柑橘黄脉病毒侵染对柠檬光合特性和叶绿体超微结构的影响

以3年生尤力克柠檬实生苗为试验材料,嫁接柑橘黄脉病毒(CYVCV)现症后,测定叶片的叶绿素含量、叶绿素荧光参数、光合参数和酶活性.与健康植株相比,病株中叶绿素含量(Chl)、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、潜在光化学效率(Fv/Fo)和最大光化学效率(Fv/Fm)较对照植株显著降低,初始荧光(Fo)、过氧化氢酶(...     

中国柑橘叶斑驳病毒和碎叶病毒发生状况及其分子特性研究

柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)和柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)均可侵染柑橘的不同种。为明确CLBV及CTLV在中国柑橘上的发生状况和分子特性,采用RT-PCR技术对来源于中国7个省的342份和346份柑橘样品进行检测,检出率分别为9.6%和11.0%。对14个CLBV分离物和15个CTLV分离物的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因部分序列分析显示,CLBV分离物间cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为82.1%~100%和88.1%~100%,CTLV分离物的cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为89.5%~100%和92.5%~100%。测定的14个CLBV分离物在系统进化树中聚为2个组;而CTLV分离物分组不明显,该病毒的系统进化与寄主来源无明显关系。     

柑桔黄脉病毒研究进展

柑桔黄脉病毒Citrus yellow vein clearing virus(CYVCV)引起的柑桔黄脉病是国内新近发生的一种柑桔病害。CYVCV可侵染大多数柑桔属植物,其中以对柠檬和酸橙的为害最为严重,造成植株树势衰弱、产量降低。根据国内外针对CYVCV的研究报道,笔者对CYVCV的分类地位、生物学特征和分子生物学特性进行了总结,重点阐述了运用生物学、血清学和分子生物学检测CYVCV的研究进展,并介绍了CYVCV的防治方法,对亟待解决的问题进行了展望,旨在为该病的防治提供参考。     

不同类型柑橘中黄脉病毒衣壳蛋白基因的保守性及复制水平

为研究不同柑橘品种对柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)变异的影响,将CYVCV毒株CQ01嫁接接种于4类共35个柑橘品种,对不同植株中CYVCV的衣壳蛋白(CP)基因进行分析,结果发现仅有少数位点发生了变异。运用RT-qPCR技术检测不同柑橘品种中CYVCV的相对含量,发现甜橙类品种中CYVCV的相对含量最高,墨西哥来檬中CYVCV的相对含量最低。植株中CYVCV的含量与其症状不存在明显的关联。     

柑橘品种对不同基因型柑橘衰退病毒的抑制及变异的影响

为研究不同柑橘品种对柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）不同基因型的抑制效果,将T36、T30、VT和T3等基因型CTV的毒源分别接种于‘赛蒙斯’甜橙、‘邓肯’葡萄柚、‘墨西哥莱檬’和‘强徳勒柚’,运用RT-qPCR技术检测被接种植株中CTV复制水平的差异。结果表明,‘墨西哥莱檬’最适于CTV各基因型的复制。‘邓肯’葡萄柚中VT、T3和T36基因型的复制水平最低。4种柑橘品种对T36基因型CTV都有明显的抑制作用。通过对CTV的CP基因进行分析发现,VT基因型CTV在‘赛蒙斯’甜橙中发生了较大变异。     

柑橘衰退病毒研究进展

综合有关文献,就柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus,CTV)的生物学特征、分子生物学、抗病毒基因工程和柑橘衰退病的检测、鉴定及防治作一综述。重点讨论CTV株系分化、基因组和亚基因组RNA、CTV的血清学和分子生物学检测方法。目前的研究表明,CTV通常以不同株系的混合物存在,并且和其他病原形成复合侵染,各分离物之间存在明显的遗传多样性。不同株系的分离纯化、各株系间的交叉保护及CTV和橘蚜的互作关系还有待深入的研究。     

