津田芜菁BrEGL3 cDNA的克隆及表达分析

 EGL3（Enhancer of Glabra3）蛋白是一种bHLH类蛋白,是一类重要的转录调节因子。为阐释BrEGL3在‘津田’芜菁（Brassica campestris L. ssp. rapifera‘Tsuda’）花青素生物合成中的调控作用,根据拟南芥EGL3基因序列信息设计兼并引物,克隆获得了‘津田’芜菁EGL3基因的全长cDNA序列,命名为BrEGL3,其GenBank登录号为HM208589。序列分析结果显示,BrEGL3全长1 794 bp,包含编码597个氨基酸的开放阅读框,分子量约为66.8 kD。氨基酸结构分析显示该蛋白含有DNA结合域,该结合属于螺旋—环—螺旋家族。氨基酸对比分析表明,BrEGL3与萝卜EGL3蛋白相似性最高,其次为拟南芥中的EGL3。荧光定量PCR检测BrEGL3在芜菁不同组织中的表达结果表明,该基因在有花青素合成的红色芜菁根皮中表达量最高。     

‘红肉蜜柚’CmMYB330基因的分离与表达分析

【目的】分析‘红肉蜜柚’果实汁胞粒化相关的MYB转录因子基因特征与表达模式,探讨MYB转录因子在蜜柚汁胞木质素代谢过程中的作用机制,为研究蜜柚汁胞粒化发生机制提供借鉴。【方法】以‘红肉蜜柚’果实汁胞为试材,参考甜橙MYB全基因组分析,利用生物信息学分析和PCR技术克隆Cm MYB330的编码区序列及其5’端调控序列,并对序列进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR技术对Cm MYB330在‘红肉蜜柚’果实汁胞不同发育时期和不同部位的表达情况进行分析。利用农杆菌介导法将Cm MYB330与GFP的融合表达载体注射转化到烟草叶片中进行亚细胞定位分析。利用酵母双杂交系统对Cm MYB330进行转录激活活性分析。【结果】Cm MYB330的编码区序列长度为942 bp,编码313个氨基酸,预测为核定位蛋白,为典型的R2R3 MYB转录因子。Cm MYB330与甜橙Cs1g19400.1、Am MYB330等亲缘关系近,都属于R2R3 MYB第4亚组。Cm MYB330的5’端调控序列为起始密码子上游-1 748 bp序列,预测该序列含有TATA-box、CAAT-box 2个启动子核心元件,3个MBS,1个AC-I,1个5UTR Py-rich stretch,还有大量激素(如赤霉素、乙烯、水杨酸等)响应元件。Cm MYB330表达量在‘红肉蜜柚’果实汁胞发育过程中有起伏,但总体呈现上升趋势,表达量在花后208 d达到最大,之后开始下降。在转化p-super1300-Cm MYB330-GFP的烟草叶片细胞核中检测到绿色荧光信号,与预测结果一致,说明Cm MYB330定位在细胞核中。在Y2H Gold酵母中,Cm MYB330表现为没有转录激活活性。【结论】克隆了‘红肉蜜柚’MYB转录因子Cm MYB330编码区序列及其5’端调控序列,Cm MYB330属于R2R3 MYB第4亚组,与汁胞粒化相关,为核定位蛋白,同时分析了其在‘红肉蜜柚’果实汁胞发育过程中的表达水平,总体呈上升趋势。为进一步研究Cm MYB330与蜜柚汁胞粒化的关系奠定了基础。     

柑橘CitMYB40转录因子的克隆与表达分析

【目的】分析R2R3-MYB家族成员Cit MYB40的生物学功能,为柑橘抗逆基因筛选和抗逆生理机制探索提供依据。【方法】以‘资阳’香橙(Citrus junos‘Ziyang’)为试材,采用生物信息学和基因表达技术,通过不同器官组织比较、植物激素和非生物胁迫处理,研究Cit MYB40的表达规律,并预测其基本生物学功能。【结果】Cit MYB40基因的开放阅读框(ORF)为984 bp,可编码297个氨基酸残基多肽。该基因含有3个内含子、4个外显子,与葡萄Vv MYB39、胡杨Pe MYB86、马铃薯St MYB34、麻风树Jc MYB34等同源蛋白的相似度为45.57%~53.51%。实时定量分析发现,Cit MYB40基因在植株不同组织器官间的表达具有明显差异,在花中的表达量最高,根中最低。在植物激素作用下,叶中的表达量明显高于根中,但ABA、SA、Me JA、ACC均可诱导Cit MYB40基因在根和叶中的表达。在非生物胁迫下,PEG6000、Na Cl和4℃低温均对Cit MYB40的表达有上调作用,且Na Cl处理时,Cit MYB40基因在根和叶中的表达模式与PEG6000处理相似。【结论】柑橘Cit MYB40在不同组织中的表达存在显著差异,并受不同植物激素和非生物胁迫诱导,推测其在柑橘生长发育和逆境响应中起到了一定的作用。     

