miR-18b-3p靶向SCD调控绵羊前体脂肪细胞分化的研究

本实验旨在研究miR-18b-3p及其靶基因SCD调控绵羊前体脂肪细胞分化的作用机制.采集3日龄公羊背最长肌,培养绵羊前体脂肪细胞并进行诱导分化,采用油红O染色检测细胞分化情况;通过TargetScan预测miR-18b-3p的靶基因,通过qRT-PCR测定miR-18b-3p、靶基因SCD以及分化标志基因PPARγ、...     

干扰Mtmr3基因对C2C12细胞增殖与分化的影响

旨在探究肌管相关蛋白3(myotubularin related protein 3,Mtmr3)对C2C12细胞增殖与分化的调控作用及机制。本试验以小鼠成肌细胞系(C2C12)为试验材料,分别使用qRT-PCR和免疫荧光染色检测Mtmr3基因在成肌细胞生长期与分化期的mRNA表达水平和分化第6天时的分布形态。合成Mtmr3的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),试验分为siRNA NC对照组和Mtmr3 siRNA处理组(n=3),利用EdU、CCK-8、qRT-PCR、Western blot技术检测Mtmr3 siRNA对成肌细胞增殖与分化的影响,并通过信号通路研究调控成肌细胞增殖与分化的机制。结果显示,Mtmr3在生长期的mRNA水平表达量总体呈下降趋势,而在分化期的表达量呈逐渐上升趋势,Mtmr3免疫荧光染色呈肌管状。干扰Mtmr3后,细胞内Mtmr3基因的mRNA和蛋白表达水平均极显著地降低(P<0.01);在增殖试验中,转染细胞Mtmr3 siRNA后,极显著地增加了EdU阳性细胞占总细胞的比率和细胞活力(P<0.01);干扰...     

miR-23b-3p对3T3-L1前脂肪细胞增殖和成脂分化的影响

为探讨miR-23b-3p对3T3-L1前脂肪细胞增殖和成脂分化的影响,通过化学修饰的miR-23b-3p模拟物成功转入3T3-L1前脂肪细胞后,利用CCK-8法和流式细胞术检测过表达miR-23b-3p对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响;并通过实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞周期基因CyclinD1和CDK4以及成脂标志基因PPARγ和FABP4的表达情况;油红O染色测定甘油三酯积累情况。结果显示,过表达miR-23b-3p抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖,导致细胞G1期阻滞,CyclinD1、CDK4在mRNA和蛋白水平极显著下调;在3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程中,miR-23b-3p的表达水平上调;过表达miR-23b-3p促进3T3-L1前脂肪细胞甘油三酯积累,PPARγ、FABP4在mRNA和蛋白水平显著或极显著上调。结果表明,miR-23b-3p能够抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖并促进其分化为成熟脂肪细胞。     

miR-21与Nocodazole联合作用对小鼠成肌细胞C2C12周期的影响

观察miR-21与Nocodazole联合作用对小鼠成肌细胞C2C12周期的影响。分别以0、200、300、400、500、600 nmol/L Nocodazole处理C2C12细胞24 h,流式细胞仪检测细胞周期,间接免疫染色激光共聚焦显微镜观察细胞有丝分裂器α-微管蛋白(α-tubulin)排列。转染miR-21 mimics/NC和inhibitors/NC,24 h后,添加400 nmol/L的Nocodazole处理24 h,流式细胞仪检测细胞周期。结果表明:Nocodazole使C2C12细胞同步化的最佳浓度是400 nmol/L;过表达miR-21 mimics之后,与对照组相比,G0/G1,S期细胞百分比极显著增加,G2/M期细胞百分比极显著减少(P0.01);添加抑制剂后,与对照组相比,添加抑制剂(inhibitors)的C2C12细胞中处于G0/G1期的细胞比例显著高于对照组,而处于G2/M期的细胞比例显著低于对照组细胞(P0.05);正反试验结果证明,miR-21促进C2C12细胞周期进入S期。为进一步研究miR-21对C2C12细胞的作用机制奠定基础。     

