牛卵巢卵母细胞体外培养成熟条件的建立

研究不同犊牛血清浓度、培养时间和不同类型血清对牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,添加体积分数为10%,15%和20%的FBS时,各组间卵母细胞成熟率差异不显著(p>0.05);培养时间为16h时卵母细胞成熟率与培养时间为20h和24h时的差异极显著(p<0.01),而培养时间为20h和24h时卵母细胞成熟率差异不显著(p>0.05);培养基添加OCS对卵母细胞成熟的影响效果与添加FBS的无显著差异(p>0.05),二者的卵母细胞的核成熟率均达到80%以上。     

不同因素对新疆多浪羊卵母细胞体外成熟的影响

为了探索多浪羊卵母细胞体外成熟的影响因素,提高体外受精率,为多浪羊繁殖潜能的发挥提供基础,试验以屠宰场多浪羊卵巢为材料,采用不同运输条件及不同卵母细胞收集方法,研究运输条件及采集方式对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:温度为25~30℃时卵母细胞成熟率(49.4%)与20~25℃(52.9%)相比差异不显著(P0.05),与30~38℃(23.2%)及4~10℃(35.7%)相比差异显著(P0.05)。保存时间1~2 h的成熟率(49.1%)与保存时间2~3 h的成熟率(50.3%)相比差异不显著(P0.05),保存时间6~8 h的成熟率(26.0%)显著低于保存时间1~2 h和2~3 h的成熟率(P0.05)。切割法收集的卵母细胞数及体外成熟率均显著高于抽吸法(P0.05)。卵巢在20~30℃条件下、1~3 h内运回畜牧科技重点实验室卵母细胞体外成熟率最高,而且切割法优于抽吸法。     

马尾藻属藻类多糖对猪卵母细胞体外成熟及凋亡的影响

本研究就马尾藻属藻类多糖对猪卵母细胞的体外成熟及凋亡进行了探索:试验一证明,体外培养46h～48h时,成熟液添加马尾藻属藻类多糖能促进卵丘细胞扩展,添加20mg/ml马尾藻属藻类多糖能提高核成熟率(41.8%),与对照组29.3%的核成熟率相比,二者差异显著;试验二证明,添加马尾藻属藻类多糖可延长猪卵母细胞体外存活时间,体外培养第16d,在含有0、5mg/ml、20mg/ml马尾藻属藻类多糖培养液中的猪卵母细胞存活率分别为2.6%、18.9%、23.0%,添加与否差异显著。     

没食子酸对黄牛卵母细胞体外成熟的影响

试验旨在研究没食子酸(gallic acid,GA)对黄牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响,进一步优化黄牛卵母细胞体外成熟体系。在卵母细胞体外成熟液(M液)中添加不同浓度没食子酸(0、10、30、50、100μmol/L),成熟22~24h后,统计卵丘扩展情况及卵母细胞成熟率;同时,对成熟的卵母细胞进行正常体外受精(IVF),统计早期胚胎的分裂率、囊胚率、囊胚卵裂球数及卵裂球细胞凋亡率。根据试验结果,选择最优浓度,使卵母细胞在含该浓度没食子酸的成熟液中成熟24h后,检测其细胞内的活性氧水平(ROS)和总谷胱甘肽(TGSH)含量。结果显示,M液中添加30μmol/L没食子酸组卵丘扩展分值和成熟率显著高于对照组(0μmol/L)(P0.05),其他处理组与对照组无显著差异(P0.05);成熟的卵母细胞体外受精后进行后续胚胎培养,其中10和30μmol/L组的分裂率均显著高于对照组和100μmol/L组(P0.05),50和100μmol/L组分裂率较对照组也有所提高,但差异不显著(P0.05);早期囊胚率统计发现,与对照组相比,30和100μmol/L能够显著提高囊胚发育率(P0.05),10和50μmol/L浓度组则无显著差异(P0.05);与对照组相比,30、100μmol/L没食子酸均能显著提高IVF胚胎的早期囊胚卵裂球数(P0.05);但囊胚卵裂球凋亡率与对照组无显著差异(P0.05);对卵母细胞内活性氧和总谷胱甘肽含量检测时,发现30μmol/L没食子酸可显著降低细胞内活性氧水平(P0.05),且显著提高总谷胱甘肽含量(P0.05)。综上所述,在黄牛卵母细胞体外成熟液中添加适量的没食子酸能有效降低卵母细胞内活性氧水平,提高总谷胱甘肽含量,进而提高卵母细胞成熟的质量及其后续IVF胚胎发育能力。     

