杧果MiCO基因的克隆与表达模式分析

【目的】克隆杧果(Mangifera indica L.)MiCO基因并探讨其表达模式,为深入研究该基因的功能奠定基础。【方法】根据从杧果转录组测序数据中获得一个MiCO基因全长序列信息,设计基因全长引物,克隆具有不同开花习性的‘四季杧’和‘紫花杧’2个品种的MiCO基因全长序列,对其序列进行生物信息学分析,并利用荧光定量PCR技术对MiCO基因在杧果不同组织以及年周期的表达情况进行分析。【结果】序列分析显示,2个杧果品种的MiCO基因c DNA全长均为1 150 bp,都包含1个966 bp的开放阅读框,编码322个氨基酸,等电点为5.8,‘四季杧’品种的MiCO蛋白分子质量为35.30 ku,‘紫花杧’品种的MiCO蛋白分子质量为35.22 ku;MiCO基因编码的蛋白具有典型的CO同源蛋白结构,包括B-box1、B-box2和CCT结构域;系统进化树表明,杧果MiCO蛋白属于第一类CO蛋白,与拟南芥(Arabidopsis thaliana)At COL4相似性最高而聚类到一起。基因表达分析表明,MiCO基因在杧果不同组织中均表达,但不同组织的表达水平存在差异。年周期表达分析表明,MiCO基因在杧果成花转变期高度表达,而且在来年的5—6月还存在一个小的表达高峰期,但2个品种不同组织中MiCO基因表达存在差异。【结论】克隆获得杧果MiCO基因全长序列,发现2个具有不同开花习性的杧果品种的MiCO基因核苷酸和氨基酸序列高度同源,只存在少许差异。MiCO基因在杧果成花转变期高度表达,说明MiCO基因与杧果成花关系密切。     

杧果叶绿素a/b结合蛋白基因cDNA全长克隆及其序列分析

采用RT-PCR方法克隆得了杧果叶绿素a/b结合蛋白基因(Cab)cDNA全长序列,命名为Mcab(GenBankaccession No.FJ907952)。Mcab基因全长为915bp,编码264个氨基酸,推测蛋白质分子质量为28.19ku,等电点为5.35。同源性分析表明,Mcab基因在不同植物中的一致性为72%～85%。实验分析表明,杧果Mcab基因编码的蛋白中第63～232位有一个捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域,并且在木本植物中非常保守。亚细胞定位分析显示Mcab蛋白被定位于叶绿体,它所编码的蛋白质在绿色植物光合系统中起着重要作用。蛋白二级结构预测显示,Mcab蛋白有8个α-螺旋,5个β折叠区,21个β-转角。研究将有助于进一步了解杧果光合作用的分子机制。     

杧果乙烯受体基因MiETR1b的分离与表达分析

以‘紫花杧’杧果（Mangifera indica L.‘Zihua’）子叶切段为材料,采用RT-PCR结合RACE方法得到乙烯受体基因ETR1的cDNA及基因组DNA全长,命名为MiETR1b。该基因cDNA全长2 530 bp,开放读码框为2 220 bp,编码739个氨基酸;其基因组DNA全长4 116 bp,其中从起始密码子到终止密码子为3 305 bp,含有6个外显子和5个内含子。氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示MiETR1b与MiETR1亲缘关系最近,与CsERS1、DlETR1、TcERS1、PtrETR1有较高的同源性,且具有保守的GAF域和组氨酸激酶域。这些结果表明,MiETR1b为ETR1家族同源基因。荧光定量PCR结果表明,MiETR1b在杧果子叶切段不定根形成过程中在远轴端和近轴端都有表达,其中远轴端0.25 ~ 2 d的表达量显著上调;吲哚丁酸（IBA）和2,3,5–三碘苯甲酸（TIBA）预处理后分别在1 d和6 h显著下调。另一方面,在培养的初期,即0.5 ~ 1 d,乙烯释放量相对较高,4 d及其以后的乙烯释放量急剧下降,表明杧果子叶切段不定根形成过程中有较多乙烯生成,提示MiETR1b可能参与了不定根的形成。     

