芸薹属大白菜Aux/IAA基因家族的生物信息学分析

Aux/IAA基因家族在生长素诱导的早期做出响应,是生长素早期应答的3类基因家族之一。现主要从基因组水平研究白菜Aux/IAA基因的分布及特征。结果表明:从BRAD共检测到59条白菜Aux/IAA基因,不均等分布在白菜的全部10条染色体上。通过多重比对和基序探测结果显示,40条白菜Aux/IAA基因具有4个保守基序,其它基因的保守基序则有不同程度的分化。系统进化分析表明,Aux/IAA基因家族可分为7个亚家族。通过表达模式预测发现,白菜Aux/IAA基因家族表达模式也有较大差异。     

桃脂氧合酶基因家族生物信息学及其表达特性分析

【目的】脂氧合酶(lipoxygenase;LOX;linoleate oxygen oxidoreductase;EC1.13.11.12)作为一种重要的酶,广泛参与植物生长、发育、成熟、衰老及植物抗逆过程,因其重要作用一直是国内外研究的重点和热点。研究利用生物信息学方法对桃LOX基因家族进行发掘和预测,以期为桃LOX家族基因鉴定和功能分析提供基础信息,并在分子水平上为桃品种改良及采后保鲜提供明确的候选基因。【方法】采用生物信息学方法研究了桃LOX基因家族成员数目、系统进化关系、假定蛋白质结构及分类,运用q RT-PCR技术研究LOX基因家族在桃特异组织中的表达模式。【结果】桃LOX基因家族包含13个假定蛋白,9-LOX和13-LOX类型分别有6个成员,另外存在1个特殊类型,与苹果具有相似性;桃LOX蛋白氨基酸序列一致性在33.76%~90.84%;13个LOX家族成员绝大多数是两性氨基酸,9-LOX类型的6个家族成员的理论等电点都小于7,13-LOX类型各等电点没有规律;13个蛋白质的二级结构除ppa017962m外以无规则卷曲为主要构成元件;染色体定位分析表明,LOX家族基因并非平均分布在桃的8条染色体上,其中6号染色体上桃LOX基因分布最多,ppa017962m未定位在任何特异染色体上;q RT-PCR的组织特异性表达结果表明,LOX基因家族主要在果实和茎中的相对表达量较高。【结论】分离并鉴定了13个桃LOX家族基因,其不均匀地分布在桃染色体上;多数桃LOX基因主要在果实和茎部表达;ppa001634m、ppa001082m、ppa001216m、ppa001016m、ppa017962m在果实中的表达量最高,可能参与调控桃果实衰老软化过程。     

桃GLV多肽受体PpRGI基因家族的生物信息学及表达分析

为进一步了解GOLVEN(GLV)多肽在桃果实成熟软化中的分子机制,通过生物信息学鉴定桃基因组中GLV多肽激素受体Pp RGI基因家族,并通过qRT-PCR检测其在溶质型和硬质型桃中的表达水平,检测NAA处理硬质型桃果实和外施多肽处理桃愈伤组织后Pp RGI基因家族的表达水平。结果表明:PpRGI均含有LRR保守结构域,并且在N末端均含有信号肽,聚类分析表明其分为2类。荧光定量PCR分析PpRGI1、PpRGI3、PpRGI4在溶质型桃‘中油桃13号’的不同组织中表达,并且在溶质型桃果实不同发育期中的表达量显著高于硬质型桃果实,其中PpRGI1在不同肉质类型中表达量最高。NAA及多肽处理之后PpRGI1表达均升高。PpRGI1可能参与桃多肽激素的生物信号转导途径。     