猕猴桃‘金艳’和‘红阳’果实转录组的比较分析

转录组比较发现,果肉黄色的‘金艳’猕猴桃成熟果实中优势表达基因的主要功能涉及代谢,而果肉含花青苷呈红色的‘红阳’中的优势表达基因一般与发育相关。猕猴桃果皮和外层果肉部分及内层果肉和果心部分的优势表达基因分别与光合作用和营养储备有关。猕猴桃有相对较多的R2R3类型的MYB基因,几乎所有类型的MYB基因都在果实中表达。MYB-A72位于花青苷合成相关MYB基因分支,其转录本只在‘红阳’中发现,在内层果肉和果心部分的表达水平很高。表达模式聚类分析表明:bHLH-B36和WD40-A126可能参与形成MYB-bHLH-WD40调控复合体,而CHI2、FLS1和CYP98A1可能是受其调控的靶基因。     

香蕉MYB基因克隆和表达分析

【目的】获得香蕉抗逆相关转录因子。【方法】通过随机克隆测序的方法从香蕉根系c DNA文库中获得MYB基因,命名为Ma MYB1。【结果】对扩增获得的c DNA序列进行生物信息学分析,表明Ma MYB1是香蕉MYB基因编码框全长c DNA,包含一个951 bp的最大开放阅读框,编码一个长316个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的2个保守的MYB结构域R2和R3,属于典型的R2R3-MYB基因。系统进化树比对分析表明,Ma MYB1与海枣(XP_008808341.1)和油棕(XP_010914123.1)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明该基因在叶、根和花中的表达量较高。实时荧光定量PCR分析表明Ma MYB1响应干旱、低温、盐和枯萎病菌的侵染等胁迫处理。【结论】Ma MYB1基因在香蕉响应逆境中扮演重要的调控角色。     

炭疽菌诱导的枇杷病程相关基因EjPR1的克隆及其表达分析

以炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)处理的枇杷高抗品种‘Peluches’的叶片为材料,利用RT-PCR和RACE克隆技术,获得枇杷病程相关蛋白1基因的cDNA全长序列,命名为EjPR1。该基因全长为731 bp(GenBank登录号为MN92775),5′端非编码区79 bp,3′端非编码区91 bp。其中ORF阅读框为561 bp,编码186个氨基酸,蛋白质等电点为5.63,分子量为21485.34,其预测结果的理论值与原核表达结果一致。序列分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与其他6种蔷薇科植物PR1蛋白的氨基酸序列相似性在76.41%~94.36%之间。接种炭疽菌后时序表达分析结果表明,该基因在高抗品种‘Peluches’中受病原菌诱导后明显上调表达,在接种后96 h最高,但在高感品种‘森尾早生’中无明显变化,说明EjPR1可能参与了枇杷的抗病防御过程。     

辣椒高赖氨酸蛋白基因Cflr全长cDNA的克隆及其组织表达特征

为了在茄科植物中寻找新的高赖氨酸蛋白基因,以辣椒栽培种‘江蔬7号'的成熟花粉为材料,根据马铃薯和番茄中高赖氨酸蛋白基因的保守序列设计引物,通过RT-PCR技术扩增到一条长390 bp的cDNA片段,继而应用RACE技术克隆了一个辣椒高赖氨酸蛋白基因的全长cDNA,命名为Cflr（GenBank登录号：EU367999）。Cflr基因cDNA全长920 bp,5＇端有84 bp的非翻译区,3＇端具有完整的polyA尾,包含一个编码223个氨基酸的完整开放阅读框。Cflr基因与马铃薯和番茄高赖氨酸蛋白基因cDNA序列的同源性为50%～60%,氨基酸序列的同源性为40%～50%。该基因所编码的蛋白质中赖氨酸含量为21.2%,苏氨酸含量为10.3%,是目前已知赖氨酸含量最高的天然蛋白。半定量RT-PCR结果表明,Cflr基因在辣椒未成熟花药、成熟花粉、花瓣、茎、叶片和根中均有表达,在成熟花粉和花瓣中的表达丰度最高,在叶片中表达量明显减少,而在未成熟花药、茎和根中的表达量极少。     