亮甲酚蓝染色对牛卵母细胞体外成熟的影响

为了探讨不同浓度亮甲酚蓝对牛卵母细胞染色选择后对其体外成熟（IVM）的影响,本研究在牛卵母细胞成熟培养前直接用不同浓度梯度的亮甲酚蓝进行不同时间的染色。结果表明：①经过不同浓度的亮甲酚蓝染色后,所选择卵母细胞染色后着色的百分率及其成熟率是不同的。用26、39、52 μmol/L的亮甲酚蓝染色后所得到的胞质蓝色组（27.7%、27.6%、31.9%）较13 μmol/L的亮甲酚蓝染色后所得到的胞质蓝色组（2.1%）差异显著（P＜0.05）;②经过不同浓度的亮甲酚蓝染色后,胞质蓝色组（77.4%）较胞质无色组（51.3%）和对照组（60.2%）成熟率差异显著（P＜0.05）;③不同浓度亮甲酚蓝染色的胞质蓝色组间成熟率差异不显著（P＞0.05）;④不同浓度亮甲酚蓝染色组与对照组卵母细胞的成熟率差异不显著（P＞0.05）;⑤经过不同时间的亮甲酚蓝染色后,所选择卵母细胞着色的百分率是不同的。用26 μmol/L的亮甲酚蓝染色90 min后所得到的胞质蓝色组（75%）较亮甲酚蓝染色60、30 min后所得到的胞质蓝色组（57.14%,40%）差异显著（P＜0.05）。以亮甲酚蓝染色为基础的牛卵丘卵母细胞复合体的区分可以用来有效的选择更具发育活力的牛卵母细胞。     

ROS诱导山羊卵母细胞核质同步成熟

利用周期依赖性蛋白激酶抑制剂(roscovitine,ROS)诱导体外培养山羊的卵母细胞核质同步成熟。用40μmol/L的ROS预处理山羊卵母细胞8h后转入常规成熟培养8,12,16h,记为(8+8,8+12和8+16),统计0,8,8+8,8+12,8+16h卵母细胞核成熟情况;用彗星试验检测8+16h时卵母细胞的老化程度;在激光共聚焦显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)下观察8+16h时卵母细胞的皮质颗粒迁移情况;对体外培养8+16h卵母细胞进行孤雌激活和体外培养,统计孤雌激活胚的体外发育情况;以上试验都以常规培养相同时间为对照。结果显示:山羊卵母细胞在体外核成熟抑制培养8h时,处于GV期的卵母细胞为59.16%,与对照组(25.75%)差异显著(P<0.05);8+8h和8+12h时,到达MⅡ期的卵母细胞的比率为19.75%和28.93%,与对照组(40.78%,53.10%)差异显著;8+16h时,到达MⅡ期的卵母细胞比率(73.20%)与对照组(74.36%)无显著性差异(P>0.05);(8+16h)组有老化倾向的卵母细胞的比率(21.67%)显著低于对照组(35.67%);(8+16h)组卵母细胞的皮质颗粒完全迁移率(81.84%)与对照组(78.89%)差异不显著;(8+16h)组卵母细胞孤雌胚的囊胚发育率(38.60%)高于对照组(32.80%)(P>0.05)。结果表明:成熟液中添加40μmol/L ROS对山羊卵母细胞短时间(8h)核成熟抑制培养,然后转入常规成熟培养16h,即不改变山羊卵母细胞体外成熟的时间(24h),可有效延迟部分卵母细胞生发泡破裂(GVBD)的发生,不影响山羊卵母细胞核质的成熟,不降低MⅡ期的卵母细胞比率,可以降低有老化倾向卵母细胞的比率,提高山羊卵母细胞的后续发育能力。     

