香石竹DcERF-1转录因子对切花衰老的负调控作用

以香石竹（DianthuscaryophyllusL.）为材料，克隆得到1个ERF转录因子基因，命名为DcERF-1。氨基酸序列比对及系统进化树分析发现，DcERF-1与拟南芥AtERF-1的同源性最高，属于Ⅸ（B3）亚组。实时荧光定量PCR显示，DcERF-1表达量在花中最高，且在花瓣自然衰老和乙烯诱导的衰老过程中都呈现先上升后下降的趋势。DcERF-1定位于细胞核中。DcERF-1在香石竹花瓣中瞬时过量表达后，花瓣褪色速度明显延缓，离子渗透率明显降低；DcERF-1被瞬时沉默后，花瓣褪色速度显著加快，离子渗透率显著升高，衰老标志基因Dc SAG12表达量显著上调。酵母单杂交试验证明乙烯信号转导途径核心转录因子DcEIN3能直接结合DcERF-1的启动子。双荧光素酶瞬时表达试验证明DcERF-1能抑制乙烯生物合成途径中ACC氧化酶基因Dc ACO4的表达活性。综合结果表明Dc ERF-1负调控香石竹切花衰老。     

大蒜MADS-box基因AsPI的克隆及表达分析

B类MADS-box基因在调控显花植物的花瓣和雄蕊发育过程中发挥关键作用。为初步了解大蒜花发育的分子机制,以‘阿城紫皮’大蒜(Allium sativum)的花蕾为试材克隆了AsPI(Gen Bank登录号为KY272748)。AsPI的cDNA长939 bp,开放阅读框为615 bp,编码204个氨基酸。推导的氨基酸序列显示,AsPI编码的蛋白质包含高度保守的MADS结构域(1~57氨基酸)和保守的K结构(76~140氨基酸),AsPI蛋白具有PI亚家族特有的序列特征:MADS区特征丝氨酸残基、K区高度保守序列KHExL以及C–末端的PI基序。序列比对、功能域分析及系统发育分析结果表明,AsPI属于单子叶植物B功能基因PI亚家族。半定量和实时RT-PCR检测AsPI在大蒜不同组织器官中的表达模式,结果表明,在花蕾中高丰度表达,在花茎中表达量中等,在根、假茎、嫩叶、保护叶等营养器官中表达量极低甚至不表达。     

香石竹DcMAPK1和DcMAPK2的克隆及功能初#br# 步分析

 分离了香石竹（Dianthus caryophyllus）两个促分裂原活化蛋白质激酶（mitogen-ac-tivated protein kinase,MAPK）基因cDNA 全长,分别命名为DcMAPK1 和DcMAPK2,其中DcMAPK1 与拟南 芥AtMAPK6 高度同源。DcMAPK1 在香石竹花瓣衰老过程表达增加,乙烯处理显著促进其表达,瞬时抑 制DcMAPK1 后切花瓶插寿命显著延长。而DcMAPK2 在花瓣衰老过程中组成型表达,乙烯处理对其表达 无显著影响,瞬时抑制DcMAPK2 对切花瓶插寿命无显著影响。     

香石竹DcMAPK1和DcMAPK2的克隆及功能初步分析

分离了香石竹(Dianthus caryophyllus)两个促分裂原活化蛋白质激酶(mitogen-ac-tivated protein kinase,MAPK)基因cDNA全长,分别命名为DcMAPK1和DcMAPK2,其中DcMAPK1与拟南芥AtMAPK6高度同源。DcMAPK1在香石竹花瓣衰老过程表达增加,乙烯处理显著促进其表达,瞬时抑制DcMAPKl后切花瓶插寿命显著延长。而DcMAPK2在花瓣衰老过程中组成型表达,乙烯处理对其表达无显著影响,瞬时抑制DcMAPK2对切花瓶插寿命无显著影响。     