杧果查尔酮合成酶基因(CHS1)的克隆与表达分析

【目的】克隆鉴定杧果CHS基因,分析其功能,明确杧果不同组织器官中CHS基因表达情况。【方法】以海南种植的6个杧果种的叶片总DNA和c DNA为模板,进行同源性PCR扩增,然后克隆到p MD18-T载体上,进行测序;通过生物学软件预测分析CHS基因编码的蛋白质;运用半定量PCR分析CHS基因表达情况。【结果】测序得到6个杧果种CHS基因c DNA全长为1 173 bp,CHS基因含有2个外显子和1个内含子。基于c DNA序列的NJ系统发育树显示,其与普通杧果(Mangifera indica)CHS1基因同源性最高。CHS1基因半定量表达显示杧果不同器官均表达CHS1基因,但在叶片和花中的表达量较高。【结论】克隆了杧果查尔酮合成酶1(CHS1)基因,半定量分析了杧果不同器官中CHS1基因的表达差异,为下一步研究提高CHS1基因的表达量奠定了基础。     

油梨PaWRI1和PaWRI2基因的克隆、序列分析及表达研究

以‘哈斯’油梨(PerseaamericanaMill.)为试材,通过RACE及RT-PCR技术分别克隆得到2个AP2/EREBP类转录因子WRI1和WRI2基因的c DNA全长,分别命名为PaWRI1(GenBank登录号:MH367865)和PaWRI2(GenBank登录号:MH367866)。其中,PaWRI1基因全长为1 396 bp,含1 155 bp开放阅读框,编码384个氨基酸;PaWRI2基因全长为1 782 bp,含1 287 bp开放阅读框,编码428个氨基酸。PaWRI1和PaWRI2基因属于AP2/EREBP类转录因子家族,其编码氨基酸序列中分别均存在2个和1个典型的AP2/ERF DNA结合位点。实时荧光定量PCR检测结果表明:在油梨果实发育过程中,果肉中PaWRI1基因的相对表达量始终快速上升,PaWRI2基因的相对表达量先少量下降,而后缓慢上升;PaWRI1基因相对表达量变化与油脂积累的变化较一致,PaWRI2基因相对表达量变化与油脂积累的变化不一致。因此,推测在油梨果实发育过程中,果肉中PaWRI1基因可能参与调控油脂积累过程。     

油梨果肉捕光叶绿素a/b结合蛋白基因PaCAB1的克隆、序列分析及表达

以油梨品系"RN-5"为试验材料,克隆出叶绿素a/b结合蛋白同源基因,命名为PaCAB1,其开放阅读框为777bp,编码259个氨基酸。氨基酸序列比较分析表明,PaCAB1独自聚类成为一组,与其他21种物种CAB同源性相对较低。实时荧光定量PCR检测表明,在油梨果肉发育过程中,PaCAB1的表达量逐渐地缓慢降低,到S-III时期降到最低点,其变化趋势与叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b的含量变化趋势一致。     

香蕉miR408b靶基因Chemocyanin的克隆及其在低温胁迫下的表达分析

【目的】研究香蕉中miR408b及其靶基因Chemocyanin在低温胁迫下的表达模式和调控机制。【方法】以三明野生蕉和‘天宝蕉’叶片为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆获得三明野生蕉中的MiChemocyanin基因(MiCHY)和‘天宝蕉’中的MaChemocyanin基因(MaCHY),利用在线网站对MiCHY进行生物信息学分析。【结果】MiCHY基因的cDNA全长为587 bp,开放阅读框381 bp,编码126个氨基酸蛋白,具有Plantacyanin结构域,属于超铜氧化还原蛋白家族。在ORF区的4～24 bp处有一处高度匹配miR408b的结合区(GCTCAGGGAAGGGGCAGTGCG)。RLM-5’RACE分析表明,miR408b主要在靶序列的第7～8个碱基之间剪切靶基因MiCHY的mRNA。序列比对发现,MaCHY基因比MiCHY基因多了82 bp的序列,符合内含子的GT-AG剪切,推测发生了内含子驻留的可变剪接。保守结构域分析表明MaCHY没有Plantacyanin结构域,但也属于铜氧化还原蛋白家族。qRT-PCR结果表明,低温胁迫下,冷敏感的‘天宝蕉’miR408b的表达量上升,MaCHY的表达量降低;在抗寒的三明野生蕉中,miR408b的表达量下降,MiCHY表达量上升,miR408b与MiCHY表达量呈负相关。【结论】miR408b及其靶基因MiCHY可能在香蕉响应低温胁迫中发挥重要作用。     