miR-106b-5p靶向KLF4调控山羊肌内前体脂肪细胞分化

旨在明确miR-106b-5p对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响,并确定这种作用是通过靶向KLF4来实现的。本研究利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术检测miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达模式,通过脂质体转染技术将miR-106b-5p mimic和miR-106b-5p inhibitor转入体外培养的山羊肌内前体脂肪细胞,油红O染色法从形态学验证miR-106b-5p对脂肪细胞中脂滴积聚的影响,qRT-PCR检测预测的靶标基因KLF4和脂肪分化标志基因的表达情况,利用双荧光素酶报告系统鉴定miR-106b-5p与KLF4的靶标关系。qRT-PCR结果显示,miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化第3天时表达量最高。在山羊肌内脂肪细胞中干扰miR-106b-5p后油红O染色显示脂滴聚积减少,过表达miR-106b-5p后脂滴聚积增加。在山羊肌内前体脂肪细胞中转染miR-106b-5p inhibitor后PPARγ表达量显著降低(P0.05),而KLF4表达量极显著升高(P0.01);转染miR-106b-5p mimic后LPL和PPARγ表达量极显著升高(P0.01)。荧光素酶活性试验结果显示,过表达miR-106b-5p可显著抑制KLF4荧光活性。miR-106b-5p通过靶向并负调节KLF4的表达促进山羊肌内脂肪细胞分化。     

miR-106b-5p靶向KLF4调控山羊肌内前体脂肪细胞分化

旨在明确miR-106b-5p对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响，并确定这种作用是通过靶向KLF4来实现的。本研究利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技术检测miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达模式，通过脂质体转染技术将miR-106b-5p mimic和miR-106b-5p inhibitor转入体外培养的山羊肌内前体脂肪细胞，油红O染色法从形态学验证miR-106b-5p对脂肪细胞中脂滴积聚的影响，qRT-PCR检测预测的靶标基因KLF4和脂肪分化标志基因的表达情况，利用双荧光素酶报告系统鉴定miR-106b-5p与KLF4的靶标关系。qRT-PCR结果显示，miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化第3天时表达量最高。在山羊肌内脂肪细胞中干扰miR-106b-5p后油红O染色显示脂滴聚积减少，过表达miR-106b-5p后脂滴聚积增加。在山羊肌内前体脂肪细胞中转染miR-106b-5p inhibitor后PPARγ表达量显著降低（P<0.05），而KLF4表达量极显著升高（P<0.01）；转染miR-106b-5p mimic后LPL和PPARγ表达量极显著升高（P<0.01）。荧光素酶活性试验结果显示，过表达miR-106b-5p可显著抑制KLF4荧光活性。miR-106b-5p通过靶向并负调节KLF4的表达促进山羊肌内脂肪细胞分化。     

猪IRS1基因对C2C12细胞系增殖分化的影响

本课题组在前期研究中发现IRS1是民猪和大白猪背最长肌中存在表达差异的一个关键基因,为了深入探讨IRS1在骨骼肌细胞中发挥的生物学功能,本研究首先将猪的IRS1基因完整编码区序列连入pcDNA3.1载体内,构建过表达质粒,同时人工合成IRS1的siRNA干扰序列,在C2C12细胞系内过表达或干扰IRS1基因,使用qRT...     