不同繁殖季节驴卵母细胞体外成熟与孤雌激活胚胎发育情况研究

为了研究驴在繁殖与非繁殖季节卵母细胞体外成熟与孤雌激活胚胎发育情况,试验以3—9月份为繁殖季节,其他月份为难繁殖季节,从屠宰场采集驴卵巢,统计分析不同繁殖季节卵巢形状的差异,采用抽吸法和切割法获取卵母细胞,并对卵母细胞进行体外成熟诱导,对成熟的卵母细胞进行孤雌激活,分析激活胚胎的发育情况。结果表明:繁殖季节与非繁殖季节卵巢形状差异明显。在繁殖季节,卵巢内卵泡液增多且卵泡体积变大,导致卵巢体积增大,总卵泡、中卵泡、小卵泡数量显著多于非繁殖季节(P0.05);繁殖季节卵母细胞回收率为85.38%,非繁殖季节卵母细胞回收率为72.18%,两者差异显著(P0.05);繁殖季节驴卵母细胞体外培养成熟率为50.10%,非繁殖季节时成熟率为34.74%,两者差异显著(P0.05);繁殖季节卵裂率为31.0%,非繁殖季节卵裂率为29.0%,两者无显著差异(P0.05)。说明繁殖季节卵母细胞体外成熟情况优于非繁殖季节,非繁殖季节较难获得成熟卵母细胞,但是获得成熟卵母细胞激活发育后无明显差异。     

亮甲酚蓝染色对牛卵母细胞体外成熟和凋亡的影响

为了探讨亮甲酚蓝(brilliant cresyl blue,BCB)对牛未成熟卵母细胞染色选择后对其体外成熟(IVM)和凋亡的影响,本研究在牛卵母细胞成熟培养前用26 μmol/L BCB染色90 min作为处理组,以未染色卵母细胞作为对照组;将处理组依照胞质的颜色分为蓝色组(BCB⁺)和无色组(BCB^-),成熟培养后检测卵子的发育能力。结果表明:①经BCB染色卵母细胞在成熟后,BCB⁺组卵母细胞成熟率(80.92%)较对照组(60.00%)和BCB^-组(51.61%)差异显著(P<0.05);②BCB⁺组的凋亡率(6.50%)较对照组(28.21%)、BCB^-组(39.06%)差异显著(P <0.05),随着卵母细胞发育潜能的升高其凋亡率逐渐降低。由此可见,以亮甲酚蓝染色为基础的牛卵丘-卵母细胞复合体的区分可以用来有效的选择更具发育活力的牛卵母细胞。     

不同培养条件对牛卵母细胞体外成熟的影响

利用屠宰场采集的牛卵巢,研究了培养时间和不同激素组合对卵母细胞体外成熟的影响,结果表明:在成熟培养液中添加10 μg/mL FSH、1 μg/mL E2的Ⅰ组(成熟率77.78%、卵裂率64.37%)和同时添加10 μg/mL FSH、10 μg/mL LH、1 μg/mL E2的Ⅱ组(成熟率82.76%、卵裂率67.26%)与对照组(成熟率45.46%、卵裂率52.29%)相比,卵母细胞成熟率和卵裂率差异极显著(P＜0.01),Ⅰ、Ⅱ两组之间,卵母细胞抽检成熟率、卵裂率虽无显著差异(P＞0.05),但Ⅱ组卵母细胞成熟率、卵裂率分别比Ⅰ组提高了5.02%和2.89%.卵母细胞培养＜20 h、20 h、24 h、28 h,成熟率分别为53.33%、77.77%、78.57%和71.43%,卵母细胞成熟率20 h、24 h、28 h组与＜20 h组相比差异显著(P＜0.05).卵裂率20 h、24 h组(51.79%、58.16%)显著高于＜20 h组(38.24%)、28 h组(36.98%)(P＜0.05),但20 h、24 h组卵裂率差异不显著(P＞0.05).     