石榴花青苷合成相关基因PgMYB111的克隆与功能分析

为研究R2R3-MYB转录因子调控石榴花青苷合成的机理,以石榴品系‘榴花红’（红花）和‘榴花白’（白花）为试材,利用同源克隆技术分离出1个调控花青苷生物合成的R2R3-MYB基因PgMYB111(Pg012177.1)。其CDS全长为1 101 bp,编码366个氨基酸。多重比对分析表明,PgMYB111蛋白的N端含有1个R2R3保守结构域,以及1个与bHLH蛋白互作的[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结合位点。系统发育树分析表明,PgMYB111与苹果和扁桃具有较高的同源性,聚为一簇。亚细胞定位试验发现,PgMYB111定位于细胞核。PgMYB111在‘榴花红’中的表达量是‘榴花白’的4.3倍,且‘榴花红’花瓣花青苷含量也显著高于‘榴花白’。烟草瞬时表达结果表明转基因烟草叶片的花青苷含量和基因表达量呈先上升后下降的趋势,均在第5天达到最高,分别是未侵染叶片的3.8倍和8.9倍,pBI121空载叶片的3.17倍和5.57倍。结果表明PgMYB111参与了花青苷合成途径并促进其合成。     

TFL1基因在甜樱桃童期向成年阶段转变过程中的作用

以甜樱桃‘雷尼’为试材,利用桃基因组设计引物克隆获得两个ORF分别为519和516 bp的TFL1基因全长序列,分别编码172和171个氨基酸,均具有保守的PEBP结构域和9个底物结合位点,符合TFL1家族基因的典型特征,分别命名为PaTFL1a和PaTFL1b。对‘雷尼’× 2121杂交组合3年生和4年生实生后代调查发现其始花节位为28.72 ± 1.34,童程为（63.33 ± 3.19）cm;实时荧光定量PCR分析表明其新梢顶端分生组织中,童区内PaTFL1a和PaTFL1b表达量远高于成年区,且成年区内的表达量随着节位增高而增加;对1 ~ 4年生实生后代不同枝龄的顶端分生组织中PaTFL1a和PaTFL1b表达量检测发现随树龄和枝龄的上升其表达量下调明显。因此,PaTFL1a和PaTFL1b基因与甜樱桃童期向成年阶段转变相关。在第30节位新梢成熟叶片中PaTFL1a表达量不随树龄的改变而变化,而PaTFL1b的表达与顶端分生组织中规律一致,可以作为甜樱桃‘雷尼’阶段转变过程的检测标记。     

铝胁迫对辣椒叶绿素及叶绿素荧光的影响

在不同浓度铝胁迫下,以‘红辣椒王ⅡF1’、‘卡其特长条辣906’、‘汴椒1号’和‘苏长红’4个品种为材料,研究辣椒叶片叶绿体含量、叶绿素荧光参数的动态变化,以期为研究辣椒铝胁迫提供理论依据。结果表明,铝处理抑制辣椒叶片叶绿素的合成,从而降低辣椒叶片叶绿素的含量。辣椒叶片叶绿体色素(叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b、叶绿素a/b)含量在低铝浓度(50μmol/L)下呈升高趋势,高铝浓度(200μmol/L)下则均下降。荧光参数的研究表明,随着铝胁迫的增加,初始荧光(F_0)随之增大,最大荧光(F_m)、原初光能转化效率(F_v/F_m)下降,植株抵抗逆境的能力下降,光合电子传递随之减小,最终导致光合速率下降。     

杧果Rab蛋白基因MiRab11的克隆及表达分析

根据前期对杧果（Mangifera indica L.）胁迫差异分析中获得的Rab11 片段,采用RT-PCR结合RACE 技术,从‘四季杧’混合组织材料（叶、茎、花和果实）中克隆了一个Rab11 完整编码区序列,命名为MiRab11。其cDNA 全长902 bp,包含完整开放阅读框657 bp,编码218 个氨基酸。同源性分析表明MiRab11 与葡萄和柑橘的同源性最高（相似度均为97%）。实时荧光定量检测结果表明：MiRab11在杧果叶、茎、花和果实中均有表达,在嫩茎和花后70 d 的成熟果实中的表达较高;在果实形成及发育初期表达量略有下调,但在果实成熟过程中表达量明显上调;逆境胁迫（低温、盐、干旱）处理可引起在叶或茎中上调表达;不同信号物质（脱落酸、水杨酸、双氧水）刺激均可引起叶中的表达上调。结果表明,MiRab11 可能在杧果果实成熟和胁迫反应中发挥重要作用。     