鞘磷脂对小鼠肌卫星细胞C2C12成肌分化的影响

研究通过检测鞘磷脂对小鼠肌卫星细胞C2C12成肌分化的影响,旨在为阐明鞘磷脂对解偶联蛋白1（UCP1）基因敲入猪骨骼肌生长的影响提供理论依据。用ELISA法检测野生型猪和UCP1敲入猪背部肌肉及血清中总鞘磷脂含量;利用CCK8法检测不同浓度（0、5、20、50和100 μg/mL）鞘磷脂对C2C12细胞增殖和毒性的影响,并通过形态学观察和分化前后细胞成肌分化标记基因生肌因子5（Myf5）、生肌决定因子（MyoD）、肌细胞生成素（Myogenin）、生肌调节因子4（MRF4）的表达检测,建立C2C12成肌分化体系;在成肌分化培养基中添加上述不同浓度的鞘磷脂,诱导分化6 d后,通过形态学和Myogenin免疫荧光染色观察肌管的形成及成肌分化标记基因的mRNA表达水平检测,确定鞘磷脂的最佳添加浓度。用筛选出的最佳鞘磷脂添加浓度诱导细胞成肌分化,在2、4和6 d收集细胞,利用实时荧光定量PCR检测周期蛋白相关基因CyclinD1、CyclinE、CDK2和CDK4的表达水平,CCK8法检测诱导2 d细胞的活力。结果发现,与野生型猪相比,UCP1-KI猪背部肌肉组织中总鞘磷脂含量显著增加（P<0.05）;血清鞘磷脂含量差异不显著（P>0.05）;不同浓度鞘磷脂对未分化C2C12细胞的增殖无显著影响（P>0.05）;成肌分化6 d后,C2C12细胞形成明显的肌管,成肌分化标记基因Myf5、MyoD、Myogenin、MRF4的mRNA和蛋白水平均极显著上调（P<0.01）;与未添加鞘磷脂的对照组相比,20 μg/mL鞘磷脂组有更多肌管形成,Myogenin阳性信号和肌管融合指数均显著增加（P<0.05）,Myogenin、MRF4基因的表达量显著提高（P<0.05）。利用20 μg/mL鞘磷脂诱导细胞分化,在分化2 d时,处理组CyclinE、CDK4基因表达量显著高于对照组（P<0.05）,细胞活力也显著高于对照组（P<0.05）;分化6 d后,处理组CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4基因表达量均显著低于对照组（P<0.05）。本研究结果表明,20 μg/mL鞘磷脂能够提高小鼠肌卫星细胞C2C12分化早期细胞活力和成肌分化效率,可为研究鞘磷脂对骨骼肌生长的影响提供一定的参考。     

miRNA-27b-3p对猪脂肪前体细胞分化的影响

为研究miRNA-27b-3p对猪脂肪前体细胞分化的影响,试验首先对miRNA-27b-3p的靶基因进行预测,然后将miRNA-27b-3p和阴性对照分别转染猪脂肪前体细胞,使用qRT-PCR和ELISA试剂盒检测靶基因在24、48 h转录水平和翻译水平的表达量;甘油三酯检测试剂盒检测脂肪前体细胞中甘油三酯的含量。预测结果显示,miRNA-27b-3p靶向调控影响脂肪沉积的关键基因LPL(脂蛋白酯酶基因);qRT-PCR结果显示,miRNA-27b-3p转染24 h后猪脂肪前体细胞中LPL基因的表达量极显著下调(P<0.01),而转染48 h无明显差异;ELISA结果显示,miRNA-27b-3p转染24 h后猪脂肪前体细胞中LPL蛋白表达量显著下调(P<0.05),转染48 h后猪脂肪前体细胞中LPL蛋白表达受到极显著抑制(P<0.01);甘油三酯检测结果显示,猪脂肪前体细胞中的甘油三酯含量显著降低(P<0.05)。结论：miRNA-27b-3p可以靶向调控LPL基因的表达,抑制猪脂肪前体细胞的分化。     