卵巢保存温度、激素及体外培养时间对延边黄牛卵母细胞体外成熟的影响

本研究探讨卵巢保存温度、激素及体外培养时间对延边黄牛卵母细胞体外成熟的影响.研究结果表明,将卵巢分别保存在25～29℃、30～35℃、36～40℃的生理盐水中运输时,卵母细胞体外成熟率分别为55.3%、70.1%、60.7%,各组间无显著性差异(P＞0.05);当将卵母细胞分别培养在无激素的对照组(TCM199 10?S)、添加雌二醇(estradiol)-17β组、LH 雌二醇-17β组时,卵子的成熟率分别为57.8%、64.3%、70.1%,对照组与LH 雌二醇-17β组差异显著(P＜0.05);卵母细胞各自培养22～25 h、26～30 h、31～34 h时,卵子体外成熟率分别为56.3%、65.4%、68.4%,3组间无显著差异(P＞0.05).     

牛卵母细胞的体外成熟

在卵母细胞体外成熟液（含FSH）中分别添加10、30、50μg/L表皮生长因子（EGF）,24 h检查成熟率。结果表明,添加10、30μg/L EGF组牛卵母细胞成熟率为79.8%、71.5%与对照组（未添加EGF）成熟率（70.4%）无明显差异（P〉0.05）,但EGF添加至50μg/L时牛卵母细胞第一极体（PB1）排出率显著提高,达85.4%（P〈0.01）;在此基础上,比较了成熟液中添加尿促性素（HMG）对牛卵母细胞体外成熟的影响,结果发现在含FSH和EGF的成熟液中添加HMG未能显著提高牛卵母细胞体外成熟效果（P〉0.05）;最后,比较了HMG对牛卵母细胞体外成熟的效果,结果发现单独添加HMG成熟效果显著高于FSH（P〈0.05）,表明成熟液中如不含其他生长因子,则单独添加HMG较FSH对牛卵母细胞体外成熟的效果好。     

猪分级卵母细胞体外成熟时间规律的研究

试验根据猪卵丘－卵母细胞复合体（COCs）的颗粒细胞层数,把COCs分成A、B、C和D级,A、B级用于体外分别培养24、32、38、44、48和54 h,C级用于体外分别培养24、32、38、44、48、54和60 h,观察它们不同时间排出极体数,然后将排出极体的卵母细胞孤雌激活。结果发现,A和B级COCs培养48 h时成熟率最高（83.2%和78.0%）,明显高于同级水平培养24、32和38 h的成熟率;不同级别COCs体外培养相同时间,A与B级成熟率差异不显著（P＞0.05）,但二者与C级的成熟率差异显著（P＜0.05）;体外培养48 h COCs卵裂率最高（81.7%）,与培养38 h前的卵裂率差异显著（P＜0.05）。结果表明,A、B级卵母细胞更适于体外培养,能获得高的成熟率和卵裂率,COCs周围颗粒细胞对卵母细胞的成熟有显著影响;COCs培养38 h之前,部分虽能看到极体,但激活后卵裂率极低,说明卵母细胞并未真正成熟,通常通过排出极体判断卵母细胞成熟是不够准确的,COCs体外培养44～48 h是成熟的最佳时期,能为体细胞核移植提供大量优质的MⅡ期卵母细胞。     

猪卵母细胞体外成熟的初步研究

为了研究猪卵母细胞不同状态和卵泡液对体外成熟的影响,试验设计的方法。结果表明:按卵泡直径不同分为小(3 mm)、中(3～6 mm)、大(6 mm)3组,卵母细胞体外成熟率依次为65.5%、81.6%、81.8%(P0.05);添加卵泡液(PFF)培养的卵母细胞体外成熟率显著高于不添加时的体外成熟率(P0.05)。     

