山东地区棕榈蓟马对甜瓜黄斑病毒的传播

在山东济南董家镇温室内发现疑似感染甜瓜黄斑病毒(Melon yellow spot virus,MYSV)的黄瓜植株,通过RT-PCR检测,获得大约500bp的特异性片段。经测序确认,该病毒为MYSV;对发病植株温室内采集的棕榈蓟马进行RT-PCR检测,发现33.3%的棕榈蓟马体内携带MYSV。室内试验中,MYSV感病株率随着带毒棕榈蓟马数量和取食时间增加而明显升高,表明棕榈蓟马能有效传播MYSV,其种群数量和取食时间对MYSV的传播具有显著的影响,生产中可通过防控棕榈蓟马预防MYSV的传播。     

柑橘褪绿矮化相关病毒LAMP检测体系的建立

根据GenBank登录的柑橘褪绿矮化相关病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)的移动蛋白(MP)基因序列设计了一组特异性引物,经体系优化,建立了CCDaV的环介导等温核酸扩增(LAMP)检测方法。结果显示该方法能特异扩增CCDaV,与其他5种柑橘病原物(柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒和柑橘黄龙病菌)不发生反应;灵敏度为PCR的100倍,与实时荧光PCR的灵敏度相同。用LAMP方法对50个田间样品进行检测,与PCR和实时荧光PCR的检测结果一致,证明该方法可用于田间样品的检测。该LAMP检测方法可特异、灵敏、快速地对CCDaV样品进行检测。     

苹果锈果类病毒实时荧光PCR检测方法的建立

【目的】建立苹果锈果类病毒(ASSVd)检测灵敏的方法。【方法】根据Gen Bank中ASSVd的RNA序列设计特异性引物ASSVd-F和ASSVd-R,利用实时荧光PCR方法对其进行检测,并对体系的特异性、灵敏性及适用性进行验证。【结果】实时荧光PCR体系能检测至1×10-6的模板浓度,而常规RT-PCR只能检测至1×10-4,由此可知,实时荧光PCR体系灵敏度高于常规RT-PCR 100倍;引物特异性强,能特异检测ASSVd,对苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)均不能检出;适用性广,可检测出植物不同部位的ASSVd。【结论】所建立的方法能够灵敏检测ASSVd,特异性强,适用性广。     

番茄细菌性溃疡病菌的定性PCR检测方法

以2个番茄溃疡病菌株和其它6种植物病原菌为试验材料,以micA、cytC、TomA等3个特异性基因为检测靶标,采用检测引物设计与优化、特异性测试、灵敏度测试等方法,研究建立番茄溃疡病菌的定性PCR检测方法。结果表明:依据这3个基因建立的PCR检测方法可特异、精准检测番茄溃疡病菌,其中,以TomA基因为检测靶标的方法灵敏度可达到5copy/μL或103 cfu/mL,优于另外2种方法,为番茄溃疡病菌的早期诊断提供了快速、准确的技术手段。     

马铃薯S病毒PVSO株系RT-LAMP检测方法的建立及应用

为建立一种马铃薯S病毒普通株系PVSO快速、灵敏的RT-LAMP可视化检测方法。根据马铃薯S病毒普通株系的CP核苷酸序列设计4条引物,以感染PVS的马铃薯叶片总RNA为模板,采用一步法RT-LAMP,在62 ℃下反应60 min,扩增产物利用琼脂糖电泳分析和钙黄绿素染料显色判断结果,同时对其特异性和灵敏性进行测定。结果表明,建立的RT-LAMP方法可特异地对PVSO进行检测,检测灵敏度为RT-PCR的100倍。对33份马铃薯样品检测表明,RT-LAMP与RT-PCR方法检测结果基本一致。因此建立的PVSO的 RT-LAMP可视化检测方法简便,特异性强,灵敏度高,适合PVSO的快速检测。     