红肉苹果(Malus pumila var.niedzwetzkyana)MpMYB30基因的克隆及表达载体的构建

MYB转录因子是植物转录因子中最大的家族之一,在转录调节中起着多方面的重要作用。实验利用RACE技术从野生红肉苹果(Malus pumila var.niedzwetzkyana Schneid.)中获得了MpMYB30的全长序列,利用生物信息学的方法对其蛋白进行了分析和预测并将其连接到pCAMBIA-S1300+植物表达载体中。结果表明,该基因全长为1661bp,推导的氨基酸序列经系统发育分析与葡萄MYB30及蓖麻MYB基因相似性最高,命名为MpMYB30,其N端含有2个约55个氨基酸组成的MYB特征结构域。该基因推导的MpMYB30蛋白的分子式为C1790H2794N538O584S12,相对分子质量为41579.8ku,等电点为6.30,不存在信号肽和跨膜区域,蛋白质结构以α螺旋为主。利用XbalⅠ和SacⅠ对重组质粒进行酶切,并将其连接到pCAMBIA-S1300+载体上,通过抗性筛选和PCR酶切检测,证实了MpMYB30基因已经构建到植物表达载体pCAMBIA-S1300+上。     

柑橘CsHB1启动子的克隆及功能分析

以‘伏令夏橙’叶片基因组DNA为模板,克隆了CsHB1启动子5′端转录起始位点上游分别为1 741 bp和1 613 bp的区域序列。序列分析表明这两个启动子区序列相似度为90.7%,存在141 bp的差异片段,该差异片段中含有2个Box4元件。通过PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测,结果表明CsHB1的不同启动子序列含有多种响应元件,如胚乳特异性元件、分生组织表达元件、光反应元件、热应激反应元件、MYB结合位点等。为进一步分析CsHB1启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体prCsHB1::GUS,并用农杆菌介导法转化拟南芥,获得prCs HB1-1::GUS拟南芥纯合材料13株和prCs HB1-2::GUS拟南芥纯合材料10株。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色鉴定,结果表明两类启动子表达载体已成功转入拟南芥中并进行了表达,其表达部位主要集中于愈伤组织和花药中,而在种荚、叶片及幼苗中未检测到GUS蛋白的表达。     

血红鸡爪槭叶片WD40转录因子的克隆及序列分析

以血鸡爪槭叶片总RNA为模板,采用RT-PCR和RACE-PCR的方法,研究血红鸡爪槭叶片花色素苷的合成机理,成功获得了调控花色素苷表达的转录因子WD_(40)基因。结果表明:WD_(40)基因全长1 104 bp,编码337个氨基酸。通过NCBI中的Blast软件对其进行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性进行分析,表明所获得的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其它物种的转录因子WD_(40)有较高的同源性,并且C端含有4个WD重复基序,推断该基因为血红鸡爪槭的WD_(40)转录因子。     

苹果MxIrt1基因的克隆与原核表达

根据植物IRT(Iron Regulated Transporter)家族的功能保守区设计引物,通过RACE法从缺铁胁迫处理的小金海棠根系cDNA文库中克隆得到了Fe²⁺转运蛋白基因cDNA全长,将其命名为MxIrt1(Malus xiaojinensis Iron regulated transporter 1)。将MxIrt1 cDNA片段与pET30a构建原核表达载体pEIrt,转化大肠杆菌BL21。SDS-PAGE电泳检测结果表明,以30℃、0.5mmol·L^-1 IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个40kD的蛋白。为进一步纯化和鉴定目的蛋白提供了试验基础。     