桃EXPANSIN基因家族序列特征及其在根结线虫侵染后的诱导表达分析

【目的】探索扩张蛋白(EXPANSIN)基因家族在桃抗南方根结线虫过程中的作用。【方法】首先对桃基因组中的EXPANSIN基因家族进行生物信息学分析,然后利用转录组测序对EXPANSIN基因在南方根结线虫侵染免疫型(‘红根甘肃桃1号’)和高感型(‘贝蕾’)桃种质根系后的不同时期的表达丰度进行分析。【结果】桃EXPANSIN基因家族有27个成员,这些成员分布在8条染色体上,以第2和第5号染色体上最多,均为5个。基因结构分析显示,这些基因包含1~5个外显子,大部分EXPANSIN基因包含DPBB_1和Pollen_allerg_1保守结构域,聚类分析将这27个成员分为2大类,其中有8个与拟南芥中已注释的与线虫侵染过程中巨细胞形成有关的蛋白质聚在一起,均属于EXPA亚类。转录组分析表明,这8个EXPANSIN基因在对南方根结线虫免疫和高感2种种质不同时期的表达趋势存在明显差异,其中ppa010314m、ppa010226m在‘贝蕾’中表达量随侵染上调,而在‘红根甘肃桃1号’中上调不明显,这2个基因可能是参与南方根结线虫侵染过程中巨细胞形成的关键基因。【结论】桃EXPANSIN家族成员在结构上高度保守,其中多个成员可能参与调控桃抗南方根结线虫过程。     

黄瓜Aux/IAA基因家族的生物信息学分析

Aux/IAA基因家族是一个典型的被生长素诱导而表达的基因家族,可以被生长素快速诱导表达。采用生物信息学方法在黄瓜基因组中确定了28个Aux/IAA基因,除4号染色体外,其他6条染色体均有分布,编码蛋白序列在70~427个氨基酸残基之间,22个黄瓜Aux/IAA蛋白具有完整的4个保守结构域,进化方式多样化。该研究结果有助于黄瓜生长素信号转导途径的解析。     

桃GH3基因家族的生物信息学分析及其在果实发育中的表达

为了探索生长素酰胺合成酶（GH3）基因家族在桃（Prunus persica L. Batsch）果实生长发育过程中的作用,对桃基因组中的GH3基因家族进行生物信息学分析,对它们在溶质型和硬质型油桃果实发育成熟阶段的表达水平进行qRT-PCR检测。检测结果表明：桃GH3基因家族有8个成员,分别为PpGH3-1 ~ PpGH3-8,聚类分析表明其分为GroupⅠ和GroupⅡ两类。实时荧光定量PCR分析表明GroupⅡ型基因（PpGH3-1、PpGH3-2、PpGH3-3、PpGH3-4和PpGH3-5）在溶质型油桃中的表达水平高于硬质型油桃,其中PpGH3-3和PpGH3-4最为明显。经NAA处理后的硬质型油桃果实PpGH3-1、PpGH3-3、PpGH3-4和PpGH3-7相比对照上调表达,其中PpGH3-3上调表达最为明显。试验结果表明生长素在桃果实成熟软化过程扮演着重要的角色。     

香蕉Aux/IAA基因家族的全基因组鉴定及表达分析

对香蕉Aux/IAA基因家族进行了全基因组鉴定,获得分布于除1号染色体外的10条染色体上的44个家族成员,其CDS长度为378～1 062 bp,其中10个存在选择性剪切体。它们编码的蛋白包含125～353个氨基酸,均为不含信号肽的亲水蛋白。序列分析结果表明:该基因家族成员多为5个外显子和4个内含子的基因结构,编码蛋白多具有4个典型的保守基序。亚细胞定位预测结果显示,Aux/IAA成员多定位于细胞核、细胞质和叶绿体,定位情况与保守结构域有一定相关性。MaIAA31是该家族中唯一预测有跨膜区域且亚细胞观察定位在胞外的成员。进化树分析结果显示,香蕉Aux/IAA可分为2大类8个亚组。顺式作用元件分析结果显示该家族成员启动子包含激素、光、非生物以及生物胁迫响应相关元件。通过分析部分成员在不同激素和逆境处理下的表达情况发现:MaIAA基因的表达受多因素调控,其中MaIAA27变化显著,MaIAA15响应干旱和盐胁迫,MaIAA25在热、低温和机械损伤胁迫下显著上调,暗示它们在香蕉响应这些逆境的过程中发挥作用。     