miR-181a和miR-181d-5p对猪前体脂肪细胞成脂分化调控的研究

【目的】 探究miR-181a和miR-181d-5p在荣昌猪原代前体脂肪细胞分化中的作用及机制。【方法】 通过比对种子序列差异分析miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠不同物种间的序列保守性;实时荧光定量PCR检测miR-181a和miR-181d-5p在猪肌肉和背部皮下脂肪组织中表达;利用miRandn和TargetScan在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p的靶基因,并进行GO和KEGG富集分析;使用RNAhybrid在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合自由能。取7日龄雄性荣昌猪背部皮下脂肪组织分离原代前体脂肪细胞。分别设计miR-181a和miR-181d-5p的靶基因野生型和突变型载体,并与对应的miRNA共转染前体脂肪细胞,进行双荧光素酶报告基因试验验证miRNA与靶基因的靶标关系,测定miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合情况。构建miR-181a和miR-181d-5p的模拟物（miR-181a mimics、miR-181d-5p mimics）、抑制物（miR-181a inhibitor、miR-181d-5p inhibitor）、阴性对照（NC）及其靶基因的干扰siRNA （Gene-siRNA）,转染细胞6 h后进行诱导分化。6 d后,分别对不同处理的细胞通过实时荧光定量PCR检测基因表达情况,油红O染色鉴定甘油三酯生成情况。【结果】 保守性分析结果表明,miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠间具有高度序列保守性;miR-181a与miR-181d-5p在猪不同组织中定量结果显示,miR-181a与miR-181d-5p在猪脂肪组织中特异性高表达;靶基因预测结果表明,miR-181a与miR-181d-5p的靶基因分别为线粒体甘油3-磷酸脱氢酶（GPD2）和环腺苷酸反应元件（CREB1）;GO和KEGG功能富集分析发现,miR-181a和miR-181d-5p的靶基因可以抑制甘油三酯生成,调节脂肪细胞分化,且miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的自由结合能均<－87.8 kJ/mol;双荧光素酶报告基因试验结果表明,转染miR-181a与miR-181d-5p的mimics可以极显著抑制靶基因3'-UTR野生型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性（P<0.01）,但不影响靶基因突变型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性。诱导分化结果表明,与未分化脂肪细胞（0 d）相比,miR-181a表达量在分化的第4天显著升高（P<0.05）,到第6天达到极显著差异（P<0.01）;miR-181d-5p及GPD2和CREB1基因表达量在分化的第4、6天均极显著升高（P<0.01）。miR-181a和miR-181d-5p的细胞转染试验均得到相似结果,与NC组相比,mimics组miR-181a与miR-181d-5p的表达量均极显著上升（P<0.01）,inhibitor组miR-181a与miR-181d-5p表达量均极显著下降（P<0.01）;mimics和siRNA组的GPD2与CREB1基因表达量均极显著下降（P<0.01）,inhibitor组GPD2与CREB1基因表达量均极显著上升（P<0.01）;mimics和siRNA组PPARγ和C/EBPα基因的相对表达量均显著或极显著上升（P<0.05;P<0.01）,inhibitor组PPARγ和C/EBPα基因的表达量均显著下降（P<0.05）;油红O染色结果表明,与NC组相比,mimics和siRNA组细胞脂滴数目增加,inhibitor组细胞脂滴数目减少。【结论】 miR-181a和miR-181d-5p可以分别靶向结合GPD2和CREB1基因3'-UTR区域序列,降低GPD2和CREB1基因的表达,促进猪前体脂肪细胞成脂分化。     

MiR-106a-5p靶向E2F3和SP-1抑制C2C12细胞成肌分化的研究

为探究miR-106a-5p对成肌分化的作用及潜在调控靶点,在线预测miR-106a-5p潜在靶基因,通过RT-qPCR及Western blot检测miR-106a-5p对靶基因的调控作用,利用双荧光素酶报告系统验证miR-106a-5p与靶基因之间的互作,并以C2C12细胞系为实验模型,采用过表达技术,在细胞形态学水平初步探索其对成肌分化的作用。在线预测发现E2F3和SP-1可能是miR-106a-5p的潜在靶基因;RT-qPCR分析表明,miR-106a-5p与E2F3和SP-1的表达模式相反;Western blots结果发现,miR-106a-5p抑制E2F3和SP-1蛋白翻译;双荧光素酶报告载体系统表明,E2F3和SP-1是miR-106a-5p调控成肌分化的靶基因;此外,超表达miR-106a-5p抑制C2C12细胞分化,肌管数目显著减少。结果表明,E2F3和SP-1是miR-106a-5p抑制C2C12细胞成肌分化的靶基因。     