8种柑橘类植物对柑橘碎叶病毒分子组成的影响

探究不同柑橘类型对柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)变异的影响,为研究寄主-CTLV的互作关系提供基础。将CTLV分离株HH和XLB分别嫁接接种于8种柑橘类植物,对CTLV分离株和获得的亚分离株样品进行CP基因的限制性长度多态性(RFLP)和单链构象多态性(SSCP)分析,以及序列比较。结果表明HH和XLB与其各自在不同柑橘植株上的亚分离株的CP/Hinf I RFLP酶切图谱无明显差异;混合侵染的CTLV分离株HH和其亚分离株之间的SSCP谱型存在差异,株系构成单一的CTLV分离株XLB与其亚分离株间的SSCP谱型差异不明显。通过序列分析进一步证实CTLV在不同寄主上其CP基因有几个核苷酸位点发生了变异。CTLV可能受寄主植物的影响发生了变异。     

柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的二重RT-PCR检测体系的建立与应用

选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。     

一步法RT-PCR检测柑橘鳞皮病毒

柑橘鳞皮病是一种极具破坏性的柑橘病害,广泛分布于南美及地中海地区。我国目前缺乏对该病害的快速检测技术。以柑橘鳞皮病毒(CPV)的外壳蛋白基因(CPG)为靶标,初步建立了一步法RT-PCR快速检测体系,扩增产物与NCBI数据库中已知CPVCPG的核苷酸序列进行比对,2者序列间同源性超过99%。     

柑橘褪绿矮化相关病毒LAMP检测体系的建立

根据GenBank登录的柑橘褪绿矮化相关病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)的移动蛋白(MP)基因序列设计了一组特异性引物,经体系优化,建立了CCDaV的环介导等温核酸扩增(LAMP)检测方法。结果显示该方法能特异扩增CCDaV,与其他5种柑橘病原物(柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒和柑橘黄龙病菌)不发生反应;灵敏度为PCR的100倍,与实时荧光PCR的灵敏度相同。用LAMP方法对50个田间样品进行检测,与PCR和实时荧光PCR的检测结果一致,证明该方法可用于田间样品的检测。该LAMP检测方法可特异、灵敏、快速地对CCDaV样品进行检测。     

柑橘黄化脉明病毒RT-LAMP检测方法的建立

柑橘黄脉病由柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）引起,是中国近年来新发生的一种柑橘病害。根据CYVCV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示该方法能特异扩增CYVCV,与其他6种柑橘病原物（柑橘衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒、鳞皮病毒、柑橘裂皮病类病毒、柑橘碎叶病毒和柑橘黄龙病菌）不发生反应;灵敏度为RT-PCR的10倍;田间样品的检出率为63.33%,与RT-PCR的结果一致,适用于田间样品的检测。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染CYVCV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。     

应用实时荧光RT-PCR检测柑橘黄化脉明病毒

为更快速准确检测柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）,根据病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异性引物,通过体系优化得到最佳反应条件,建立基于SYBR GreenⅠ的CYVCV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法可特异性检测CYVCV,而测试的柑橘衰退病毒、碎叶病毒等5种柑橘病毒均不能检测出。灵敏度较普通RT-PCR提高了100倍,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率和相关性系数分别为102%和0.999。对田间样品的检测结果表明,建立的实时荧光RT-PCR适用于检测不同柑橘品种中CYVCV的含量。     

柑橘黄化脉明病毒DTBIA检测方法的建立

通过柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）兔源多克隆抗体（一抗）及Ap标记羊抗兔IgG（二抗）最佳稀释度等条件优化建立了CYVCV直接组织点免疫（Direct tissue blot immunoassay,DTBIA）检测方法,并对其特异性、稳定性和检测效果进行了评价。试验结果显示,一抗、二抗稀释比例分别为1︰8 000和1︰2 000时,DTBIA检测CYVCV效果最佳;应用所建立的DTBIA方法对携带9种不同柑橘病害的柑橘样品进行检测时,仅携带CYVCV样品呈阳性反应;柑橘黄脉病样品植物组织印迹后,印迹膜于4 ℃保存,90 d内可进行有效的CYVCV检测;对田间不同柑橘品种利用DTBIA法检测CYVCV,其结果与一步法RT-PCR符合率为97.92%。可见,该CYVCV检测方法快速、简便、稳定、特异及可靠,可推广应用于田间快速检测CYVCV,对于防范柑橘黄化脉明病毒大面积传播流行具有重要的现实意义。     