黑莓RuMYB10基因的克隆和表达

【目的】从黑莓中克隆RuMYB10的编码区全长序列,并分析其在黑莓果实发育过程中的表达情况与果实花青素苷积累的关系。【方法】以黑莓基因组DNA为模板,通过同源克隆和SON-PCR技术获得了RuMYB10基因全长编码序列(Accession No.:JQ359611);并以黑莓果实mRNA为模板进行验证。采用实时定量PCR技术检测该基因在果实不同发育阶段的表达水平。【结果】结果表明,该基因编码区全长共1 837 bp,编码216个氨基酸,推导蛋白分子质量为24 863 Da。具有MYB转录因子家族特有的R2R3保守序列。含有两个内含子,第2个内含子长度为750 bp,占全长40.8%;在R3重复单元中存在与bHLH因子互作的‘[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R’序列;而促进花青素苷合成的MYB转录因子3个特征氨基酸残基中的丙氨酸(A)被丝氨酸(S)取代。RuMYB10基因在黑莓果实发育后期,即果实变红到最后变黑的过程中大量表达,与花青素苷的积累相一致。【结论】从黑莓中克隆到包含完整ORF的转录因子基因RuMYB10,具有MYB因子家族结构特征和bHLH因子结合域,且在果实花青素苷积累高峰期表达量最高。     

红皮梨花青苷调控基因PyMYBa的克隆与表达分析

以红皮梨‘奥冠’为试材,采用RT-PCR结合RACE技术获得1个MYB基因,命名为PyMYBa。该基因开放读码框共714 bp,编码237个氨基酸。PyMYBa分子量27.4 kD,等电点8.78。氨基酸序列分析显示,在其N端具有保守的R2R3-MYB结构域,R3-MYB结构域含有bHLH结合基序。进化树分析表明,PyMYBa与花青苷调控MYB转录因子的同源性很高。基因表达结果表明,PyMYBa在梨叶、花、果皮中表达量明显高于果肉,果皮中的表达量与花青苷调控基因PyMYB10相比,无显著差异。遮光及MeJA处理后果皮中PyMYBa、PyMYB10的表达量变化与花青苷合成量变化趋势相似,推测PyMYBa为梨花青苷合成中重要的正向调控因子。通过原核表达试验获得了该基因的重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测结果与预期蛋白分子量一致。     

葡萄miR159及其靶基因VvGAMYB在花发育过程中的作用分析

以‘魏可’葡萄(Vitis vinifera L.‘Wink’)为试材,克隆得到一个葡萄赤霉素信号途径中的MYB转录因子基因Vv GAMYB。该基因开放阅读框(ORF)长1 680 bp,编码559个氨基酸,该蛋白序列含有GAMYB基因家族保守的R2R3 DNA结合域以及Box1、Box2、Box3保守域。洋葱表皮细胞的瞬时表达结果显示,VvGAMYB定位于细胞核中。VvGAMYB和其下游基因Vv LFY在葡萄花发育过程中的表达都呈现先上升后下降的趋势,而赤霉素处理促进了VvGAMYB和VvLFY的表达,从而使开花提前。VvGAMYB是miR159的靶基因,其作用受到miR159的调控。miR159和VvGAMYB的表达负相关,赤霉素处理下调miR159表达从而也降低了对VvGAMYB的裂解作用。由上述结果可以看出,VvGAMYB通过赤霉素开花途径参与葡萄的开花过程。在这一过程中,赤霉素抑制miR159裂解VvGAMYB的作用,从而上调VvLFY的基因表达,参与了调控葡萄开花过程。     

苹果光敏色素作用因子基因PIF 的克隆和分析

 以短枝型苹果（Malus domestica Borkh.）为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得一个光敏色素作用因子（PIF）基因,命名为MdPIF。该基因编码区共2 142 bp,推测其编码713个氨基酸。氨基酸序列分析显示,在其C端具有保守氨基酸结构域bHLH,N端具有光敏色素结合域APB,与其它植物光敏色素结合因子有很高的同源性。实时荧光定量PCR分析表明,在花后20 ~ 110 d,MdPIF在短枝型和非短枝型苹果枝条均能表达,同一生长时期,短枝型苹果枝条的表达量显著低于非短枝型,说明苹果短枝性状可能与MdPIF的差异表达有关。MdPIF在叶片、枝条、花瓣、果实和芽中均能表达,在不同器官中的表达量存在明显差异,在枝条中相对表达量最高,推测其可能主要调控苹果枝条的伸长。     