miR-23b-3p对延边黄牛垂体细胞中生长激素分泌影响的研究

为了分析血液外胞体miRNA对延边黄牛垂体细胞中生长激素(GH)分泌的影响,试验选择在延边黄牛和韩延牛血液外胞体中存在显著差异表达的miR-23b-3p,分析其对延边黄牛垂体细胞中GH分泌的影响机制。首先进行延边黄牛垂体细胞的原代培养,然后将miR-23b-3p的mimics(miR-23b-3p-mi组)、mimics对照品(NC组)、inhibitor(miR-23b-3p-in组)、inhibitor对照品(iNC组)转染至已建立的垂体原代细胞中,48 h后收集细胞,提取总mRNA和总蛋白,利用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western-blot技术分别检测GH mRNA转录和蛋白的表达情况;利用targetscan和RNAhybrid分析软件对miR-23b-3p的靶基因进行预测,再利用双荧光素酶报告基因系统对miR-23b-3p的靶关系进行了验证;最后利用实时荧光定量PCR和Western-blot技术分别检测miR-23b-3p靶基因的mRNA转录和蛋白表达情况。结果表明:miR-23b-3p-mi组的延边黄牛垂体细胞中GH mRNA转录和蛋白表达水平极显著低于NC组(P0.01),而miR-23b-3p-in组的延边黄牛垂体细胞中GH mRNA转录和蛋白表达水平显著高于iNC组(P0.05);miR-23b-3p靶向了垂体特异性转录因子(POU1F1)的3′UTR;miR-23b-3p-mi组的POU1F1 mRNA转录和蛋白表达水平极显著低于NC组(P0.01),而miR-23b-3p-in组的POU1F1 mRNA转录和蛋白表达水平极显著高于iNC组(P0.01)。说明miR-23b-3p可通过调节POU1F1基因的表达来调控延边黄牛垂体细胞GH的分泌,进而调控延边黄牛的生长发育。     

miR-186对C2C12中myogenin基因表达的抑制研究

Myogenin是一种诱导肌肉细胞分化和控制肌生成最终分化步骤的重要转录因子。本试验以小鼠成肌细胞(C2C12)为研究材料,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)、蛋白质印迹(Western Blot)和荧光素酶报告基因分析等方法研究了mi R-186对myogenin基因的调节作用。结果显示,mi R-186在C2C12细胞分化初期表达上调,并能通过作用于myogenin的3'-UTR区显著抑制myogenin的表达。     

miR-17-3p靶向KCTD15调控延边黄牛前体脂肪细胞分化

旨在探究miR-17-3p是否可以通过靶向KCTD15调节延边黄牛前体脂肪细胞的分化。本研究使用生物信息学软件鉴定miR-17-3p的同源性,预测miR-17-3p的靶基因;通过在延边黄牛的前体脂肪细胞中转染miR-17-3p mimic或miR-17-3p inhibitor及阴性对照实现细胞内miR-17-3p过表达或抑制表达;采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-17-3p与KCTD15的靶标关系;使用qRT-PCR和Western blot技术在mRNA和蛋白水平上检测miR-17-3p对KCTD15基因以及脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα表达水平的影响。结果表明,生物信息学软件预测KCTD15可作为miR-17-3p的靶基因,且miR-17-3p在哺乳动物中具有较高的同源性;转染miR-17-3p mimic后脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα的mRNA和蛋白表达量显著或极显著高于转染NC-mimic的对照组（P<0.05或P<0.01）;抑制miR-17-3p的表达后,PPARγ和C/EBPα的表达量则显著或极显著低于对照组（P<0.05或P<0.01）;双荧光素酶报告基因验证分析显示,过表达miR-17-3p极显著抑制了含有KCTD15 3'UTR片段的载体的荧光活性（P<0.01）;过表达miR-17-3p也会显著或极显著抑制候选靶基因KCTD15 mRNA和蛋白质的表达量（P<0.05或P<0.01）;而抑制miR-17-3p的表达则会显著提高靶基因KCTD15的mRNA和蛋白质的表达量（P<0.05）。这些结果说明,miR-17-3p可能通过抑制KCTD15的表达促进延边黄牛前体脂肪细胞分化。     