桃果实PpOAT 和PpP5CS 的克隆及其对外源#br# GABA 处理的响应表达

 利用RT-PCR 结合RACE 技术从‘玉露’桃果实中克隆得到Δ1–吡咯啉–5–羧酸合成酶 （P5CS）和鸟氨酸转氨酶（OAT）基因的全长cDNA 序列,分别命名为PpP5CS 和PpOAT（GenBank 登 录号分别为KP973954 和KP973956）。PpP5CS 全长2 511 bp,开放阅读框为2 151 bp,编码717 个氨基酸 组成的蛋白质多肽,5′-UTR 长度为123 bp,3′-UTR 序列长度为235 bp;PpOAT 全长1 686 bp,开放阅读 框1 416 bp,编码472 个氨基酸,5′-UTR 长度为151 bp,3′-UTR 序列长度为119 bp。进化树分析发现, PpOAT 和PpP5CS 与湖北海棠的同源性最高,与MhOAT 和MhP5CS 的相似性分别达到88%和91%。采 用荧光定量PCR 分析了外源5 mmol · L-1 GABA 处理对桃果实0 ℃贮藏期间果实冷害发生和内源脯氨酸 合成关键基因PpOAT 和PpP5CS 表达的影响。结果表明,GABA 处理能显著抑制‘玉露’桃果实0 ℃贮 藏期间果肉出汁率的下降,减轻冷害。通过上调果实中PpOAT 和PpP5CS 的表达,提高内源脯氨酸的合 成和积累,进而增强了果实抵抗低温胁迫的能力,可能是外源GABA 处理减轻桃果实冷害的重要原因。     

早熟梨"新梨7号"不同枝条叶片叶绿素含量的变化

作者研究了早熟梨“新梨7号”在南疆立地条件下不同枝条叶片叶绿素a b含量及a/b值的季节变化。结果表明：无果短枝叶叶绿素a b含量最高，其次为有果短枝叶，营养枝中部叶最低；三类枝叶绿素a b含量年周期变化规律基本一致，为一单峰曲线。有果短枝、无果短枝高峰期出现在7月中旬，而营养枝出现在6月中旬。各类枝叶片9月中旬后开始衰老。有果短枝和无果短枝叶绿素a/b值变化呈高－低－高变化，营养枝叶序叶片叶绿素a/b值变化比较平稳，下部叶片的叶绿素a b含量比上部叶片略高。     

Water transport in relation to expansion and contraction of leaves and fruits of Calamondin orangef

Diurnal fluctuations in fruit diameter and leaf thickness of Calamondin orange trees were measured and related to transpiration from leaves and to internal redistribution of water from fruits to leaves. While trees were well irrigated, leaf thickness began to decline daily around sunrise and to increase in mid-afternoon. Daily shrinkage and expansion of fruits began later than in leaves. The lag in response of leaf thickness changes to changes in vapour pressure deficit of the air was 1 or 2 hours, whereas the lag in response of fruit diameter was 3 or 4 hours. During imposed droughts, daily shrinkage of fruit and leaves continued until later in the day when the trees were well irrigated. Moreover, during a drought, expansion of the tissues at night occurred at a much slower rate than during periods of daily irrigation, or expansion did not occur at all. Movement of water from fruits to leaves on excised branches was indicated by the higher percentage moisture content of leaves on branches bearing fruits than of leaves on branches without fruits.     

甜樱桃DELLA蛋白基因PaGAI的克隆与表达分析

 利用RT-PCR和RACE技术从甜樱桃（Prunus avium L.）嫩叶中克隆了赤霉素信号转导途径中的关键负调控因子DELLA蛋白基因cDNA全序列,将其命名为PaGAI。该基因cDNA全长2 310 bp,开放阅读框ORF为1 788 bp,推测其编码一个含有595个氨基酸残基的多肽链,蛋白质分子量约64 kD。生物信息学分析结果表明,PaGAI编码蛋白具有DELLA蛋白保守结构域,其N端存在两个非常保守的酸性结构域DELLA和VHYNP作为信号感知区域,C端有VHIID、RVER 和SAW结构域作为阻遏区域。PaGAI与其它植物的DELLA蛋白具有较高的同源性,其中与苹果MdRGL2b蛋白同源性最高,达到84%。构建pGEX-4T-1/PaGAI原核表达体系,并转化E. coli BL21,经0.5 mmol · L-1 IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测获得了分子质量为91 kD的融合蛋白,半定量RT-PCR分析表明,PaGAI在花、果实、叶片、韧皮部中普遍表达,在花与韧皮部中的表达远远强于在果实与叶片中的表达。     