柑橘黄化脉明病毒的TGB基因生物信息学分析及亚细胞定位

柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)是一种正义单链RNA病毒。其基因组含有6个开放阅读框(ORF),其中ORF2、ORF3和ORF4组成了三基因连锁结构(triple gene block,TGB)。以感染CYVCV的尤力克柠檬[Citrus limon(L.)Burm.f.]植株的总RNA为模板,扩增和克隆了CYVCV的TGB基因,并开展了其编码蛋白的理化性质和分子特性等生物信息学分析;进而通过In-Fusion~?技术构建了TGB各基因的亚细胞定位载体,经农杆菌介导转化洋葱表皮细胞并在荧光显微镜下进行亚细胞定位观察。生物信息学分析结果表明,CYVCV-TGB具有与Potexvirus属病毒TGB相似的理化性质和分子特性,可能参与病毒在寄主中的运动且需要外壳蛋白的参与。亚细胞定位结果显示,TGBp1定位于细胞壁(膜)上,TGBp2和TGBp3主要定位于细胞壁(膜),少量呈星点状定位于细胞内。研究结果为揭示CYVCV在寄主中的运动机理奠定了基础。     

柑橘黄化脉明病毒基因组的长链RT-PCR扩增、克隆及序列分析

为了建立柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)基因组长链RT-PCR扩增体系,构建其全长cDNA克隆,为深入了解CYVCV分子特性及其致病机理奠定基础。根据GenBank中CYVCV基因组序列和5′RACE扩增结果设计引物。以感染CYVCV的代代酸橙(Citrus aurantium‘Daidai’)植株总RNA为模板进行长链RT-PCR扩增,得到CYVCV全基因组cDNA,克隆至pGEM-Teasy载体,并进行序列测定与分析。结果显示,建立了一步扩增CYVCV全基因组的长链RT-PCR方法,扩增出约7.5 kb的目标片段;所获得的4个CYVCV全基因组cDNA序列与GenBank中已登录的相关毒株的核苷酸序列同源性为93%~99%。     

浙江南部柑桔病毒病和类似病毒病鉴定

应用指示植物对采自浙南8个县(市、区)28个乡镇田间40个柑桔品种133份样品的带毒情况进行了检测。结果表明:浙南至少已发生4种柑桔病毒病或类似病毒病害。感染了碎叶病毒(TLV)的有8个品种,衰退病毒(CTV)18个品种,裂皮病类病毒(CEV)11个品种,黄龙病类细菌(CYS)2个品种。共计有27个品种感染1种或1种以上病毒类病害,其中感染3种的有2个品种,感染2种的有9个品种。     

小西葫芦黄花叶病毒山东南瓜和丝瓜分离物全基因组序列分析

在山东泰安采集到两个表现黄花叶症状的丝瓜和南瓜样品中检测到小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV);通过RT-PCR和RACE方法获得了两个分离物的全基因组序列,分别命名为CN:Cm:17(丝瓜分离物)和CN:Lc:17(南瓜分离物)。结果表明,CN:Cm:17和CN:Lc:17基因组除Poly(A)尾巴外,分别含有9 593和9 591个核苷酸(Nucleotides,nt),通过多聚蛋白策略编码一个含3080个氨基酸的多聚蛋白。CN:Cm:17和CN:Lc:17在氨基酸水平上一致率为96.7%;CN:Cm:17与韩国分离物KR:RDA:07的氨基酸一致率最高(97.8%); CN:Lc:17与CN:CJLX30535:14和CN:spider131932:13的一致率最高(98.4%)。重组分析发现,CN:Lc:17具有显著重组事件,为KR:KR-PA:05和CN:Cm:17的重组体。基于多聚蛋白编码序列的系统进化聚类结果显示分组与分离物的地理起源存在密切相关性,所有中国分离物分别聚集在A-Ⅴ和A-Ⅵ亚组。