孢杆菌CP7β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆、表达及应用

【目的】克隆多粘类芽孢杆菌(Paenibaccillus polymyxa)CP7的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因,构建高效表达工程菌株,为CP7菌的抗菌活性组分研究和开发利用以及葡聚糖酶在农业生产中的应用提供理论依据。【方法】通过CP7菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及原核表达构建工程菌株,采用平板对峙培养和生长速率测定法研究重组酶对供试真菌的生长抑制活性,同时采用体外消化法研究该酶对麦类饲料消化率的影响。【结果】成功克隆目的基因并在原核系统获得高效表达。重组酶蛋白对4种供试真菌菌丝生长具有明显抑制作用,平均抑制率高达40%以上;添加了重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的处理组样品,经体外消化后黏度降低了4.69%(P﹥0.05)。【结论】β-1,3-1,4-葡聚糖酶是CP7菌发酵液中抗真菌活性组分或其中之一,对真菌生长抑制的活性作用提示其可作为农业抗病虫害新型药物进行开发研究;该酶能够有效降低麦类饲料黏度,表明其作为饲料添加剂的开发利用同样具有良好前景。     

土壤磷酸酯酶基因的筛选、克隆及酶学性质分析

利用宏基因组学的方法构建红树林土壤宏基因组文库,然后采用以三丁酸甘油酯为底物的功能筛选法对文库进行磷酸酯酶基因的筛选,并对磷酸酯酶基因进行克隆及酶学性质分析。经筛选获得1个具有酯水解活性的阳性克隆子,该克隆子含有1个1 545bp的ORF,可编码514个氨基酸,命名为phop1545。该基因表达的蛋白属于新的酯水解酶类亚家族,其分子质量约为57kD。该磷酸酯酶的最适pH值为5.5,温度为56℃,表明该酶为酸性磷酸酯酶且耐高温。     

一种直接用于PCR的土壤微生物DNA提取方法

以橡胶林土壤为材料,直接提取土壤微生物DNA。本实验介绍的方法不仅可以获得大片段,并且不需要纯化即可直接用于PCR扩增和DNA酶切等后续操作,每克土壤DNA提取量约为2.1～4.6μg。此方法操作简单、快捷、为土壤宏基因组文库的构建和土壤微生物群落结构的多样性分析提供基础。     

独龙牛瘤胃细菌纤维素酶基因克隆

[目的]从分子生物学水平对独龙牛的瘤胃纤维素酶基因资源进行筛选及酶学特性研究,为后续开发利用新的纤维素酶提供参考依据,也为揭示瘤胃微生物降解纤维素的作用机理打下基础.[方法]提取独龙牛瘤胃微生物中的大片段基因组DNA,构建瘤胃微生物基因组文库,并进行纤维素酶活性筛选,筛选获得的高活性基因经测序后进行生物信息学分析与酶学性质研究.[结果]从独龙牛瘤胃中共获得20352个阳性克隆,白斑率达92%,构建的瘤胃微生物基因组文库容量899.6 Mb,空载率1.82%.从瘤胃微生物基因组文库筛选获得2个具有纤维素酶活性的阳性克隆(B1和B2),其中,B1基因序列长1230 bp,编码409个氨基酸,基因编码产物与来自Ruminococcusalbus纤维素酶基因编码产物(β-1,4-内切葡聚糖酶,GenBank登录号P23661.1)的覆盖率高达99%,其同源性高达97%;B2基因序列长1002 bp,编码333个氨基酸,基因编码产物与Unculturedmicroorganism纤维素酶基因编码产物(纤维糊精酶,GenBank登录号ADB80112.1)的覆盖率高达99%,其同源性为83%.B1和B2基因可在Rosetta原核表达宿主菌中成功诱导表达,B1纤维素酶的最适pH为6.0,最适温度40℃;B2纤维素酶的最适pH为6.0,最适温度40~50℃.[结论]从构建的独龙牛瘤胃微生物基因文库中筛选获得2株具有较高活力的纤维素酶(B1和B2),其中,B1为β-1,4-内切葡聚糖酶,而B2为新的纤维糊精酶,可为纤维素的体外降解提供新型材料.     

土壤宏基因组中抗草甘膦新基因的克隆及其功能验证

【目的】从土壤宏基因组中克隆新的抗草甘膦新基因,并对其功能进行验证,为培育抗除草剂转基因新品种奠定基础。【方法】利用被草甘膦污染的土壤建立宏基因组文库,经筛选从中成功克隆了一个新的具有草甘膦抗性的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因(命名为soilA)。构建了Prrn启动子驱动soilA基因的原核表达载体pSYTH-soilA,将其导入大肠杆菌进行原核草甘膦抗性试验,构建了35S启动子驱动soilA基因的植物表达载体pC330E,利用农杆菌介导法转化烟草,并对经PCR和胶体金试纸条鉴定的转基因烟草植株进行草甘膦耐受能力检测。【结果】序列分析表明,所获得的soilA基因长1 347bp,编码448个氨基酸,经BLAST分析,结果表明其属于ClassⅡ型EPSPS基因家族。原核表达soilA可使受体菌具有耐受1 200mmol/L草甘膦。构建soilA植物表达载体pC330E,通过农杆菌介导法将其导入烟草,经PCR和胶体金试纸条检测共获得107株阳性烟草植株,经过喷洒试验获得了3株高耐受草甘膦植株,这3株转基因烟草最高可耐受200mmol/L草甘膦。【结论】新克隆的编码EPSPS的soilA基因能够提高受体材料的草甘膦耐受能力。     

耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

【目的】研究耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达,并检测其酶学性质,为耐热β-半乳糖苷酶的应用和工业化生产奠定基础。【方法】利用基因工程的原理和方法,将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆到大肠杆菌pET表达系统(pET-28a(+)),并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。将构建的重组菌(pET28a-bgaB)在含硫酸卡那霉素的液体LB培养基中以IPTG为诱导剂,对表达产物的最适反应温度、最适反应时间I、PTG诱导浓度、热稳定性及酶促动力学进行检测。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bgaB,并测得耐热β-半乳糖苷酶的最适反应温度为65℃,最适反应时间为6 h,IPTG的最佳诱导浓度为1 mmol/L,且具有良好的热稳定性;在诱导后6 h,耐热β-半乳糖苷酶的表达量占菌体总可溶性蛋白的20%,表达效率较高;对透析蛋白进行蛋白质定量,蛋白质量浓度为0.75 mg/mL,透析蛋白的耐热β-半乳糖苷酶活性为75 U/mL,比活性为100 U/mg;酶促动力学研究表明,耐热β-半乳糖苷酶的反应常数为0.398μmol/mL,最大反应速度为27.435μmol/(min.mL)。【结论】耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中得到成功表达,并且在很大程度上提高了耐热β-半乳糖苷酶的活性。     

酒酒球菌β-葡萄糖苷酶产酶条件优化及酶学性质研究

【目的】优化酒酒球菌中β-葡萄糖苷酶的产酶条件,分析β-葡萄糖苷酶的性质,为将其应用于葡萄酒生产提供参考。【方法】对12株酒酒球菌进行β-葡萄糖苷酶活性测定,选择其中β-葡萄糖苷酶活性最高的菌株CS-7b作为试验菌株,并以商业菌株31-DH为对照,以菌株催化底物对硝基苯酚-β-葡萄糖苷(p-NPG)生成对硝基苯酚的速度衡量β-葡萄糖苷酶活性高低。然后通过单因素试验和正交试验对菌株产β-葡萄糖苷酶的条件进行优化,并探究葡萄酒环境相关因素(pH值、温度、乙醇体积分数、葡萄糖质量浓度)对β-葡萄糖苷酶活性的影响。【结果】单因素试验确定菌株产β-葡萄糖苷酶培养基的最佳pH值为6.8,最佳碳源为麦芽糖,最佳氮源为酵母浸粉,正交试验进一步确定了各种成分的最佳配比,即每升液体培养基中含麦芽糖7g,酵母浸粉20g,MgSO_4·7H_2O 0.1g,盐酸半胱氨酸0.5g,MnSO_4·4H_2O 0.03g,培养基起始pH值为6.8,在此条件下,β-葡萄糖苷酶活性可由0.359增加到1.319μmol/(g·min)。β-葡萄糖苷酶的酶学性质为:最适pH值为5.0,最适温度为37℃;当乙醇体积分数大于4%、葡萄糖质量浓度大于1g/L时,β-葡萄糖苷酶活性开始受到抑制。【结论】酒酒球菌CS-7b在葡萄酒环境的pH及乙醇体积分数条件下仍可保持一定的β-葡萄糖苷酶活性。     

山羊瘤胃微生物宏基因组文库中一个新型纤维素酶 基因的克隆与表达

通过功能筛选方法,从安徽白山羊瘤胃微生物宏基因组文库中筛选得到了6个纤维素酶的阳性克隆。对其中的1个阳性克隆进一步进行亚克隆和序列分析,获得一个新型纤维素酶基因开放阅读框,通过BLAST对基因全序列进行分析比较,发现其与来自Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838的hypothetical protein具有51%的序列相似性和65%的同源性。并以p ET28a(+)为载体、Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌,对新型酶基因进行高效重组表达,并对该酶表达条件进行优化。     

黄淮白山羊瘤胃微生物Fosmid文库的构建与分析

采用CTAB法和蛋白酶K法提取黄淮白山羊瘤胃微生物总DNA,酶切获得DNA片段,大小为23～50 kb,以E.coli EPI300为宿主细胞,构建瘤胃微生物宏基因Fosmid文库。研究发现该文库共获得克隆28 800个,插入片段大小约35 kb,空载率小于2%,容量1 008 Mb。通过羧甲基纤维素酶和木聚糖酶(Xylanase)活性筛选,分别获得具有两种酶活性的阳性克隆60和32个,木聚糖酶和羧甲基纤维素酶(CMC,Carboxymethyl cellulase)共同作用阳性克隆15个。通过已测序MF3木聚糖酶阳性克隆酶学活性分析,该木聚糖酶在最适应pH 4.5, 40℃条件下,酶活力为79.287μ·mL~(-1)。为进一步研究黄淮白山羊瘤胃内纤维素酶(Cellulase)基因奠定基础。