细粒棘球绦虫原头蚴lncRNA表达谱分析

本研究旨在解析lncRNA在细粒棘球绦虫原头蚴中的表达谱特性,为进一步揭示lncRNA在细粒棘球绦虫原头蚴发育中的作用及调控机制提供理论依据。从患病绵羊肝无菌采集细粒棘球绦虫原头蚴,提取总RNA,构建原头蚴lncRNA文库,利用RNA sequencing技术进行测序分析。结果表明,首次从细粒棘球绦虫原头蚴中鉴定出609个新的lncRNA分子。其中intergenic lncRNA有431个,intronic lncRNA有11个,anti-sense lncRNA有68个,sence lncRNA有99个。GO分析表明,其表达量前200的lncRNA分子主要与MAP激酶的负调控、SMC结合复合物、IMP的生物合成以及乙酰转移酶激活剂活性相关。KEGG分析结果表明,其表达量前200的lncRNA分子主要与细胞凋亡、萜类骨架生物合成、碳代谢以及背腹轴形成相关。cis分析结果表明,在这609个新的lncRNA分子中,与虫体Wnt信号通路、Hedgehog信号通路、NF-κB信号通路、cAMP信号通路、Notch信号通路、胆酸盐信号通路以及背腹轴信号通路相关的lncRNA分子分别有79、31、10、128、43、84和73个。qRT-PCR的验证结果表明,表达量前10的lncRNA分子与测序结果一致。RNA荧光探针原位杂交结果表明,高表达的lncRNA分子在细粒棘球绦虫原头蚴吸盘以及表皮均有表达。综上所述,本研究首次解析了细粒棘球绦虫原头蚴中lncRNA的表达谱特性,丰富了细粒棘球绦虫lncRNA的数据,为进一步解析lncRNA在细粒棘球绦虫原头蚴发育中的作用奠定了基础。     

基于转录组测序分析细粒棘球绦虫原头蚴与巨噬细胞RAW264.7免疫互作相关基因

旨在解析细粒棘球绦虫原头蚴与巨噬细胞RAW264.7免疫互作相关的基因,为进一步阐明细粒棘球绦虫原头蚴调控宿主免疫反应及寄生适应机制提供理论依据。将细粒棘球绦虫原头蚴和巨噬细胞RAW264.7共培养24 h,收集原头蚴和RAW264.7细胞,提取总RNA,构建cDNA文库,利用RNA sequencing技术进行转录组测序分析。当细粒棘球绦虫原头蚴与巨噬细胞RAW264.7共培养24 h后,和0 h对照组相比,原头蚴处理组分别有435个基因的表达出现显著差异变化,其中,上调表达的基因为227个,包括HSP70、HSP10、Eg95前体分子、AgB、FABP和囊泡运输蛋白SC22B等;下调表达的基因为208个,包括EF-hand蛋白、Cathepsin、跨膜蛋白144、内固醇类受体和MAPK7等。GO分析结果表明,差异表达的基因主要富集在血红素转运、铁配位实体运输、细胞外间质、核糖核酸酶MRP复合物、丝氨酸型内肽酶抑制剂活性以及α-半乳糖苷酶活性等过程。KEGG分析结果表明,差异表达的基因主要参与剪接体、内吞作用、内质网的蛋白质处理、吞噬体、MAPK信号通路以及钙信号通路等。当巨噬细胞RAW264.7与细粒棘球绦虫原头蚴共培养24 h后,和PBS对照组相比,原头蚴处理组的RAW264.7细胞共有3 745个基因的表达出现显著变化,其中,1 159个基因出现上调表达,2 586个基因出现下调表达。GO分析结果显示,差异表达基因主要富集在代谢过程、细胞内组分、细胞内、细胞器以及膜结构细胞器等。KEGG信号通路的分析结果表明,差异表达的基因主要参与代谢通路、核糖体通路、剪接体通路、RNA转运以及泛素介导的蛋白水解等通路。同时研究随机选取了部分差异表达的基因进行了qRT-PCR验证,结果表明,其表达趋势与RNA-seq结果一致。综上所述,当细粒棘球绦虫原头蚴面对宿主巨噬细胞免疫压力时,可引起其基因的差异表达,其中,原头蚴中的AgB、FABP1和Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂等具有免疫调节作用的分子表达明显上调,推测其可能参与宿主的免疫调控,进而有利于虫体在宿主的寄生和免疫逃避。     