杧果露水斑病病原菌枝状枝孢霉的巢氏PCR检测方法的建立

【目的】杧果露水斑病是当前生产上影响杧果产业的重要病害之一,因潜伏期长常在发病初期不易被察觉而错过防治适期,建立其主要致病菌Cladosporium cladosporioides的快速准确检测方法,对于该病的早期诊断和及时防控尤为重要。【方法】将该病菌的ITS序列与NCBI中的数据大量比对后,在差异位点大的区域设计了8对引物,通过筛选获得两对特异性良好的引物及其扩增条件。【结果】两对特异性引物分别是ML-SF9/ML-SR5和ML-SF10/ML-SR10,扩增条件:94℃4 min;94℃45 s,65℃45 s,72℃1 min,36周;72℃10 min,特异条带大小分别为408 bp和424 bp。为了提高检测的灵敏度,又与真菌通用引物ITS1/ITS4结合后,建立了杧果露水斑病病原菌的两套巢式PCR快速检测体系,可检测病菌DNA的含量最低为3.55×10-9ng·μL-1,比常规PCR灵敏度提高了1万倍,且能实现对潜伏期果实的特异性检测。【结论】此技术操作简单、特异性强、灵敏度高,为杧果露水斑病的早期诊断提供了新方法。     

基于重组酶聚合酶扩增技术（RPA）的柑橘溃疡病菌检测方法

根据柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri ssp. citri,Xcc)基因组的保守序列设计特异引物,通过对引物浓度、反应温度和反应时间条件优化,建立了柑橘溃疡病菌重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)检测方法。该方法无需PCR仪等复杂设备,在39℃恒温反应30 min即可完成检测过程,快速简便。该检测方法与其他柑橘病原无交叉反应,特异性强;检测灵敏度是普通PCR的100倍,与实时荧光定量PCR基本一致。对71个柑橘样品进行检测,RPA检测出溃疡病阳性样品22个,与PCR、实时荧光定量PCR检测结果一致。     

葡萄根癌病菌的快速检测技术

根据葡萄根癌病菌核糖体基因间隔片段(16S-23S Ribosomal DNA Intergenic Spacer,ITS)特异区域设计,合成了一对引物,建立了快速检测葡萄根癌病菌的PCR方法,并对反应条件进行优化,组装成快速检测试剂盒。结果表明:只有葡萄根癌病菌能扩增出大小为758 bp的特异性条带,而非葡萄根癌病菌均未能扩增出任何条带。检测灵敏度达10个细菌/μL左右,且稳定性好,经多次反复冻融,扩增条带未发现有明显变化。通过对田间病样进行检测,证实该试剂盒具有操作简便、快速(4 h左右完成检测)、灵敏度高、特异性强、重复性和稳定性好等优点。     

红掌根腐病病原鉴定及其PCR 检测方法

 利用真菌通用引物ITS1 和ITS4 扩增红掌根腐病菌转录间隔区并进行序列测定,通过序列 比较,设计了1 对红掌根腐病菌的特异引物SF1/SR2,对30 个红掌根腐病病原菌、8 种其它真菌和2 种 细菌基因组DNA 进行PCR 扩增。结果表明,只有红掌根腐病菌获得572 bp 的特异带。使用引物SF1/SR2 对华丽腐霉进行PCR 扩增,其检测灵敏度在DNA 水平上可达1 pg。运用设计的引物从红掌根腐病菌基 因组DNA 以及人工接种和自然发病的红掌植株中扩增到572 bp 的特异片段,实现了对红掌根腐病菌的快 速可靠的检测。     

黄瓜上甜瓜黄斑病毒寿光分离物的初步鉴定及序列分析

在山东寿光黄瓜保护地种植区采集到疑似感染甜瓜黄斑病毒(Melon yellow spot virus,MYSV)的黄瓜病叶,采用RT-PCR对其进行检测,将扩增产物连接到pEASY-T1 Simple克隆载体后进行测序,结果显示目的片段的大小为505bp,与预期结果一致;序列同源性比对分析结果表明,黄瓜上MYSV寿光分离物与中国三亚的MYSV-Sanya分离物(甜瓜-GQ397254)和中国台湾MYSV-TW(西瓜-FJ386391)亲缘关系较近,同源性可达到98%。     

