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建立了葡萄蚕豆萎蔫病毒(Grapevine fabavirus,GFabV)的实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测技术。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系(扩增效率103.8%,相关系数0.998),灵敏度是常规RT-PCR的1 000倍,并具有特异性。采用RT-qPCR和常规RT-PCR方法对葡萄不同发育时期及不同部位的316个样品进行检测,结果表明RT-qPCR方法对GFabV的检出率(96.8%)明显高于RT-PCR(70.8%)。RT-qPCR对休眠枝条中GFabV的检出率达100%,对其他部位样品的检出率均在92%以上,明显高于RT-PCR(42%~97%)。各个发育时期样品GFabV的RT-qPCR检出率(85%~95%)也普遍高于RT-PCR(70%~90%)。该技术对于田间样品的检测适用范围广。 相似文献
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对青海省循化县的辣椒病毒病进行调查,采集到部分叶片表现萎蔫和皱缩症状的样品,该症状与蚕豆萎蔫病毒2(BBWV2)引起的症状相似。为准确鉴定是否为与该病害相关的病毒,将采集的20个辣椒样品用特异性引物进行RT-PCR检测,其中13个样品检测结果为阳性。在20份循化县辣椒样品中,有13份样品被确认感染了蚕豆萎蔫病毒2(BBWV2)。基于核苷酸序列的系统发育分析表明,检测到的病毒与BBWV2聚类在一起,与其他地区或国家分离物的序列一致性较高,与蚕豆萎蔫病毒1(BBWV1)和野芝麻轻型花叶病毒(LMMV)分离物的序列一致性相对较低。结果表明该辣椒样品感染的病毒是BBWV2。 相似文献
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根据GenBank数据库中的沙地葡萄茎痘伴随病毒(grapevine rupestris stem pitting-associated virus,GRSPaV)全基因组序列设计了2组巢式RT-PCR检测引物repF1/R1→repF2/R2和cpF1/R1→cpF2/R2,扩增片段分别为902 bp和438 bp。通过对第1轮PCR扩增中引物组合repF1/R1-cpF1/R1、dNTPs、Taq DNA聚合酶和cDNA用量的优化,以及第2轮PCR扩增中引物组合repF2/R2-cpF2/R2、dNTPs和Taq DNA聚合酶用量的优化,建立了GRSPaV双重巢式RT-PCR检测方法。采用该方法对109份葡萄样品进行检测,结果显示,2对普通PCR引物RSP 52/53和RSP 9F/9R的合计检出率为65.1%,2组单一巢式PCR引物repF1/R1→repF2/R2和cpF1/R1→cpF2/R2的检出率总和为93.6%,而双重巢式PCR引物组合repF1/R1-cpF1/R1→repF2/R2-cpF2/R2的检出率也达到93.6%。该技术在保证检测效率的基础上降低了检测成本,适用于大量田间样品的检测。 相似文献
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百合三种病毒的多重RT-PCR检测 总被引:14,自引:1,他引:13
根据基因库中黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)、百合无症病毒(Lily symptomless virus, LSV)的外壳蛋白基因序列,设计了3对特异引物,通过对扩增条件进行优化,建立了同时检测CMV、LMoV和LSV的多重RT-PCR检测方法。该方法可以从带有CMV、LMoV和LSV的样品中同时扩增出3条大小与试验设计相符的657 bp (CMV) 、428 bp(LMoV)、171 bp (LSV)的特异性多重RT-PCR扩增带。扩增产物测序表明,CMV、LMoV和LSV 3种病毒与GenBank中登录的亚洲和荷兰多数分离物核苷酸同源性在90%以上,地域差异不明显,外壳蛋白序列高度保守。 相似文献
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芋花叶病毒的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析 总被引:1,自引:0,他引:1
采用RT-PCR技术对采自中国湖北、浙江和山东的91份芋[Colocasia esculenta(L.)Schott]样品的芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,DsMV)进行了检测,检出率为26.4%。对其中14个DsMV分离物的317 bp扩增产物(为外壳蛋白基因的一部分)序列分析的结果显示,各分离物内的核苷酸变异相对较低,而分离物间存在较大的分子变异,相似性为68.3% ~ 97.8%。对来自湖北和浙江的2个DsMV分离物DsMV-SCS和DsMV-JH的外壳蛋白基因(coat protein gene,cp)进行了测序,全长分别为951 bp和987 bp,二者cp核苷酸和氨基酸序列相似性分别为79.0%和82.3%,与已报道DsMV的cp核苷酸和氨基酸序列相似性分别为73.0% ~ 92.1%和74.8% ~ 98.2%,在构建的系统发育树上聚在两个不同的簇,各DsMV分离物的系统进化关系与其寄主和地理来源无显著相关性。 相似文献