细粒棘球绦虫原头蚴蛋白表达谱分析

旨在探索细粒棘球绦虫原头蚴蛋白表达特性,揭示在此发育阶段虫体主要的功能蛋白以及信号通路,为揭示虫体的发育调控、筛选疫苗以及药物靶标奠定基础。本试验采用LC-MS/MS技术对虫体原头蚴表达的蛋白质进行研究,然后对获得数据进行GO、KOG以及KEGG等分析;最后采用qRT-PCR和原位杂交技术对鉴定得到的Wnt信号通路的关键基因β-catenin进行了差异表达和组织定位研究。结果显示,本研究共鉴定得到7 172个肽段,1 197个蛋白质,其中包括多个潜在的抗原蛋白质,如四跨膜蛋白超家族、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、表皮抗原蛋白和烯醇酶等。信号通路分析结果显示其中632个蛋白参与276个调控通路,诸如与虫体发育紧密相关的Wnt、Notch、Hedgehog、NF-κB、cAMP以及胆酸盐信号通路。对β-catenin的验证结果显示,此基因分布于细粒棘球绦虫原头蚴顶突的小刺以及散在的细胞中,同时其相对转录量在体外培养0~10d的过程中呈递减趋势。综上,本研究解析了细粒棘球绦虫原头蚴的蛋白质表达元件,揭示了原头蚴主要的调控信号通路,为虫体的生长发育机制以及包虫病的有效防控提供了理论依据。     

Th1/Th2型免疫反应相关基因在巨噬细胞RAW 264.7应对细粒棘球绦虫原头蚴刺激时的表达谱研究

本研究旨在解析巨噬细胞RAW264.7在应对细粒棘球绦虫原头蚴刺激时其Th1、Th2型免疫反应相关基因的差异表达规律,为进一步揭示巨噬细胞抗细粒棘球绦虫原头蚴免疫调控机制奠定理论基础.将细粒棘球绦虫原头蚴和巨噬细胞RAW264.7共培养6、24、72 h,收集RAW264.7细胞,提取总RNA,构建cDNA文库,利用R...     

细粒棘球绦虫脂肪酸去饱和酶1基因序列及不同发育阶段表达分析

旨在寻找细粒棘球绦虫发育相关基因,为预防和治疗细粒棘球绦虫引起的包虫病而制定相应的措施提供理论基础。通过分析细粒棘球绦虫原头蚴高通量转录组测序数据文库,对Unigene进行KEGG通路分析,筛选出一个脂肪代谢通路,并筛选出该通路中主要的调控基因脂肪酸去饱和酶1。通过对Eg-FADS1基因的PCR扩增,分析其核苷酸序列及氨基酸序列,用实时荧光定量PCR和全量组织原位杂交检测Eg-FADS1基因在不同发育阶段的表达情况。结果显示,该基因具有完整的开放阅读框,cDNA全长为819bp,编码272个氨基酸,预测该蛋白分子质量为30.98ku,等电点为7.10。实时荧光定量PCR结果表明,Eg-FADS1基因在原头蚴及成虫阶段均有表达,并且该基因在成虫阶段极显著高于原头蚴阶段的表达量。全量组织原位杂交结果显示,Eg-FADS1mRNA在原头蚴及成虫阶段分布广泛。提示Eg-FADS1具有生物防治作用,值得进一步研究。     

细粒棘球绦虫TSP8基因在其不同发育阶段的差异表达及生物信息学分析

为研究细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,E.g)TSP8基因的分子特性以及其在虫体不同发育阶段的差异表达,根据NCBI GenBank数据库中的TSP8基因设计1对特异性引物,对TSP8基因进行PCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T载体后测序,通过生物信息学软件分析预测TSP8基因的结构与功能,并通过SYBR Green Ⅰ qRT-PCR方法分析TSP8基因在虫体原头蚴、包囊壁以及成虫mRNA相对转录情况。结果显示：成功克隆到细粒棘球绦虫TSP8基因序列,与细粒棘球绦虫跨膜蛋白(GenBank登录号：CDS17460.1)同源性为100%;进一步生物信息学分析显示,TSP8基因全长669个核苷酸,编码222个氨基酸,理论等电点为5.06,为稳定蛋白分子;TSP8基因编码的氨基酸序列共含有5个跨膜区域,含有4个优势B抗原表位;qRT-PCR结果显示TSP8基因在原头蚴及成虫阶段均有表达,差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。本研究对细粒棘球绦虫TSP8基因的分子特性进行了初步研究,为进一步揭示其生物学功能奠定了基础。     