NaCl、蔗糖和KH_2PO_4对红叶桃离体叶片花色苷合成基因表达的影响

为探明外源化学物质对红叶桃叶片着色的影响及其机制,以‘筑波5号’离体叶片为试材,研究不同浓度NaCl、蔗糖及KH_2PO_4处理对叶片中花色苷生物合成途经相关基因表达水平的影响。结果显示:低浓度NaCl(100和200 mmol′L~(-1))短时间(4 h)处理能提高花色苷合成结构基因CHI、UFGT和转录因子基因MYB10、bHLH33的表达水平;0.3%蔗糖处理8 h对UFGT、MYB10和bHLH33的表达促进作用显著;0.2%KH_2PO_4处理8 h对CHI、UFGT、MYB10、bHLH33和WD40的表达也具有显著的促进作用,而且CHI的表达在一定范围内随蔗糖及KH_2PO_4浓度增大和处理时间延长,效果更明显。除了0.2%KH_2PO_4处理8 h提高了WD40的转录外,NaCl、蔗糖及KH_2PO_4对MYB15和WD40的表达均具有显著抑制作用。     

苹果赤霉素信号转导因子MdGAMYB的克隆和表达分析

以‘长富2号’苹果为试验材料,从其短枝顶芽中克隆得到1个赤霉素信号转导因子MdGAMYB,对其进行生物信息学和表达分析。结果表明,MdGAMYB的开放阅读框(ORF)长度为1 656bp,编码551个氨基酸,蛋白质分子量为59.741 kD。生物信息学分析表明MdGAMYB编码的蛋白存在多个糖基化位点和磷酸化位点;序列分析表明,Md GAYMB和其他物种的GAMYB蛋白有很高的相似性,均含有保守的R2R3 DNA结合域和GAMYB家族所特有的Box1,Box2和Box3保守区域;系统进化分析表明,Md GAYMB与梨、梅花、草莓、枣和葡萄等的GAMYB蛋白具有较高的同源性。实时荧光定量PCR分析表明,Md GAYMB具有组织表达特异性,在叶片、花和芽中的表达量较高。外源GA3处理抑制了花芽孕育和翌年成花,抑制MdGAMYB的表达。在易成花品种‘烟富6号’中的表达量高于难成花品种‘长富2号’。     

鸭梨多酚氧化酶基因CDS区的克隆及表达

以鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)果皮基因组DNA为模板,根据已经发表的多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)基因保守序列设计引物,利用PCR技术,克隆得到鸭梨多酚氧化酶编码区序列,将此核酸序列克隆到载体pGEM-T,酶切鉴定后测序,结果表明该段序列含有1782个核苷酸,编码593个氨基酸。对鸭梨多酚氧化酶基因片段的一致性分析和进化树分析表明,该片段与沙梨(Pyrus pyrifolia,AB056680)、苹果(Malus domestica,L29450)、李(Prunuss alicina,AY866432)以及杏(Prunus armeniaca,AF020786)的一致性分别为99%、96.3%、82%和51.4%,绘制的进化树和形态学分类地位相一致。将该片段连接到表达载体pET39b上,获得的重组子命名为pET39b-PPO,热激法转化表达受体大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG进行诱导。SDS-PAGE分析表明,PPO基因在大肠杆菌中被诱导表达蛋白质相对分子质量约66ku,检测表明具有多酚氧化酶的活性。     

菜薹BrWRKY57的特性及其对BrPPH1和BrNCED3的调控

从菜薹叶片中分离获得1个WRKY转录因子,命名为BrWRKY57.氨基酸序列比对及进化树分析发现BrWRKY57与拟南芥AtWRKY57同源性较高,含有1个WRKY保守结构域,且同属于WRKY转录因子家族Ⅱc亚族.实时荧光定量PCR分析表明,BrWRKY57随着菜薹叶片衰老表达水平升高,外源脱落酸(abscisic a...     

结球甘蓝雌蕊调控转录因子SPT 基因的克隆 与序列分析

以结球甘蓝E1 为材料,提取花蕾总RNA,反转录cDNA。根据拟南芥SPT 基因设计引物,
采用同源克隆的方法从中克隆SPT 基因序列1 085 bp,开放阅读框1 062 bp。通过cDNA 推导得到的氨
基酸序列分析表明,BoSPT 编码353 个氨基酸残基,预测分子量为37.67 kD,pI 为6.83。经过EcoRⅠ和
KpnⅠ限制酶双酶切后,构建原核表达质粒pET43.1a-BoSPT 转化表达菌株E. coli Rosetta（ DE3）,通过
SDS-PAGE 检测该蛋白的表达。经Smart-embl 预测其具有bHLH 家族结构域,位于序列第173～221 位氨
基酸残基处。进化树表明结球甘蓝BoSPT 与拟南芥AtSPT 和筷子芥AlSPT 的亲缘关系较近。BoSPT 基因
的原核表达得到纯化的融合蛋白。