内蒙古赤峰地区番茄斑萎病毒的鉴定

利用番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)通用引物及自行设计合成引物对采集自内蒙古自治区赤峰市部分地区的番茄病毒病样品进行了RT-PCR检测及序列测定;进一步利用特异性引物对包含N基因在内核苷酸序列进行扩增、克隆和测序,并对包含N基因的914 nt序列进行系统进化分析。结果表明,在采集的16个表现TSWV症状和2个未表现典型症状的果实样品中均检测到TSWV;TSWV内蒙古番茄分离物与中国云南、江苏等地的分离物亲缘关系最近。用表现TSWV症状的番茄果实汁液摩擦接种辣椒叶片,出现叶片褪绿、植株矮小等症状,并经RT-PCR分析检测到TSWV。本研究证实在内蒙古地区有TSWV在番茄上发生危害。     

广东辣椒上首次检测到西瓜银斑驳病毒

2014 年在广东辣椒产区发现疑似番茄斑萎病毒属（Tospovirus）病毒侵染引起的辣椒褪绿坏死环斑症状。Dot-ELISA 检测显示,该病毒分离物与番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）单克隆抗体不产生血清学反应,表明该病毒不属于TSWV。利用Tospovirus 属病毒通用引物gL3637/gL4435C进行RT-PCR 检测,可以从所有辣椒病样总RNA 中扩增出预期大小约800 bp 的目的片段。基因克隆与序列分析表明,该片段序列与西瓜银斑驳病毒（Watermelon silver mottle virus,WSMoV）中国广州分离物的同源性最高,为97.5%。系统进化分析也显示,该病毒分离物与WSMoV 各分离物亲缘关系最近,并聚类在一个分支。因此,侵染广东辣椒的病毒分离物为WSMoV。     

广东地区冬瓜感染的小西葫芦黄花叶病毒检测及其外壳蛋白基因多样性分析

小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)是危害广东省冬瓜的常见病毒。摸索了冬瓜叶片总RNA最佳提取方法,通过基于ZYMV病毒外壳蛋白基因(coat protein gene,cp)序列的RT-PCR扩增,检测采集自广东省9个冬瓜产区的76份病毒侵染样品的病毒田间发病率;将扩增产物克隆测序,利用MegAlign软件构建系统发育进化树分析cp基因遗传变异与系统进化。结果表明,24份样品检测为阳性,田间发病率为31.59%;所有参试病毒分离物cp基因全长840 bp,编码279个氨基酸的多肽;测序的16个分离物cp基因的核苷酸序列与推导蛋白的氨基酸序列相似性分别为98.1%~100%与96.1%~100%;所有广东分离物的推导氨基酸序列基序保守,除GD121-9增加2个人类白细胞抗原外,其他均包含5个人类白细胞抗原及1个N糖基化位点,均包含保守potyv_CP功能域及与病毒蚜传相关的结构域DAG三联盒"Asp-Ala-Gly";系统进化分析表明,ZYMV病毒划分为7个基因型,广东分离物均属于同一基因型Ⅰ,包含3个株系;广东地区的16个分离物分为3组,无明显地域选择性。总体上广东ZYMV-cp比较保守,分子变异较小。明确了广东省冬瓜上ZYMV病毒的侵染情况及外壳蛋白基因的变异特点,为对其致病性和抗病毒基因工程等研究提供依据。     

芋花叶病毒的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

 采用RT-PCR技术对采自中国湖北、浙江和山东的91份芋[Colocasia esculenta（L.）Schott]样品的芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus,DsMV）进行了检测,检出率为26.4%。对其中14个DsMV分离物的317 bp扩增产物（为外壳蛋白基因的一部分）序列分析的结果显示,各分离物内的核苷酸变异相对较低,而分离物间存在较大的分子变异,相似性为68.3% ~ 97.8%。对来自湖北和浙江的2个DsMV分离物DsMV-SCS和DsMV-JH的外壳蛋白基因（coat protein gene,cp）进行了测序,全长分别为951 bp和987 bp,二者cp核苷酸和氨基酸序列相似性分别为79.0%和82.3%,与已报道DsMV的cp核苷酸和氨基酸序列相似性分别为73.0% ~ 92.1%和74.8% ~ 98.2%,在构建的系统发育树上聚在两个不同的簇,各DsMV分离物的系统进化关系与其寄主和地理来源无显著相关性。     

中国柑橘叶斑驳病毒和碎叶病毒发生状况及其分子特性研究

柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)和柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)均可侵染柑橘的不同种。为明确CLBV及CTLV在中国柑橘上的发生状况和分子特性,采用RT-PCR技术对来源于中国7个省的342份和346份柑橘样品进行检测,检出率分别为9.6%和11.0%。对14个CLBV分离物和15个CTLV分离物的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因部分序列分析显示,CLBV分离物间cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为82.1%~100%和88.1%~100%,CTLV分离物的cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为89.5%~100%和92.5%~100%。测定的14个CLBV分离物在系统进化树中聚为2个组;而CTLV分离物分组不明显,该病毒的系统进化与寄主来源无明显关系。     