细粒棘球绦虫TSP33基因的克隆、生物信息学及表达分析

旨在分析细粒棘球绦虫TSP33基因的结构及其在细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达情况,预测其作为细粒棘球绦虫诊断抗原的潜在价值。从GenBank中获得Eg-TSP33的cDNA序列并设计特异性引物,提取原头蚴总RNA,反转录cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆到大肠埃希菌中,测序并进行生物信息学分析。TSP33cDNA全长864bp,编码277个氨基酸,Eg-TSP33的预测分子质量为32.11ku,预测等电点为8.62。RT-PCR结果显示,Eg-TSP33在细粒棘球绦虫成虫、包囊壁及原头蚴中均有表达,且在包囊壁中表达量较多。结果说明,Eg-TSP33可能在细粒棘球绦虫发育过程中可能具有重要作用,为Eg-TSP33分子的诊断价值研究奠定了基础。     

X射线照射后对细粒棘球绦虫原头蚴体外培养成囊率的观察

观察X线照射后细粒棘球绦虫原头蚴体外培养下成囊率的变化,初步探索X线照射对原头蚴成囊过程的影响。新鲜采集自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏,无菌分离原头蚴体外培养,将X线照射分为0,10,20,30,40,50,60 Gy共7个剂量,于单次大剂量照射后观察各组形态变化,计算成囊率。结果显示,单次大剂量照射原头蚴后体外培养14 d,对照组光镜下可见原头蚴成囊发展,大部分原头蚴已成囊,顶突消失,囊外周已有角质层出现;而照射组出现不同程度的钩突崩解,正常结构消失。不同剂量X线照射后14 d统计原头节的成囊率各不同剂量照射组与对照组比较差别有统计学意义(P0.05)。结果表明,X放射线可抑制细粒棘球绦虫原头蚴向成囊方向发展,这将为X线对原头蚴及包囊的杀灭作用机制研究奠定一定的理论基础。     

细粒棘球绦虫EgM123基因序列分析及EgM家族基因在虫体不同发育阶段的差异表达分析

对细粒棘球绦虫EgM123基因进行分子克隆和生物信息学分析,同时对EgM家族基因在虫体不同发育阶段的mRNA转录水平进行初步研究。采集绵羊肝脏包囊中原头蚴,提取总RNA,通过RT-PCR获取EgM123纯化的PCR产物,克隆到pGEM-T载体并测序,对测序结果进行结构和功能的预测分析。以Actin基因为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术,对不同发育阶段,即其原头蚴和成虫的EgM4、EgM9、EgM123的表达量进行检测。结果表明,EgM123基因ORF为594bp,编码197个氨基酸,蛋白分子质量为21.959ku,等电点为7.94。EgM123蛋白无信号肽、跨膜螺旋区和卷曲螺旋结构,是一种亲水性的可溶性蛋白质,存在23个磷酸化位点。根据亚细胞定位预测显示,EgM123蛋白主要位于细胞核内。二级结构预测含α-螺旋9.64%、β-折叠22.84%、无规则卷曲62.94%。EgM123氨基酸序列中有6个潜在的抗原表位。RT-qPCR结果显示,成虫阶段EgM家族基因表达量极显著高于原头蚴阶段。在发育的同一阶段,EgM123基因极显著高于EgM4、EgM9基因的表达量。通过EgM家族基因在虫体不同发育阶段的mRNA转录水平,EgM123基因在虫体成虫阶段高表达,以期为筛选细粒棘球绦虫终末宿主疫苗候选基因提供理论依据。     

细粒棘球绦虫幼虫——原头蚴感染比格犬(Beagle)试验

以比格犬为实验动物经口感染原头蚴,观察细粒棘球绦虫的感染情况.6只比格犬分为3组,每组2只,每组感染原头蚴的剂量分别为5万、15万、25万枚/只,感染后40 d开始检查粪便有无虫卵排出.结果显示:人工感染原头蚴后48 d虫体开始排卵;6只比格犬(Beagle)细粒棘球绦虫人工感染率为100%,其中5万枚组感染的平均荷虫3 457条(成熟2 074条,未成熟1 383条);15万枚组感染的平均荷虫6 230条(成熟3 639条,未成熟2 591条);25万枚组感染的平均荷虫16 238条(成熟11 856条,未成熟4 382条).结果表明,比格犬(Beagle)可以成为感染细粒棘球绦虫研究的动物模型.     

细粒棘球绦虫EGR-03347基因的原核表达及其对小鼠免疫效果的初步研究

为了阐明细粒棘球绦虫3-羟基酰基-CoA脱氢酶基因(EGR-03347)生物学功能及其免疫原性,本研究通过分析已发表细粒棘球绦虫原头蚴高通量mRNA测序数据,从中筛选出细粒棘球绦虫脂肪酸代谢主要的调控基因之一—EGR-03347,将其克隆于原核表达载体pET-32a中,构建的重组质粒经诱导、纯化后通过SDS-PAGE及...     