洋葱花发育B类MADS-box基因AcDEF的克隆与表达分析

 以紫皮洋葱常规品种‘RUPI’为试材,通过RACE方法克隆了AP3/DEF同源基因AcDEF,并用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR研究AcDEF在洋葱各类器官中的表达模式。GenBank登录号为JX661502的AcDEF基因长1 014 bp,开放阅读框长度为675 bp,编码224个氨基酸。系统发育分析表明,AcDEF基因属于单子叶B功能基因家族的AP3/DEF亚家族。表达模式分析显示,AcDEF在花器官中特异表达,其中在花瓣、雄蕊内高丰度表达,在花葶和膜状总苞中微量表达,在心皮中表达水平极低,在无性营养器官如根、假茎、叶片和鳞茎中无表达。在开花过程中,各花器官中AcDEF转录物的积累呈动态变化;在花瓣和雄蕊发育过程中AcDEF均高丰度表达,但在完全开放花的花瓣和雄蕊中表达量略有降低;在花葶、膜状总苞和心皮中表达量递减,在完全开放花的膜状总苞和心皮中AcDEFAcDEF基因的序列结构和表达模式具有单子叶物种AP3/DEF基因的特征,属于paleoAP3进化系。的表达量很低。     

唐菖蒲质膜水孔蛋白基因GhPIP1;1 的克隆及表达分析

 采用RT-PCR和RACE技术从唐菖蒲（Gladiolus hybridus‘Eerde’）花瓣中克隆得到1个质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins,PIPs）类的水孔蛋白基因,命名为GhPIP1;1。该基因cDNA 全长1 130 bp,包含867 bp完整开放阅读框（ORF）,编码288个氨基酸。克隆和分析相应的gDNA序列（2 098 bp）表明,其包含由4个外显子和3个内含子组成的编码区序列。氨基酸序列分析表明GhPIP1;1具有水孔蛋白家族高度保守的2个NPA（Asn-Pro-Ala）基序。同源性分析显示GhPIP1;1氨基酸序列与同科的荷兰鸢尾（Iris hollandica）PIP1氨基酸序列的同源性达94%。半定量RT-PCR分析表明,GhPIP1;1在唐菖蒲花瓣、雄蕊、雌蕊、茎、苞片和叶片等均有表达,但表达量以花瓣中最高,叶片中最低;GhPIP1;1在花蕾至花朵盛开期间的表达水平较高且变化不明显,但在花朵盛开后的萎蔫过程中表达水平明显降低。     

牡丹切花ERF转录因子基因的分离与表达分析

利用已获得的‘洛阳红’牡丹花瓣转录组数据库,筛选得到3个与植物乙烯响应因子ERF蛋白同源性较高的Unigene序列,利用RACE及RT-PCR技术,设计特异性引物对3个ERF基因最大阅读框进行扩增并测序。生物信息学分析表明PsERF1、PsERF2和PsERF3分别含有长为1 158、747和609 bp的开放阅读框,编码383、248和202个氨基酸残基,且均含有1个典型的AP2结构域。进化分析表明3个牡丹ERF转录因子分别属于ERF亚家族的B2组、B1组和B3组。利用实时定量PCR分析了3个ERF基因在牡丹乙烯敏感型品种‘洛阳红’和乙烯不敏感型品种‘雪映桃花’不同花器官（花瓣、雄蕊、雌蕊和萼片）以及不同发育级别切花花瓣中的表达情况。结果表明,PsERF1在2个品种花瓣中的表达量显著高于其他花器官,其表达量在‘洛阳红’切花发育过程中逐渐增加,而在‘雪映桃花’切花发育过程中逐渐降低,推测PsERF1可能对牡丹切花的乙烯响应具有重要的调控作用,PsERF2和PsERF3则可能同时参与了多种信号途径。     

石蒜黄烷酮3–羟化酶基因LrF3H 的克隆及表达分析

 采用RT-PCR 和RACE 技术相结合的方法,从石蒜花瓣中克隆到1 个黄烷酮3–羟化酶（F3H） 基因的cDNA 全长序列,全长1 293 bp,包含1 098 bp 的完整开放阅读框,编码365 个氨基酸;氨基酸序 列比对显示该序列编码的氨基酸与水仙的F3H 具有高达91%的同源性,将其命名为LrF3H。二级结构预 测表明,随机卷曲是LrF3H 蛋白最大量的结构元件,而α–螺旋和延伸链散布于整个蛋白中。保守结构 域预测表明该基因编码的蛋白具有典型的F3H 蛋白功能结构域,其保守结构域中含有铁离子及2–O–酮 戊二酸结合位点,属于2OG-FeⅡ_Oxy 双加氧酶超家族。实时荧光定量PCR 分析表明,LrF3H 在整个花 发育过程中均表达,而且从初蕾期到盛开期随着花瓣着色加深表达量逐渐增加,盛开期表达量最高,之 后随着花朵萎蔫表达量下降;在不同器官中,LrF3H 的表达量在花瓣和花葶中最高,而在根、鳞茎和叶 片中都很低,推测该基因在石蒜花色形成过程中起着关键作用。     