西瓜YUCCA 基因家族鉴定及在果实成熟过程中的表达分析

以栽培西瓜自交系97103 为试材,测定不同发育时期果肉及果皮中游离态吲哚-3- 乙酸（IAA）含量。结果显示：果实发育后期,果肉中IAA 含量显著上调,果皮中IAA 含量则一直保持较低水平,推测果肉中IAA 可能对西瓜果实成熟与含糖量积累起重要作用。利用生物信息学手段,鉴定了西瓜生长素合成色氨酸依赖途径限速酶基因家族YUCCA,并对其在果肉与果皮组织的表达水平进行qRT-PCR 检测。结果表明：西瓜YUCCA 基因家族包含 10 个成员,所有YUCCA 基因均含有FMOs 保守结构域,聚类分析表明其分为两大类。基因结构分析显示这些基因包含 2～5 个外显子。ClYUCCA4、ClYUCCA6、ClYUCCA10b 及 ClYUCCA10c 等4 个YUCCA 基因在西瓜果肉中表达,且都在果实发育后期表达明显上调。ClYUCCA4 及ClYUCCA10c 在果肉与果皮中的表达量变化与IAA 含量变化趋势一致,且在其他组织中几乎检测不到表达,推测其可能参与调控西瓜果实的成熟。     

不同肉质桃果实成熟过程中细胞壁相关酶活性变化

以软溶质型“霞晖5号”、硬溶质型“保佳红”、硬质型“保佳俊”、不溶质型“金童6号”桃果实为试材，采用果实细胞壁降解相关酶活性测定方法，研究了不同肉质桃果实成熟过程中硬度、呼吸强度、细胞壁降解相关酶活性及基因PG21、PME的表达差异对果实软化的影响，以期阐明不同肉质桃果实成熟过程中细胞壁相关酶活性变化差异。结果表明：软溶质型桃“霞晖5号”果胶甲基酯酶(PME)、纤维素酶(Cx)活性高于其它3种肉质类型的桃果实，多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性高于不溶质型桃“金童6号”和硬质型桃“保佳俊”,表明PG、PME、Cx活性与软溶质型桃“霞晖5号”软化进程密切相关。4种肉质类型的桃果实β-半乳糖苷酶(β-gal)活性差异不显著，表明β-gal不是影响不同肉质类型的桃软化进程的关键因素。4种不同肉质类型的桃果实在成熟发育后期PG21基因相对表达强度整体呈上升趋势，“霞晖5号”和“保佳俊”PME基因相对表达量在整个果实发育后期均呈上升的趋势，酶活性与相关基因表达量变化趋势基本一致。     

桃生长素酰胺水解酶基因家族序列特征及其表达分析

生长素酰胺水解酶（IAA-Leucine Resistant1-like Hydrolase,ILL）可催化生长素结合态释放游离态生长素（IAA）。为了深入研究桃ILL基因家族的功能,对桃基因组中ILL基因家族成员的数量、在染色体骨架的分布、编码蛋白质的结构、基因表达模式和编码氨基酸的进化树分类等方面进行了研究。桃基因组中共鉴定出了9个ILL基因,它们分布在4个染色体骨架上（scaffold 1、2、3和7）。在桃中编码ILL蛋白家族的基因成员分别为：PpILR1、PpILR2、PpILR3、PpILR4、PpILL1、PpILL2、PpILL3、PpILL4和PpILL5,所有这些预测的蛋白都含有M20结构域和M20二聚化结构域。运用荧光定量实时PCR技术对该基因家族在桃果实生长发育各阶段的表达水平进行了分析,结果显示：ILL 基因家族中的数个成员在果实不同发育阶段表达水平有变化,其中PpILR1的表达量在果实生理成熟期明显上调。     