包虫病的防治效果

<正>危害牛羊的包虫病主要有细粒棘球蚴病、多头蚴病、细颈囊尾蚴病(也称三蚴病)。成虫隶属带科的细粒棘球绦虫、多头带绦虫和泡状带绦虫的中期绦虫体,即包虫囊,终宿主感染原头蚴发育为     

细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆、表达及诊断价值的初步评价

探究细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基本特性并初步评价其诊断价值,旨在为细粒棘球绦虫的防控提供依据。本研究原核表达出Eg-cystatin重组蛋白并对其进行生物信息学、免疫印迹分析,用荧光免疫定位的方法检测该蛋白质的分布情况,并以绵羊细粒棘球蚴阳性血清评价Eg-cystatin重组蛋白的诊断价值。结果如下:Eg-cystatin生物信息学分析结果显示,该蛋白质含有一个N端信号肽以及cystatin结构域,是典型的2型半胱氨酸蛋白酶抑制剂,进化树分析显示Eg-cystatin属于绦虫cystatinⅡ型,并且与其他绦虫的cystatin相似性为72.20%~80.66%,免疫荧光定位发现该蛋白质主要分布在原头蚴的表皮和顶突钩,生发层,成虫虫体内部和虫卵。基于Eg-cystatin建立的间接ELISA方法的特异性为79.1%,敏感性为83.3%,与剖检符合率为81.25%。Eg-cystatin在成虫和幼虫时期均有表达,提示该基因与虫体生命活动息息相关,但Eg-cystatin蛋白不适合作为绵羊细粒棘球蚴病的诊断抗原候选。     

细粒棘球绦虫基因型与抗原研究进展

细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,坛）是一种重要的人兽共惠寄生虫。现已报道细粒棘球绦虫有10个基因型（G1～G10）,我国仅发现G1和G6。细粒棘球绦虫六钩蚴阶段的Eg95,原头蚴阶段的EgFABP,成虫阶段的EgM9和Eg31分别被认为是最有前途的用于免疫保护的抗原。其中Eg95基因工程疫苗已经商业化生产,对羊免疫保护率达到了95％以上。     

细粒棘球绦虫铜锌超氧化物歧化酶基因的表达与特征分析

旨在探讨Eg-SOD基因的特征及其在细粒棘球绦虫上的抗氧化作用。通过原核表达得到重组Eg-SOD,对其进行酶活性测定、免疫印迹、ELISA以及免疫荧光定位分析。经原核表达出的重组Eg-SOD蛋白为可溶性蛋白,以羟胺法测定其酶学活性,可达(464.55±19.99)U·mg-1。免疫印迹结果显示,该蛋白质能够被实验室人工感染细粒棘球蚴的小鼠阳性血清所识别,具有较强的反应原性;ELISA分析显示,重组Eg-SOD对人工感染细粒棘球蚴的小鼠血清和自然感染包虫病的绵羊血清检出率均为100%,而对细颈囊尾蚴的交叉反应为37.5%,提示该蛋白质可以作为潜在的诊断候选分子。免疫荧光定位显示该蛋白质广泛分布于成虫和原头蚴的组织间隙,以及少量分布于表皮。本研究对Eg-SOD的特点进行了初步的探讨,并揭示该蛋白质与虫体的抗氧化损伤有着密切的联系。     

人工感染细粒棘球蚴犬粪中蛋白质组的分析

收集感染细粒棘绦虫原头蚴后不同时间的犬粪,分离和提取蛋白质,对蛋白质在胶内酶切后,依次进行质谱分析、生物信息学和蛋白质功能富集分析。结果发现,在犬粪中共鉴定出蛋白质3 242个,其中宿主(犬)蛋白有3 107个、细粒棘球绦虫蛋白有135个。蛋白质功能富集结果显示,犬感染细粒棘球绦虫后,寄生虫与宿主相互作用,虫体在不同时间分泌特定蛋白,而蛋白质的分子生物学功能存在一定差异。研究结果对建立粪抗原诊断方法和研究细粒棘球绦虫感染宿主后的代谢途径及其生活机制提供了重要依据。     