1-MCP对贮藏苦瓜生理及品质特性的影响

以‘大肉2号’苦瓜为材料,研究不同浓度1-MCP(0、0.25、0.5、1.0μl·L-1)处理后常温(22±2)℃贮藏中苦瓜呼吸强度、可溶性蛋白含量、维生素C(Vc)含量、丙二醛(MDA)含量的变化,以期筛选出保鲜苦瓜果实的最优处理。结果表明:1-MCP处理可明显抑制苦瓜果实的呼吸速率,延缓MDA积累,降低果实可溶性蛋白、叶绿素和Vc含量的损失,推迟苦瓜后熟衰老进程。各试验处理效果依次为:1.0μl·L-1>0.5μl·L-1>0.25μl·L-1>0μl·L-1,以1.0μl·L-11-MCP处理苦瓜保鲜效果最优。常温下,苦瓜果实货架期可达6 d。     

茶树CsSPMS基因全长cDNA克隆和时空表达分析

为探究精胺合成酶（spermine synthase,SPMS）与茶树（Camellia sinensis）耐寒性的关系,以茶树品种‘迎霜’为试验材料,利用简并引物PCR扩增技术结合5′/3′RACE方法,获得与低温胁迫相关的CsSPMS片段cDNA全长序列（GenBank登录号为KJ580429）。该序列全长1 374 bp,包含1 113 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码371个氨基酸,预测分子量41.28 kD;构建亚细胞定位载体pJIT166-GFP/SPMS,亚细胞定位结果显示CsSPMS定位在细胞核上。荧光定量PCR分析表明CsSPMS在根、茎、叶、芽、花和果中都有表达,在根、茎中表达量较高;低温胁迫处理下不同组织CsSPMS的表达量,在叶片中2 h达到峰值,而在根中12 h达到高峰;在低温条件下4个茶树品种的耐寒性与CsSPMS表达量密切相关。     

牡丹开花前后碳水化合物的分配与光合速率的关系

以牡丹( Paeonia suffruticosa ) 品种‘肉芙蓉’为材料, 研究其开花过程中碳水化合物的分配及其对有花枝上叶片( FL) 与无花枝上叶片(NFL) 净光合速率( Pn) 的影响。结果表明: 在花衰败前,有花枝Pn明显低于无花枝, 但可溶性糖含量却高于无花枝。与前一天17时相比, 经过一夜消耗后, 早晨8时有花枝可溶性糖含量没有显著差别, 而无花枝的则较低, 说明除光合作用外, 还有其他途径为有花枝提供可溶性糖。花衰败后, 两种枝叶Pn和可溶性糖含量的差异逐渐消失。与花衰败前不同, 经过一夜消耗后, 早晨8时两种枝叶的可溶性糖含量比前一天17时都降低, 表明为有花枝提供可溶性糖的其他途径在花衰败后停止工作, 推测这一途径极可能与花的生长发育有密切联系。     

Virus-induced PpCHLH gene silencing in peach leaves (Prunus persica)

Summary

Compared with other model plants or crops, studies on the molecular biology of fruit trees have lagged behind due to technical difficulties in gene transformation and manipulation. Therefore, developing an efficient system for gene manipulation is of particular significance in fruit trees. Here, we report on a method for virus-induced gene silencing (VIGS) by syringe-infiltrating a tobacco rattle virus (TRV) vector containing a specific target gene sequence into peach (Prunus persica) leaves to analyse gene function. The target gene (PpCHLH) was a 4,445 bp sequence encoding the H subunit of magnesium chelatase and was first cloned as a cDNA. This gene (PpCHLH) is reported to be related to chlorophyll biosynthesis, and any loss of function leads to a decrease in chlorophyll content, with concomitant yellow or white colour changes in the leaves. To silence the PpCHLH gene, a 1:1 mixture of Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 cultures containing pTRV1 or a pTRV2 vector construct with a 650 bp cDNA fragment of the PpCHLH gene was infiltrated into leaves of 4 – 5 week-old peach seedlings. After 15 d, the inoculated areas of the green leaves faded and finally turned yellow or white. Loss of PpCHLH gene function was confirmed by semi-quantitative RT-PCR, real-time qRT-PCR, and siRNA northern blot analysis. The virus-induced gene silencing (VIGS) technique developed here could be used for further molecular studies on fruit trees.     

AF试剂在桃树上的应用研究

不同浓度的ＡＦ试剂在桃树上的应用研究表明，以１００×１０￣（－６）（１００ｐｐｍ）效果最佳。果实生长期处理３次，能获得增产、优质的效果。此与ＡＦ试剂能提高叶绿素含量、光合速率、促进希尔反应，抑制过氧化氢酶活性，增加单果重等多重效应密切相关。