香石竹切花水孔蛋白基因DcPIP2的克隆及特征分析

 采用RT-PCR和RACE技术从香石竹（Dianthus caryophyllus L.）叶片中获得质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic protein,PIP）类水孔蛋白（aquaporins,AQP）基因的cDNA全长序列,命名为DcPIP2,GenBank登录号为GU989036。该cDNA全序列长983 bp,包含有858 bp的完整阅读框（ORF）,编码285个氨基酸,分子量约为30.6 kD。克隆相应的DcPIP2基因组全长序列得知,该基因长2 635 bp（GenBank登录号为JF706350?）,包含由3个外显子和2个内含子组成的编码区序列。同源性分析显示,DcPIP2氨基酸序列与陆地棉（Gossypium hirsutum）PIP2;3（ACB42440）、麻疯树（Jatropha curcas）AQP（ABM54183）和巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）PIP2（ACV66986）氨基酸的同源性分别为89%、88%和87%。利用实时荧光定量PCR技术研究表明,DcPIP2基因在香石竹切花的叶片、茎颈部、花瓣、雌蕊、雄蕊和萼片中均有表达,表达量为雌蕊 > 花瓣 > 雄蕊 > 萼片 > 茎颈部 > 叶片。     

月季扩张素蛋白基因在花朵开放过程中的表达及功能分析

以切花月季‘Samantha’为试材,明确了外层花瓣主要在花朵开放前期扩展。从花瓣中克隆鉴定了3个具有α亚族扩张素保守特征域的基因：RhEXPA5、RhEXPA6和RhEXPA7。在月季花朵1 ~ 6级的开放过程中,3个扩张素蛋白基因都有表达,其中RhEXPA7的表达与花瓣快速扩展密切关联;在2级花朵花瓣中RhEXPA5和RhEXPA6的表达几乎不受乙烯影响,而RhEXPA7的表达被乙烯显著抑制。进一步利用35S启动子在拟南芥中过表达RhEXPA7,采用外源ACC处理可明显增加转基因植株幼苗的根毛密度;转RhEXPA7基因种子萌发对ABA的敏感性明显降低,而对NaCl的胁迫耐性明显增加。RhEXPA7与月季花朵开放中花瓣快速扩展进程密切关联,参与了乙烯信号的响应,并可以提高过表达拟南芥的胁迫耐性。     

Biochemical attributes of tea flowers (Camellia sinensis) at different developmental stages in the Kangra region of India

Physiological and biochemical attributes were studied in different developmental stages from unopened bud (stage 1) to full bloom (stage 5) of flowers of tea (Camellia sinensis). The proteins recorded higher levels in stages 1 and 2 and decreased thereafter with development of flowers. Like the tea shoots, flavan-3-ol EGCG and EC were present in highest and lowest amounts, respectively in all stages of flower development. The highest content of flavan-3-ols EGC and EGCG were found in stage 3. The highest proanthocyanidins content was observed in stage 2 and decreased to a minimum at full bloom stage. Polyphenol oxidase, β-glucosidase activities were found to increase from bud to stage 3 where petals started to split and slightly decreased thereafter. Glycosidic bound volatile compounds viz. Linalool oxide cis (3.11%), linalool (22.73%), geraniol (2.69%), 2,4-di-tert-butylphenol (9.71%), methyl palmitate (2.78%), methyl linoleate (2.74%), methyl salicylate (2.62%), α-terpineol (0.33), beta-ionone (1.24%) and nerolidol (0.8%) were present in higher amounts at stage 3 of flower development. The volatile flavour components recorded higher values at stage 3 of flower development with higher contents of linalool, geraniol, linalool oxides, acetophenone, pentadienal, benzaldehyde and hexanoic acid. Antioxidant activity of tea flowers also increased from bud to reach the maximum at stage 3 and decreased to a minimum in the full bloom stage.     