猪miR-199a-3p对mTOR基因表达的调控

通过生物信息学预测miR-199a-3p与mTOR-3′UTR的结合位点,人工合成猪mTOR-3′UTR及突变型片段克隆至双荧光素酶载体上,构建野生型(psiCHECK-2-W-mTOR-3′-UTR)和突变型(psiCHECK-2-M-mTOR-3′-UTR)双荧光素酶报告质粒。给PK-15细胞分别转染miR-199a-3p mimics、negative control和mTOR-3′-UTR野生型/突变型双荧光素酶报告载体,用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性,分别采用RT-qPCR和Western blot检测mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含mTOR-3′-UTR的野生型和突变型双荧光素酶报告质粒与miR-199a-3p mimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P0.05);转染miR-199a-3p mimics能显著下调mTOR基因mRNA和蛋白的表达(P0.05),而转染miR-199a-3p Inhibitor组和Inhibitor-NC组相比,mTOR基因蛋白表达差异不显著(P0.05)。成功构建了猪野生型及突变型mTOR-3′-UTR双荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶试验、RT-qPCR及Western blot证实miR-199a-3p与猪mTOR-3′-UTR存在靶向调控关系。     

miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞增殖分化的影响

【目的】研究miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞增殖分化的影响及其在不同组织中的表达情况,为探究miRNA在肌肉发育中的调控机制提供理论基础。【方法】利用生物信息学方法预测miR-495-3p的靶基因;实时荧光定量PCR检测miR-495-3p及其靶基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌等组织中的表达水平。构建miR-495-3p的过表达(miR-495-3p mimic、miR-495-3p mimic NC)及抑制物(miR-495-3p inhibitor、miR-495-3p inhibitor NC),在山羊骨骼肌细胞汇合度达60%～70%时进行转染,并用含2%马血清的培养基进行诱导分化,用CCK-8检测细胞增殖活力,实时荧光定量PCR检测过表达和干扰效率及增殖分化相关基因配对盒基因(paired-box 7,Pax7)、细胞蛋白周期E(Cyclin E)、肌细胞生成素(myogenin, myoG)、生肌因子5(recombinant myogenic factor 5,Myf5)的表达;构建miR-495-3p靶基因的野生型和突变型载体并转染至293T细胞,用...     

臭参水提物通过miR-3081-3p及靶基因Ubn2对小鼠结肠癌的调控研究

为了探究臭参水提物通过miRNA对小鼠结肠癌的调控效果,试验首先采用高通量测序技术测定结肠癌模型小鼠的结肠组织中miRNA表达水平,通过GO注释分析和KEGG富集分析对差异表达miRNA进行功能预测,以筛选出的表达差异较显著且尚无相关报道的miR-3081-3p为研究对象并预测其靶基因;然后在NIH-3T3细胞中转染miR-3081-3p模拟物(mimics)并添加臭参水提物进行孵育,通过Western-blot检测其靶基因的表达水平,并利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果表明：在结肠癌模型小鼠的结肠组织中共发现117个显著差异表达的miRNA,其靶基因主要富集在肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、Ras、泛素化及NF-κB等信号通路中;其中miR-3081-3p在结肠癌模型小鼠中表达量显著下降54%,其靶基因Ubn2表达量显著上升(P<0.05);在NIH-3T3细胞中,臭参水提物孵育和转染miR-3081-3p模拟物(mimics)均可以提高miR-3081-3p的表达量并降低靶基因Ubn2的表达量,还可降低NIH-3T3细胞凋亡水平。说明臭参...     

miR-186-5p调控猪原代前体脂肪细胞增殖和分化的研究

旨在探究miR-186-5p对猪原代前体脂肪细胞增殖和成脂分化的调控作用及机制.本研究采集7日龄健康马身猪公猪的颈部皮下脂肪,分离培养马身猪原代前体脂肪细胞;猪原代前体脂肪细胞分为4组,分别转染miR-186-5p模拟物(mimics)及其对照组(mimics NC),miR-186-5p抑制剂(inhibitor)及...     