桃生长素反应因子和生长素/吲哚乙酸蛋白家族基因的克隆及表达分析

生长素对果实发育起着重要的调控作用。生长素反应因子（auxin response factor,ARF）和生长素/吲哚乙酸蛋白（auxin/indoleacetic acids protein,Aux/IAA）是生长素信号转导系统中的两个关键因子,在转录水平上对生长素参与的生理活动进行调控。为探索生长素调控桃果实发育的机制,选取ARF家族的1 个基因PpARF1,Aux/IAA 家族的5 个基因PpIAA3、PpIAA9、PpIAA17、PpIAA26 和PpIAA29,克隆其全长cDNA 序列并进行生物信息学分析,对它们在桃果实不同发育时期中果皮和种子的表达进行qRT-PCR 检测。序列分析表明：这6 个基因的编码区全长分别为2 037、594、1 194、618、384 和723 bp,分别编码678、197、397、205、127 和240 个氨基酸;氨基酸序列比对分析显示桃PpARF1 蛋白序列和草莓的FvARF1（XP_004300014.1）同源性最高,达到90.56%,PpIAA 家族的5 个蛋白同源性很低,只有23.77%;荧光定量PCR 结果显示,在花后52 d（果实发育硬核期）,PpIAA3 和PpIAA17 在中果皮中的表达量显著升高;PpIAA26、PpIAA29 和PpARF1 在种子中的表达量显著升高。预示生长素可能在桃果实发育硬核期发挥着重要的调控作用。     

茄子生长素诱导基因SmIAA19的克隆和分析

以茄子单性结实品系‘D-10’为材料,以茄子单性结实差减文库中差异表达的EST片段Z732为依据,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得了生长素诱导基因SmIAA19（登录号KP114221）的cDNA序列。该基因全长为800 bp,开放阅读框为558 bp,编码185个氨基酸。氨基酸序列比对结果表明该基因编码的氨基酸序列具有Aux/IAA基因家族的典型结构域和保守基本序列,在分子进化上与马铃薯距离最近,与番茄处于同一分支。qRT-PCR分析表明,在低温（门茄）和适温（四门斗）条件下,SmIAA19在单性结实和非单性结实的子房和果实发育过程中均有表达,单性结实品系中的表达量显著高于非单性结实品系,单性结实品系开花当天子房中的表达量最高,非单性结实品系在低温和适温条件下的表达量均保持在较低的水平。IAA含量检测结果表明,在不同结实性茄子品系的果实发育过程中IAA含量的变化趋势基本相同,在果实发育前期含量较高,且在低温（门茄）条件下,不同结实性果实中IAA的含量变化与SmIAA19基因的表达量变化相一致。SmIAA19基因可能与茄子的单性结实有关。     

茄子3个Aux/IAA基因的克隆及表达分析

以茄子单性结实品系‘D-7-1’为材料,克隆到3个新的Aux/IAA基因,分别命名为SmIAA3、SmIAA4和SmIAA9,其CDS长度分别为573、564和915 bp,分别编码190、187和304个氨基酸;系统进化树分析表明,3个蛋白均属于Aux/IAA家族蛋白,与番茄亲缘关系较近,且均具有Aux/IAA家族蛋白的DomainⅠ、Ⅱ、Ⅲ 和 Ⅳ 保守结构域;其分子量分别为21.50、20.95和32.67 kD,理论等电点分别为7.62、6.02和8.57。实时定量PCR分析表明：SmIAA9基因在单性结实和非单性结实品系茄子中的表达量差异明显,开花前单性结实品系的表达量显著高于非单性结实品系,推测其与茄子单性结实相关。     

甜瓜α–甘露糖苷酶基因促进果实成熟功能的瞬时表达分析

 为了研究α–甘露糖苷酶（α-Man）基因在甜瓜果实成熟过程中的功能,应用农杆菌介导的瞬时表达技术,分别将含有甜瓜α–甘露糖苷酶基因超表达载体pPZP221-Man、两个RNAi载体pART-Man1和pART-Man2的农杆菌菌液注射至甜瓜绿熟期果实,通过观察果实成熟表型初步鉴定该基因的功能。结果表明,菌液浓度OD₆₀₀ = 1.2时果实表型比率最高,在果实蒂部表型居多。α–甘露糖苷酶活性测定结果显示,与非注射部位相比,注射超表达载体部位的组织α–甘露糖苷酶活性较高,而注射RNAi载体的组织α–甘露糖苷酶活性较低。RT-qPCR结果显示,与非注射部位相比,注射pPZP221-Man的部位α-Man基因表达约是对照的1.2倍,而注射pART-Man1和pART-Man2的部位α-Man基因的表达均有所下降,分别是对照的47%和37%。同时对甜瓜果实成熟相关的6个候选基因在注射部位的表达情况进行了分析,结果显示,这些基因在注射超表达载体的果实部位均上调表达;而在注射两种RNAi载体的果实部位均下调表达。这些结果表明甜瓜α–甘露糖苷酶基因在果实成熟过程中具有促进成熟的作用。     