不同培养体系对金华猪卵母细胞体外成熟的影响

本试验探讨了不同培养体系对金华猪卵母细胞体外成熟的影响,共进行了4组试验。结果表明,试验组4,采用TCMl99作为体外成熟基础培养液,添加10 IU/mL促卵泡素(FSH)、10 IU/mL促黄体素(LH)、10%卵泡液(PFF)、10%血清,在成熟率上均显著高于其他试验组(P0.05),但添加10%发情金华猪血清或10%胎牛血清,对卵母细胞的成熟率无显著差异(P0.05)。说明金华猪卵母细胞在体外成熟培养时加入血清,能够促进卵母细胞的体外成熟率。     

丁内酯-Ⅰ对绵羊卵母细胞体外成熟及发育能力的影响

研究从丁内酯-Ⅰ(BL-Ⅰ)的浓度筛选、作用时间以及作用解除后的成熟培养时间等方面分别进行了试验,以观察其对绵羊卵母细胞核成熟的抑制程度以及对卵母细胞体外成熟及发育能力的影响.结果表明:150μmol/L的BL-Ⅰ能将62.9%的卵母细胞抑制在GV期.BL-Ⅰ抑制8、16 h和24 h后绵羊卵母细胞停滞在GV期的比率差异不显著(P＞0.05);抑制24 h时卵裂率和囊胚率低于对照组,16 h的囊胚率也低于对照组,抑制8 h的卵裂率和囊胚率与对照组差异不显著(P＞0.05).去除抑制后卵母细胞的成熟能力不受影响.由此可得出,丁内酯-Ⅰ能可逆性抑制绵羊卵母细胞的核成熟,但未能提高其发育潜力.     

AREG对绵羊小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响

旨在研究双调蛋白(AREG)对绵羊小腔卵泡卵母细胞体外成熟(IVM)的影响。本研究从屠宰场绵羊卵巢上采集小腔和中腔卵泡的卵母细胞进行试验,利用自发荧光检测卵母细胞的NAD(P)H和FAD~(++)水平,利用JC-1检测卵母细胞的线粒体膜电位;两种来源的卵母细胞经体外成熟后,比较其卵丘扩展指数(CEI)、第一极体排出率(MII%);比较AREG、AREG+GDF9、AREG+BMP15、AREG+GDF9+BMP15、GDF9+BMP15对小腔卵泡卵母细胞体外成熟后的CEI、MII%及卵母细胞线粒体膜电位的影响;检测了AREG+GDF9+BMP15对小腔卵泡卵母细胞体外成熟后的NAD(P)H和FAD~(++)水平及其受精后发育能力的影响。结果表明,成熟前,小腔卵泡卵母细胞的线粒体膜电位和FAD~(++)水平均显著低于中腔卵泡卵母细胞(P0.05);体外成熟培养后,小腔卵泡卵母细胞的CEI和MII%均显著低于中腔卵泡卵母细胞(P0.05)。与对照组相比,AREG+GDF9+BMP15显著提高了小腔卵泡卵母细胞体外成熟后的CEI、MII%和线粒体膜电位(P0.05),且与中腔卵泡卵母细胞组差异不显著(P0.05);另外,AREG+GDF9+BMP15显著提高了小腔卵泡卵母细胞体外成熟后的NAD(P)H和FAD~(++)水平(P0.05),且与中腔卵泡卵母细胞组差异不显著(P0.05)。与对照组相比,在成熟液中添加AREG+GDF9+BMP15可以明显提高小腔卵泡卵母细胞体外受精后的卵裂率和囊胚率(分别为(43.79±3.69)%、(28.54±4.31)%和(78.99±1.12)%、(47.46±2.50)%,P0.05),而且与中腔卵泡卵母细胞组无显著差异(P0.05)。综上表明,绵羊小腔卵泡卵母细胞的代谢水平及IVM质量较低, AREG在GDF9和BMP15的协同作用下可以显著提高小腔卵泡卵母细胞的代谢水平及IVM质量,并进一步提高小腔卵泡卵母细胞体外受精后的发育能力。     