circRNA-Zfp609对C2C12成肌细胞增殖和分化的影响

【目的】试验旨在探究circRNA-Zfp609调节C2C12成肌细胞增殖和分化的潜在分子机制。【方法】利用RT-PCR和测序分析小鼠骨骼肌组织和C2C12成肌细胞中circRNA-Zfp609的表达,实时荧光定量PCR检测小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、骨骼肌组织及增殖12、24、36、48 h和分化0、1、3、5 d的C2C12成肌细胞中circRNA-Zfp609的相对表达量;实时荧光定量PCR检测分化0、1、3、5 d的C2C12成肌细胞中肌细胞生成素（MyoG）和肌球蛋白重链（MyHC）的相对表达量。用circRNA-Zfp609的干扰表达载体（siRNA）干扰细胞,通过CCK-8测定siRNA对C2C12成肌细胞增殖率的影响;用实时荧光定量PCR检测siRNA干扰对circRNA-Zfp609、MyoG和MyHC相对表达量的影响。通过TargetScan 7.0和miRDB软件预测circRNA-Zfp609上与肌肉分化相关的miRNA位点,将筛选的miRNAs的过表达载体转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验验证circRNA-Zfp609与miRNA的互作关系。根据miRNAs对circRNA-Zfp609的互作,构建circRNA-Zfp609的野生型和突变型载体并转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验验证circRNA-Zfp609对miRNA的靶向关系。【结果】PCR和测序结果表明,小鼠骨骼肌中可表达circRNA-Zfp609;circRNA-Zfp609在小鼠骨骼肌中表达水平最高,在其他组织中的表达量由高到低依次是肾脏、肺脏、心脏、肝脏、胃、脾脏和小肠。与12 h相比,在C2C12成肌细胞增殖的36和48 h circRNA-Zfp609的相对表达量显著增加（P<0.05）;与分化第0天相比,在C2C12成肌细胞分化的第1、3和5天circRNA-Zfp609的相对表达量均显著增加（P<0.05）,MyoG、MyHC的相对表达量均极显著增加（P<0.01）。与NC组相比,siRNA组C2C12成肌细胞的增殖率和circRNA-Zfp609相对表达量均极显著降低（P<0.01）,MyoG和MyHC的相对表达量显著降低（P<0.05）。circRNA-Zfp609上有miR-150-5p、miR-327、miR-344g-3p和miR-615-5p 4种与肌肉分化相关的miRNAs。circRNA-Zfp609与miR-615-5p的吸附能力最强,具有靶向结合作用。circRNA-Zfp609可以作为分子海绵与调控肌肉分化相关的miR-615-5p相互作用。【结论】circRNA-Zfp609在小鼠的组织中广泛表达,在骨骼肌中表达水平最高;circRNA-Zfp609在C2C12成肌细胞增殖和分化的不同时期差异表达,circRNA-Zfp609上有4个与肌肉分化相关的miRNAs,其中miR-615-5p与circRNA-Zfp609具有靶向关系。本研究结果可为与家畜骨骼肌生长发育相关的研究提供参考。     

干扰素α对小鼠Tfh细胞分化的调控作用

通过体外试验观察干扰素-α(IFN-α)对滤泡辅助性T细胞(Tfh)分化及功能的影响。无菌分离小鼠脾细胞,磁珠分选CD4^+T细胞,加入抗CD3单克隆抗体、抗CD28单克隆抗体,重组IL-21、IL-6进行刺激,同时加入重组IFN-α(设不加IFN-α的阴性对照)进行培养,分别在培养后的1、3、5d,流式细胞术检测Tfh细胞(CD4^+CXCR5^+)和CD4^+CXCR5^+PD-1^+细胞的比例;ELISA检测细胞上清中Tfh细胞功能性细胞因子IL-4、IL-21的水平;real-time PCR检测培养3d后Tfh细胞相关转录因子STAT1、Bcl-6以及细胞因子IL-21mRNA的表达水平。结果表明,与阴性组相比,IFN-α能明显促进Tfh细胞的分化及Tfh细胞中PD-1的表达(P<0.05),能提高Tfh细胞功能性细胞因子IL-4、IL-21的分泌水平(P<0.05);IFN-α能正向调控Tfh细胞相关转录因子STAT1、Bcl-6以及细胞因子IL-21mRNA的表达水平(P<0.05)。说明IFN-α可通过正向调控STAT1、Bcl-6的表达,促进Tfh细胞的分化和细胞因子的分泌。