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【目的】建立西番莲夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus, TeMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的双重RT-PCR检测体系。【方法】根据TeMV和CMV的外壳蛋白(coat protein, CP)基因序列,分别设计两对特异性引物,并对引物组合浓度、退火温度和循环次数进行优化。【结果】优化结果显示:TeMV和CMV最佳引物组合浓度分别为2.0 mmol·L~(-1)和8.0 mmol·L~(-1);最佳退火温度为57℃;最佳循环次数为35次。【结论】灵敏度分析结果显示,在样品c DNA原液稀释到10-5时,仍能检测到两种病毒扩增出的目的条带。同时,以健康组培苗作为对照组,应用建立的双重RT-PCR检测技术对采集于福建省不同产地的36份西番莲样品进行了病毒检测,发现有8份样品同时感染两种病毒,8份样品仅感染TeMV,10份样品仅感染CMV。本研究可为西番莲TeMV和CMV的检测提供便利。 相似文献
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选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。 相似文献
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为了挖掘大白菜抗TuMV基因的多样性,制定抗TuMV的遗传改良策略和综合防治措施,对抗TuMV的显性位点进行QTL分析。以大白菜对TuMV高抗的‘89B’和高感的‘强势’为亲本,构建F_2群体。采用人工磨擦接种TuMV法对F_2群体进行单株接种鉴定,经卡平方测验F_2群体抗、感植株分离比例不符合3︰1(χ~2=4.8χ_(0.05)~2=3.84),非单基因遗传,为数量位点控制。选取表型高抗和高感的F_2单株各40株进行混池,对2个极端池以及2个亲本进行重测序分析。通过计算抗、感池与亲本间的△(SNP-index),获得两个抗TuMV位点区域,物理位置为A07染色体的13.9~14.4 Mb和A08染色体的16.4~17.4 Mb。上述两个区域共筛选出具有多态性位点的基因68个,其中6个基因与植物抗性有关,其编号分别为Bra028499、Bra028500、Bra016311、Bra016312、Bra016313和Bra016314,其中Bra028499和Bra028500编码抗病蛋白,Bra016311、Bra016312、Bra016313和Bra016314编码抗TMV蛋白。Bra028499、Bra028500、Bra016311和Bra016314含有TIR-NBS-LRR特殊结构域。在已定位克隆的植物抗病基因中,大约80%属于NBS基因家族,因此推测这些基因可能与大白菜抗TuMV有关。 相似文献
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沙地葡萄茎痘相关病毒RT-PCR检测 总被引:1,自引:1,他引:1
为建立快速、灵敏、可靠的沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)检测方法,以总RNA为模板,采用2组GRSPaV特异性引物对29个品种52株葡萄样品进行RT-PCR检测,并对扩增产物进行了测序和分析。结果表明,从20个品种25株葡萄样品中检测到GRSPaV,平均带毒株率为48.1%。外壳蛋白基因片段引物F1/R1从25个样品中扩增到905bp的特异片段,复制酶基因片段引物F2/R2从20个样品中扩增到498bp的特异片段,表明GRSPaV外壳蛋白基因比复制酶基因更加保守,RT-PCR检测时采用F1/R1则更为适宜。PCR产物测序结果与GenBank中登录的GRSPaV序列比较,同源性为97.90%~98.11%。 相似文献
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运用实时荧光RT-PCR技术检测柑橘碎叶病毒 总被引:1,自引:0,他引:1
柑橘碎叶病是由橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)引起的一种重要的柑橘病害,为更快、更准确的检测CTLV,合成了一对特异性引物ASG-Pf和ASG-Pr,建立了运用SYBRGreenI荧光染料法检测CTLV的实时荧光RT-PCR体系,并对该体系的特异性、灵敏性和适用性进行了测试。结果表明,该检测体系能特异的检出CTLV,对测试的衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒和鳞皮病毒都不能检出;灵敏度比常规PCR高100倍;适用性广,可检测出多种柑橘类植物中的CTLV。实时荧光RT-PCR检测整个过程完全闭管,无需PCR后处理,且SYBR GreenI荧光染料成本较低,适用于检测柑橘体内含量较低的CTLV病毒。 相似文献