促黄体素对牛卵母细胞体外核成熟的影响

为了研究促黄体素(luteinizing hormone,LH)在牛卵母细胞成熟培养体系中的时间依从性,试验通过向牛卵母细胞体外成熟培养的不同时间段添加LH来观察其核成熟的情况。首先用无LH的基础成熟液I和添加LH的成熟液Ⅱ分别培养,在成熟的不同时间点(3、6、9h)用醋酸地衣红染色观察各自的生发泡破裂率。然后在体外成熟培养的不同时间段(0～3、0～6、0～9、0～24h)添加LH,24h后统计各自的第一极体率。结果表明,添加LH组在6h的生发泡破裂率显著低于对照1组(P0.05),24h添加LH组的第一极体率显著高于对照2组(P0.05)。因此,添加LH能延迟牛卵母细胞的核成熟,成熟培养中24h全程添加LH较不添加组能显著提高核成熟率。     

水牛卵母细胞在不同培养液中成熟与凋亡的比较研究

为了解卵母细胞体外成熟与凋亡过程,进而提高卵母细胞体外成熟率,本试验研究了在培养液中添加不同浓度的表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对水牛卵母细胞体外成熟和凋亡的影响。结果表明:(1)添加各种浓度的EGF(10,20,30,50,100 ng/mL)均可以提高水牛卵母细胞的成熟率,降低卵母细胞的凋亡率,其中50 ng/mL EGF有显著影响(P<0.05);(2)添加各种浓度的IGF-1(10,30,50,100 ng/mL)均能提高水牛卵母细胞体外成熟率,降低卵母细胞的凋亡率,以30 ng/mL效果明显(P<0.05);(3)添加20 ng/mL EGF+30ng/mL IGF-1组卵母细胞体外成熟率和凋亡率分别高于和低于单独添加IGF-1和EGF组。     

卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响

为探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)的添加浓度及脱卵丘细胞时间对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响.试验通过在体外成熟液中添加不同浓度(0、10、15、20、30、40 ng/mL)的EGF来研究其对培养44 h的卵母细胞成熟率以及孤雌胚胎发育的影响;在培养开始后的不同时间(18、24、38、44 h)进行脱卵丘细胞处理来研究不同时间脱卵丘处理对培养44 h的卵母细胞成熟率以及孤雌胚胎发育的影响.结果表明,成熟培养基中添加10 ng/mL EGF能显著提高卵母细胞的卵裂率和囊胚率(P <0.05).共培组和独培组卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞成熟率均低于44 h,但差异不显著(P >0.05);共培组卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞的卵裂率和囊胚率显著高于培养44 h(P <0.05);独培组卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞的卵裂率与44 h无显著差异(P >0.05),但囊胚率显著高于培养44 h后脱卵丘细胞(P <0.05).添加10 ng/mL EGF对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育较好;卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞可提高孤雌胚胎早期发育能力.     

马尾藻属藻类多糖对猪卵母细胞体外成熟及凋亡的影响

本研究就马尾藻属藻类多糖对猪卵母细胞的体外成熟及凋亡进行了探索：试验一证明，体外培养46h～48h时，成熟液添加马尾藻属藻类多糖能促进卵丘细胞扩展，添加20mg/ml马尾藻属藻类多糖能提高核成熟率(41．8%)，与对照组29．3%的核成熟率相比，二者差异显著；试验二证明，添加马尾藻属藻类多糖可延长猪卵母细胞体外存活时问，体外培养第16d，在含有0、5mg/ml、20mg/ml马尾藻属藻类多糖培养液中的猪卵母细胞存活率分别为2．6%、18．9%、23．0%，添加与否差异显著。