桃果实中miR160a与其靶基因ARF的鉴定及对IAA的响应分析

以水蜜桃品种‘小白凤’果实为试材,利用miR-RACE技术验证了桃mi R160a的精确序列,克隆了其3个ARF靶基因(PpARF18、PpARF17和PpARF18-like)的ORF序列。利用RLM-RACE技术以及qRT-PCR方法对Ppe-miR160a作用于3个靶基因的模式及频度进行了分析。结果表明,Ppe-miR160a的精确序列与预测序列在5′端和3′端均存在1个碱基的差异,其3个靶基因ARF均含有高度保守的B3和生长素响应DNA结合域。RLM-5′RACE结果显示,Ppe-miR160a以裂解的方式作用于3个ARF靶基因,且裂解位点均位于Ppe-miR160a5′端的第9和第10位碱基之间。IAA响应分析表明,与对照相比,IAA处理后的桃果实中Ppe-miR160a以及3个靶基因3′端裂解产物的表达量均显著升高。以上结果表明桃果实中的Ppe-miR160a通过介导其3个靶基因的裂解参与生长素信号途径调控。     

蔗糖转化酶家族基因进化、表达及对草莓果实糖分积累的影响

在草莓蔗糖碱性/中性转化酶家族基因(Fa.A/N-Inv)成员序列分析的基础上,以‘申阳’和‘红颜’草莓为材料,利用实时定量PCR技术分析了Fa.A/N-Inv家族基因在不同条件下的表达模式,利用分光光度法测定了果实发育过程中A/N-Inv酶活性,利用高效液相色谱法分析了果实发育阶段糖分积累规律。结果表明:(1)Fa.A/N-Inv是由8个成员组成的多基因家族;(2)4个Fa.A/N-Invs不仅具有组织特异性,还具有果实发育阶段特异性和品种特异性表达特点;(3)4个Fa.A/N-Invs的表达受细胞分裂素(BA)、赤霉素(GA)和生长素(IAA)诱导;(4)蔗糖和葡萄糖作为A/N-Inv酶促反应的底物和产物,分别对4个Fa.A/N-Invs转录表达起正、负反馈调节作用,此外蔗糖还可作为一种信号分子诱导Fa.A/N-Invs表达;(5)‘申阳’草莓A/N-Inv酶活性在绿果阶段低于‘红颜’,其余阶段均高于‘红颜’;(6)成熟果实中蔗糖含量‘红颜’(50.7 mg·g~(-1) FW)约为‘申阳’(23.2 mg·g~(-1) FW)的2倍。     

‘南通小方柿’乙醇脱氢酶基因DkADH1的克隆及表达分析

以‘南通小方柿’果实为材料,采用同源克隆的方法,获得了柿乙醇脱氢酶基因DkADH1,其全长为1 377 bp,开放阅读框为1 137个核苷酸,编码379个氨基酸,具有ADH基因典型的结构域和功能域,与番茄、苹果等双子叶植物亲缘性较近。以‘南通小方柿’不同组织为材料,采用qRT-PCR方法对DkADH1及单宁生物合成途径中的相关基因的表达进行分析,同时测定了不同时期果实的单宁含量,结果表明在果实发育过程中,可溶性单宁含量逐渐降低,而不溶性单宁含量不断升高;DkADH1基因在茎、叶、花、果实等器官中均有表达,在果皮中表达量最高。随着果实的成熟,DkADH1表达量总体呈上升趋势。柿果实中单宁合成途径中的相关基因DkF3′5′H和DkMYB4随着乙醇处理果实时间的延长表达量呈下降趋势,推测‘南通小方柿’DkADH1能够抑制单宁合成相关基因的表达,从而降低果实可溶性单宁含量。