细粒棘球绦虫——原头蚴在两种细胞培养液中体外培养的初步观察

通过原头蚴在两种细胞培养液中（RPMI-1640和MEM）培养,观察其存活、生长及发育情况,从而为研究寄生虫发育提供最基本的数据资料。方法：细粒棘球绦虫幼虫——原头蚴培养的细胞培养基（RPMI-1640和MEM）分为4组：Ⅰ组为纯RPMI-1640培养液;Ⅱ组为含10％的小牛血清的1640培养液;Ⅲ组为纯MEM培养液;Ⅳ组为含10％的小牛血清的MEM培养液;并进行对比观察。结果：培养15d的原头蚴的成活率分别为：Ⅰ组69．87％、Ⅱ组80．35％、Ⅲ组50．25％、Ⅳ组60．32％;成囊率分别为：Ⅰ组80．58％、Ⅱ组90．25％、Ⅲ组35．65％、Ⅳ组45．89％;头节外翻率分别为：Ⅰ组95．50％、Ⅱ组98．65％、Ⅲ组60．52％、Ⅳ组70．98％。结论：大多数虫体在早期向囊发育,一部分虫体头节外翻,并伴有规律的伸缩运动,但随时间的延长虫体运动减缓,又向囊蚴发育。通过对细粒棘球绦虫的原头蚴的体外培养,初步表明含有10％小牛血清的细胞培养基RPMI-1640较适合原头蚴的生长发育,在普通培养箱中培养,最适温度在37—40℃,培养液pH=7．2,初步建立了原头蚴体外培养的方法。     

扩展莫尼茨绦虫wnt基因在虫体不同发育体节的差异表达

研究扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)wnt基因家族wnt1、wnt2、wnt4、wnt5和wnt11B5个基因在虫体不同发育体节的差异表达及组织分布规律,为进一步揭示Wnt信号通路在扩展莫尼茨绦虫发育中的作用奠定基础。作者采用SYBR GreenⅠqRT-PCR方法分析了wnt1、wnt2、wnt4、wnt5和wnt11B在虫体头颈节、幼节、成节和孕节的mRNA相对转录情况;采用核酸原位杂交方法分析上述5个基因在虫体头颈节、幼节、成节和孕节的mRNA分布情况。结果显示,wnt基因家族成员在虫体各发育体节均有表达,wnt1、wnt4、wnt5和wnt11B基因在虫体头颈节的mRNA转录水平相对较高,而在虫体孕节的mRNA转录水平最低;与之相反,wnt2基因在虫体头颈节的mRNA转录水平最低,而在虫体幼节的转录水平较高。原位杂交的结果表明,在虫体的头颈节,wnt基因主要表达于虫体的吸盘部位;在幼节和孕节,主要表达于虫体的节间腺,而在成节,wnt基因在虫体的雌雄生殖系统(如卵巢、睾丸)均有表达,并且在虫体的节间腺以及表皮也有一定的表达。综上,扩展莫尼茨绦虫5个wnt基因在虫体头颈节以及幼节的mRNA转录水平较高,且在虫体的吸盘、节间腺以及雌雄生殖细胞均有分布,因此初步推测Wnt信号通路可能参与扩展莫尼茨绦虫体节以及生殖细胞的发育过程,当然这一假说还有待进一步验证。     

细粒棘球绦虫感染宿主免疫应答特征

棘球蚴病(包虫病)不仅影响畜牧业发展,也严重危害群众健康,导致贫病交加,阻碍农牧民脱贫致富,影响疫区经济发展和社会稳定。本文重点从细粒棘球绦虫原头节感染对小鼠免疫细胞功能的影响以及成虫的排泄分泌物对免疫细胞的调节作用两方面介绍细粒棘球绦虫感染宿主的免疫应答特征,为该病的防治研究提供了重要的科学依据和分子基础。     

细粒棘球绦虫TPx基因的克隆及序列分析

从自然感染病羊肝内收集细粒棘球绦虫（Eg）原头蚴,分别提取总RNA和基因组DNA。根据GenBank数据库中的细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶（EgTPx）基因序列设计1对引物,以总RNA为模板,采用RT—PCR技术扩增出EgTPx基因片段,同时以基因组DNA为模板扩增出对应的基因组序列。PCR产物经纯化后连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5口后,进行序列测定和生物信息学分析。结果表明,成功扩增到中国青海株细粒棘球绦虫EgTPx基因片段,其开放阅读框为582bp,编码193个氨基酸,与已知的EgTPx基因核苷酸序列及其编码蛋白氨基酸序列的同源性均为99％,有3个碱基发生变异,分别在245,306,318位由C变为T;引起1个氨基酸变异,由Ala^82变为Val^82。EgTPx具有典型的2-Cys型过氧化物氧还蛋白催化性位点Cys^48和Cys^169。,以及周围保守的FVCP和VCPA序列。EgTPx基因的开放阅读框对应的基因组序列包含2个外显子和1个69bp的内含子。