K+/H+逆向转运体基因PpeKEA在桃开花期的表达及对钾肥施用的响应

从‘霞晖8号’桃花中克隆并鉴定了6个K+/H+逆向转运体基因PpeKEA,在转录水平分析其在桃花发育不同时期的表达模式及对钾肥施用的响应,明确关键基因并验证其功能。结果表明,钾肥施用显著增强盛花期桃花的鲜样质量,提高花朵钾素富集水平。PpeKEA1 ~ PpeKEA6在桃花开放不同时期的表达水平存在差异,均在盛花期达到最高,其转录水平对施用钾肥的响应不同;PpeKEA1在整个桃花开放不同时期的表达量较高,钾肥处理显著增强其在花蕾膨胀期和初开期的表达并抑制其在败落期的表达量;表达载体pDR196-shortKEA1能赋予酵母菌感受态细胞AXT3突变体适应高钾环境而正常生长,说明PpeKEA1的C端区域具有调节桃花组织内K+转运和平衡的功能。本研究表明PpeKEA1是一个桃花开放过程中调节K+平衡的K+/H+逆向转运体,并可能在桃树钾素营养的动态平衡中起着重要作用。     

桂花R2R3-MYB家族基因鉴定及其在花开放过程中的表达分析

对桂花（Osmanthus fragrans）R2R3-MYB转录因子进行鉴定和生物信息分析，分析相关基因在花开放过程中的表达，获得了响应相对低温调控桂花花开放和着色等的关键基因。利用转录组数据分析得到35个桂花R2R3-MYB，这些基因均包含R2R3结构域，且高度保守。通过分析MYB基因在19 ℃（花能开放）和23 ℃（花不能开放）处理以及不同组织中的相对表达量发现，OfMYB1、OfMYB12、OfMYB14、OfMYB23、OfMYB24随着花的开放表达量逐渐升高，其中OfMYB1和OfMYB14在盛花期的花瓣中表达量最高，表明其可能参与桂花着色的过程；而OfMYB4、OfMYB5、OfMYB17、OfMYB28、OfMYB34在花开放过程中的表达量呈先升高后降低的趋势，尤其是OfMYB5、OfMYB17在花芽（圆珠期）中表达量最高，表明其可能参与了花开放过程的调控。     

黄瓜MADS-box基因家族生物信息学分析及CsMADS-box AGL62的克隆

分别以全雌系D1104-2-4、强雌系D1158♀-2、雌雄异花同株D0528-2为母本,与1个雌雄异花同株父本D0708-2杂交获得杂种一代,调查开花初期、根瓜期、盛果期3个时期雌性相关农艺性状,筛选出差异显著的组合进行转录组测序分析进而分析黄瓜杂交组合间MADS-box家族的差异基因。结果表明:以全雌系D1104-2-4为母本的杂种一代C15-114在雌花数、雌花节率上均具有超亲优势,3个杂交组合F1均具有早熟的中亲优势。转录组分析结果发现,以全雌系D1104-2-4为母本的杂种一代基因表达情况显著的偏向母本,挑选的37个黄瓜MADS-box家族基因只有6个与母本有表达差异,17个与父本有表达差异。生物信息学分析并命名了1个差异最显著的基因Cs MADS-box AGL62,该基因全长745 bp,编码187个氨基酸,编码的蛋白属于线粒体中不稳定的亲水性跨膜蛋白,NCBI比对结果表明该蛋白是1个转录因子,系统进化分析发现其与甜瓜中AGL62同源性最高,在黄瓜中该蛋白和其他黄瓜AGL62亚型属于同一分支并且属于I型。     

枣花分化发育过程及其内源激素动态研究

为了研究枣花形成及调控机制,以鲜食枣品种‘七月鲜’为试材,观察花芽分化发育过程,并对内源激素含量进行检测。结果表明,枣花形成包括花芽分化和花发育两个阶段,单花分化需11 d,分6个时期（未分化期、分化初期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和雌蕊分化期）,花发育历经7个阶段（花蕾期、蕾裂期、萼片平展期、花瓣平展期、雄蕊平展期、花丝萎蔫期和子房膨大期）。枣吊发育过程中IAA含量显著降低,枣花中IAA则表现为蕾裂期极显著上升,子房膨大期又极显著下降;ABA含量在枣吊长5 cm时极显著升高后缓慢下降,在枣花中的变化与IAA相似,在雄蕊平展期极显著降低;GA3含量始终处于较低水平,枣吊长5 cm时显著增加,而后缓慢降低,在枣花中则是蕾裂期极显著降低后一直稳定在较低水平。以上结果显示,在枣花形成过程中,花芽孕育期需要较低水平的IAA和较高水平的ABA和GA3,需要较低的IAA/GA3及较高的ABA/GA3和ABA/IAA;开花期则需要高水平的IAA、ABA、ABA/GA3和IAA/GA3,对GA3和ABA/IAA的需求相对较低。     

