应用抑制性差减杂交技术研究枣缩果病病程相关基因

【目的】了解细交链孢菌侵染枣果实过程的差异表达基因。【方法】以白熟期‘蜂蜜罐’枣的果实为材料,人工接种细交链孢菌,分别在接种0.5、1、2、3和4 d后取样,通过抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了病原菌诱导的差异表达的c DNA消减文库。【结果】PCR鉴定随机挑取的阳性克隆,显示插入片段大小为200~900 bp。随机挑选200个阳性克隆进行测序,利用BLASTx在Gen Bank Nr数据库进行序列比对分析,共获得118个Unigenes。对这些ESTs进行功能分类发现细交链孢菌侵染下诱导表达基因涉及植物细胞内的多种代谢和应答过程,其中包括抗病/防御类、信号传导途径类、新陈代谢类、蛋白质合成和加工类及细胞结构的组成等,尤其以抗病/防御类基因所占比例最大(27.17%)。【结论】通过SSH研究了缩果病病原侵染果实过程的差异表达基因,鉴定到一些与枣缩果病相关的基因,为进一步研究相关基因及今后筛选防治枣缩果病提供理论基础。     

黄龙病诱导下椪柑SSH文库的构建与分析

以实生苗和平椪柑(Citrus reticulate Blanco)为材料,采用抑制性差减杂交技术,分别以感染黄龙病与未感染黄龙病的椪柑叶片为检测方(tester)和驱动方(driver),成功构建了黄龙病诱导的差减cDNA文库。挑选了100个阳性克隆并成功测序得到71条EST,经NCBI基因库同源性比对,有41条非冗余高质量EST序列找到了同源序列,另有10条非冗余未搜索到同源序列。同源序列的基因涉及抗逆防御、运输、能量代谢、光合作用、蛋白代谢、信号转导、抗氧化等代谢途径和生理生化过程。值得注意的是文库中有由病原引起的韧皮部相关的凝集素蛋白的前体积累。挑选了2条进行Q-PCR定量分析,结果表明感病1周表达量增强不大,2周后tester的表达量明显高于driver,说明材料感病早期这些基因表达增强。     

柑橘衰退病毒侵染对寄主植物同工酶及酸性病程相关蛋白表达的影响

以柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)不同致病力株系接种寄主植物,比较分析了寄主植物体内过氧化物酶(peroxidase,POD)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性变化特点。结果表明,该病毒侵染对这2种酶活性的影响因寄主品种和CTV株系而异,CTV强毒和弱毒株系侵染均导致墨西哥莱檬植株中POD活性明显降低;在甜橙上,CTV强毒株系接种植株中POD活性则显著性提高,而弱毒株系接种对POD的活性无明显影响;在对该病毒具有较高抗性的枳壳中,接种CTV不同株系对POD活性均无明显影响。而在接种强毒株系N25的墨西哥莱檬中PPO活性有所增强,在枳壳上则表现为接种植株的PPO活性降低,在甜橙上PPO活性无明显的变化。POD、PPO和酯酶(esterase,EST)同工酶酶谱分析的结果显示,CTV弱毒株系接种枳壳后诱导产生了2条新的EST同工酶谱带,而在其他CTV接种植株上均未诱导表达新的POD、PPO及EST酶谱。酸性病程相关蛋白分析结果显示,CTV强毒株系在甜橙上诱导产生有6条明显的酸性病程相关蛋白条带。     

重庆柑橘主产区衰退病毒组群分析

柑橘衰退病毒(CTV)存在严重的株系混合侵染现象,因此需要用一定的方法对混合株系进行识别。本文应用CPGs/HinfⅠ对采自重庆市6个主要柑橘产区的92个CTV阳性样品进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析,结果发现在甜橙上既有单一株系侵染(CPGs/HinfⅠRFLP组群以3为主),也有混合株系侵染(CPGs/HinfⅠRFLP组群以1、3或1、3、6组群为主),而在柚类上只带单一的CPGs/HinfⅠRFLP6组群。     

柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的二重RT-PCR检测体系的建立与应用

选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。     

柑橘品种对不同基因型柑橘衰退病毒的抑制及变异的影响

为研究不同柑橘品种对柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）不同基因型的抑制效果,将T36、T30、VT和T3等基因型CTV的毒源分别接种于‘赛蒙斯’甜橙、‘邓肯’葡萄柚、‘墨西哥莱檬’和‘强徳勒柚’,运用RT-qPCR技术检测被接种植株中CTV复制水平的差异。结果表明,‘墨西哥莱檬’最适于CTV各基因型的复制。‘邓肯’葡萄柚中VT、T3和T36基因型的复制水平最低。4种柑橘品种对T36基因型CTV都有明显的抑制作用。通过对CTV的CP基因进行分析发现,VT基因型CTV在‘赛蒙斯’甜橙中发生了较大变异。     

运用实时荧光RT-PCR技术检测柑橘碎叶病毒

柑橘碎叶病是由橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)引起的一种重要的柑橘病害,为更快、更准确的检测CTLV,合成了一对特异性引物ASG-Pf和ASG-Pr,建立了运用SYBRGreenI荧光染料法检测CTLV的实时荧光RT-PCR体系,并对该体系的特异性、灵敏性和适用性进行了测试。结果表明,该检测体系能特异的检出CTLV,对测试的衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒和鳞皮病毒都不能检出;灵敏度比常规PCR高100倍;适用性广,可检测出多种柑橘类植物中的CTLV。实时荧光RT-PCR检测整个过程完全闭管,无需PCR后处理,且SYBR GreenI荧光染料成本较低,适用于检测柑橘体内含量较低的CTLV病毒。     

枳感染柑橘衰退病病毒后的应答基因分析

 枳（Poncirus trifoliata L.）高抗柑橘衰退病病毒（Citrus tristeza virus,CTV）,但相关抗性机理仍不为人所知。以嫁接健康枝条的无毒枳作为对照,用Affymetrix柑橘基因芯片分析了感染CTV后枳叶片中基因的表达变化情况。结果共检测到表达量差异倍数≥ 2的基因295个,其中216个表达上调,79个表达下调。BLAST2GO分析发现,差异表达的基因中与抗逆反应相关的基因最多,乙烯、茉莉酸、赤霉素、脱落酸、生长素、水杨酸等植物激素代谢和调节相关基因为数不少,一些编码细胞壁形成或组分相关蛋白的基因差异表达明显。本研究可为揭示枳抗CTV的机理提供了转录组学线索。     

应用实时荧光RT-PCR检测柑橘黄化脉明病毒

为更快速准确检测柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）,根据病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异性引物,通过体系优化得到最佳反应条件,建立基于SYBR GreenⅠ的CYVCV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法可特异性检测CYVCV,而测试的柑橘衰退病毒、碎叶病毒等5种柑橘病毒均不能检测出。灵敏度较普通RT-PCR提高了100倍,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率和相关性系数分别为102%和0.999。对田间样品的检测结果表明,建立的实时荧光RT-PCR适用于检测不同柑橘品种中CYVCV的含量。     

‘岩溪晚芦’椪柑果皮与果肉差减cDNA文库的构建及初步分析

 以‘岩溪晚芦’(Citrus reticulata Blanco)成熟果皮和果肉为材料,采用抑制性差减杂交技术,成功构建了果皮（tester）与果肉（driver）的差减cDNA文库。结果显示：cDNA克隆外源插入片段大小介于100～500 bp之间。成功对411个克隆进行了测序,测序结果经与NCBI基因库中序列进行比较,377个EST 找到了同源序列,它们分属于126个基因,涉及到与色素合成、能量代谢、初级代谢、次生代谢、抗逆防御、蛋白代谢、信号转导、香味形成、果皮软化（衰老）、精油合成、抗氧化代谢等代谢途径和生理生化过程。还有一些基因涉及到三价铁螯合物、反转录转座子gag蛋白、查尔酮合成、硼离子转运、儿茶酚氧位甲基转移酶等功能。功能已知且没有重复的EST共有63个,占总数的49.2%。有5个基因共62个克隆虽在Blast搜索时找到了较高的同源性序列,但功能目前尚未明确,有待进一步深入分析。另有34个基因未搜索到同源序列,可能为新发现的基因。