柑橘黄化脉明病毒RT-LAMP检测方法的建立

柑橘黄脉病由柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）引起,是中国近年来新发生的一种柑橘病害。根据CYVCV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示该方法能特异扩增CYVCV,与其他6种柑橘病原物（柑橘衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒、鳞皮病毒、柑橘裂皮病类病毒、柑橘碎叶病毒和柑橘黄龙病菌）不发生反应;灵敏度为RT-PCR的10倍;田间样品的检出率为63.33%,与RT-PCR的结果一致,适用于田间样品的检测。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染CYVCV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。     

重组酶聚合酶扩增技术在番茄黄化曲叶病毒检测中的应用

番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）是引起番茄黄化曲叶病毒病的病原,在生产中造成严重危 害,开发快速准确的检测方法对该病害的防控具有重要意义。依据番茄黄化曲叶病毒DNA-A 基因序列,设计用于重组酶聚 合酶等温扩增（RPA）检测的特异性引物,建立了TYLCV 的重组酶聚合酶等温扩增检测方法,并分析该方法的特异性和灵 敏度。结果表明,建立的TYLCV-RPA 方法可从TYLCV 阳性的番茄样品中扩增出343 bp 的特异性条带,反应条件为37 ℃ 恒温下40 min,扩增时间短,对设备要求低,且与番茄其他病毒无交叉反应,特异性好,灵敏度可达到PCR 方法的10 倍, 适用于TYLCV 的快速检测。     

侵染节瓜的3种病毒多重PCR检测体系的建立

 根据侵染节瓜3种病毒——小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）、番木瓜环斑病毒（PRSV）和黄瓜花叶病毒（CMV）的外壳蛋白基因保守区序列设计特异引物,在建立各种病毒单项PCR技术的基础上,通过优化多重PCR反应条件,初步建立了能同步、快速、灵敏地检测这3种病毒的多重PCR检测体系,为节瓜病毒病原的检测提供了理论与技术支持。     

新疆哈密瓜病毒的DAS-ELISA检测和分子鉴定

为了明确当前新疆哈密瓜病毒病的主要毒原种类及其遗传分化,为哈密瓜病毒病害的防治提供科学依据,对吐鲁番、鄯善、昌吉等哈密瓜主产区的病毒病调查、采样,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS–ELISA）和RT-PCR技术对侵染哈密瓜的7种主要病毒及瓜类重要检疫性病毒--黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）进行检测和分子鉴定。结果表明：在所检测的121个样品中,黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）的检出率最高,为70.2%;西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus,WMV）和小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）次之,分别为62.0%和37.2%,甜瓜坏死斑点病毒（Melon necrotic spot virus,MNSV）的检出率仅为2.5%,CGMMV、南瓜花叶病毒（Squash mosaic virus,SqMV）、番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus W,PRSV-W）和烟草坏死病毒（Tobacco necrosis virus,TNV）未检测到。CMV、WMV、ZYMV在田间分布广泛,2种及3种病毒的复合侵染发生普遍（60.19%）。对各病毒分离物进行CP基因扩增、序列测定和系统发育分析,确定了CMV新疆哈密瓜分离物归属于CMV亚组ⅠB。ZYMV、WMV和MNSV与已报道的病毒株系CP基因核苷酸序列具有较高的同源性,但存在一定的变异,ZYMV和WMV具有明显的地域分化现象。     

葡萄种质资源的RAPD分析

以采自新疆维吾尔自治区葡萄瓜果开发研究中心的180份葡萄材料为试材,采用改良CTAB法提取葡萄DNA,进行了RAPD分析;同时从已发表文章中选出96个适合于葡萄RAPD分析所用随机引物进行引物筛选,旨在对供试葡萄品种进行亲缘关系的分析.结果表明:DNA产率和纯度都较好,产率绝大多数都在100 ng/μL以上,可以用于RAPD分析;筛选出的21个条带较多且清晰的引物,通过聚类分析,180份材料共分为7类.