牡丹NCED 基因的克隆和表达分析

 通过RT-PCR和RACE技术克隆得到了牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）中编码9–顺式–环氧类胡萝卜素加双氧酶蛋白（NCED）的一条cDNA基因全长（暂命名为Ps-NCED1）。进化树分析显示Ps-NCED1的氨基酸序列与葡萄、马铃薯、胡萝卜等植物中的NCED一致性均达到了70%以上。通过与拟南芥中CCD（类胡萝卜素分解加双氧酶）家族氨基酸序列比对后发现,Ps-NCED1与调控ABA合成的At-NCED3一致性最高。对花朵中内源ABA的研究发现,ABA在花朵蕾期及衰老期含量较高,盛开期时含量较低,表明ABA对于植物的开放衰老具有促进作用。相对荧光定量PCR分析发现：在花朵完全开放的牡丹植株中,Ps-NCED1在根、茎、叶、花托、萼片、花瓣、心皮、雄蕊中的表达量以在根和雄蕊中较高,在叶和萼片中最低。在外源ABA处理的牡丹花瓣中,Ps-NCED1表达量变化与内源ABA含量变化具有相同的趋势,推测该基因是调控内源ABA含量的主要基因。     

乙烯对‘班克海尔’和‘杨妃出浴’芍药切花开放和衰老的影响

以‘班克海尔’和‘杨妃出浴’芍药切花为试材,研究了乙烯利处理对切花开放和衰老的影响;同时从中克隆得到乙烯生物合成和信号转导的9个关键基因PlACS、PlACO、PlACO5、PlETR1、PlERS1、PlETR2、PlEIN4、PlCTR1和PlEIN3,利用qRT-PCR分析这些基因的表达模式。结果表明：‘班克海尔’正常瓶插寿命长于‘杨妃出浴’,两品种均对乙烯敏感;乙烯利明显促进‘班克海尔’花朵开放和衰老进程,抑制‘杨妃出浴’花朵开放进程,并且出现僵花、衰老萎蔫。基因序列分析表明,乙烯合成和信号转导基因在两种切花品种中高度保守,保守性在98%以上。qRT-PCR分析表明,瓶插12 ~ 36 h,乙烯诱导两品种中除PlEIN3外的所有基因上调。瓶插0 ~ 12 h,‘杨妃出浴’中9个基因表达量均较高,内源乙烯合成和乙烯信号转导较为活跃,而在24 ~ 36 h,外源乙烯使‘班克海尔’乙烯生物合成基因表达量升高,乙烯信号转导基因表达量普遍高于‘杨妃出浴’。推测‘杨妃出浴’自身合成乙烯的时间较早,对乙烯的反应比‘班克海尔’更为敏感,‘班克海尔’乙烯反应类型可能为末期上升型,而‘杨妃出浴’为乙烯跃变型;两种芍药切花对乙烯的敏感程度以及花朵开放和衰老进程不同,可能与其乙烯生物合成和信号转导相关基因表达模式不同有关。     

基于牡丹类黄酮糖基转移酶基因建立VIGS技术体系

牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews）花色的化学基础研究较为深入,但因其无遗传转化体系,导致花色相关基因的功能验证只能利用其他植物进行旁证。利用保守区段长分别为413和418 bp的牡丹花瓣类黄酮糖基转移酶基因PsUF3GT和PsUF5GT,通过VIGS表达载体,采用二因素三水平的试验体系对目的基因进行沉默。结果表明,PsUF3GT和PsUF5GT的表达量在花斑中（盛开期花瓣,真空抽滤15 min）和非斑中（蕾期花瓣,真空抽滤10 min）分别比空载体处理的花斑中（盛开期花瓣,真空抽滤10 min）和非斑中（蕾期花瓣,真空抽滤15 min）降低了65.0%和85.0%;花斑中总花青苷含量分别降低了24.2%和28.2%,尤其是盛开期花瓣（真空抽滤15 min）处理后3G型糖苷降低了92.2%,蕾期花瓣 （真空抽滤10 min）处理后3G5G型糖苷降低了54.9 %。由此获得了沉默PsUF3GT和PsUF5GT的适宜体系：以盛开期或者花蕾期带花柄的花朵为材料,抽真空渗透10 ~ 15 min后,置于去离子水中暗培养1 d（8 ℃,湿度60%）;之后转移至23 ~ 25 ℃、湿度60%的环境,光照培养3 d后可用于检测和分析。本研究中建立的VIGS体系可有效沉默花瓣中的内源基因,为牡丹基因功能验证及其花色形成的分子机制研究奠定了基础。