重庆辣椒病毒病病原初步鉴定和分析

利用斑点免疫杂交法（Dot-ELISA）和RT-PCR法对重庆地区发生的辣椒病毒病的病原进行了鉴定和优势病毒分析。利用5种常见蔬菜病毒的血清对采自重庆8个区县的152份辣椒病毒病样品进行Dot-ELISA检测,结果表明,共有118份辣椒样品检测呈阳性,其中,黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）的侵染最普遍,总检出率高达57.89%;番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus,ToMV）的总检出率最低,为22.52%;烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus,TuMV）和蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2,BBWV-2）的总检出率分别为30.26%、36.18%和24.34%。在118份阳性样品中,有66.10%的样品受两种及以上病毒复合侵染,其中33.33%的样品受到CMV和TuMV复合侵染,有26.27%的样品受3种病毒复合侵染。设计5种病毒的特异性引物,随机选取16份阳性样品进行RT-PCR扩增,克隆测序结果表明扩增片段确实是5种病毒的相应序列,且RT-PCR与ELISA检测结果基本吻合。检测结果表明CMV是重庆地区辣椒上的优势病毒种类,且该地区辣椒上病毒复合侵染现象普遍。本文首次报道了ToMV和TuMV侵染辣椒。     

青海辣椒上番茄斑萎病毒检测及鉴定

在对青海辣椒上的病毒病进行调查时发现疑似番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt tospovirus,TSWV）病样,表现为环斑、坏死等症状。为明确其感染的病毒种类,对其进行了检测和鉴定。对Tospovirus的通用引物进行检测时发现采集的49份样品中有14份样品扩增到了目的条带,序列测定结果显示其与TSWV的同源性最高;同时利用TSWV特异性引物对阳性样品进行检测,结果全部为阳性;基于克隆的NSs基因序列聚类分析结果显示其属于TSWV的1个分离物,与中国云南、黑龙江等地分离物相对近缘,而与国外其他分离物相对远缘。在分子鉴定的基础上,利用TSWV的抗体通过Western blot进一步对样品进行了检测,结果也证明采集样品中存在TSWV的感染。这些结果表明青海辣椒上存在TSWV的感染。     

蚕豆萎蔫病毒2号青海辣椒分离物的鉴定与全基因组序列克隆

对青海省循化县的辣椒病毒病进行调查,采集到部分叶片表现萎蔫和皱缩症状的样品,该症状与蚕豆萎蔫病毒2(BBWV2)引起的症状相似。为准确鉴定是否为与该病害相关的病毒,将采集的20个辣椒样品用特异性引物进行RT-PCR检测,其中13个样品检测结果为阳性。在20份循化县辣椒样品中,有13份样品被确认感染了蚕豆萎蔫病毒2(BBWV2)。基于核苷酸序列的系统发育分析表明,检测到的病毒与BBWV2聚类在一起,与其他地区或国家分离物的序列一致性较高,与蚕豆萎蔫病毒1(BBWV1)和野芝麻轻型花叶病毒(LMMV)分离物的序列一致性相对较低。结果表明该辣椒样品感染的病毒是BBWV2。     

葡萄病毒B外壳蛋白原核表达及抗血清制备

根据已报道的葡萄病毒B(Grapevine virus B,GVB)核苷酸序列设计引物,采用RT-PCR方法从葡萄中扩增获得GVB外壳蛋白基因(cp),大小为594 bp。通过序列测定和分析,选取优势分离物GVB-JFL cp基因克隆到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化融合蛋白pET-GVB CP。SDS-PAGE电泳结果显示,融合蛋白获得过量表达,分子量约26 kD。以纯化蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗血清。采用间接ELISA和dot-ELISA对抗血清特异性进行检测,结果表明,抗血清可与感染GVB的西方烟和葡萄样品发生阳性反应,与健康植株及感染同属另一种病毒葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)的样品不反应,阳性样品检测效价达1︰4 000,16个田间样品摩擦接种至烟草后有9个样品ELISA检测为阳性,表明制备的抗血清可用于GVB的特异性检测。     

新疆、甘肃和河南部分地区甜瓜瓜类蚜传黄化病毒分子变异初步分析

从新疆鄯善县、甘肃瓜州县和河南通许县采集表现瓜类蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)症状的甜瓜叶片样品63份,利用反转录PCR(RT-PCR)检测,从阳性样品中选取25个分离物扩增出1.4 kb的片段,并对其序列进行分析。结果表明:63份样品中,36份为CABYV阳性;获得的序列包括部分3′端的依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)基因、非编码区(NCR)和全长外壳蛋白(CP)基因。随机选取25个分离物的CP基因与GenBank中的序列进行比对,其序列相似性为93.2%~100%。通许分离物间序列相似性为98.8%~99.8%,瓜州分离物间序列相似性为98.2%~100%,鄯善分离物间序列相似性为99.2%~100%,组内表现出极高的同源性。基于其部分RdRp基因、NCR及CP基因序列构建的系统进化树表明:25个CABYV分离物与中国及周边地区(泰国、韩国等)的分离物聚为一簇,而与欧洲地区分离物距离较远,说明了该病毒分子变异与分离物的地理分布有关。     

福建西番莲上首次检出东亚西番莲病毒

为明确东亚西番莲病毒（East Asian passiflora virus,EAPV）在福建西番莲上的发生情况,采用血清学和RT-PCR检测技术对采集的西番莲病样进行检测,并对阳性样品PCR产物进一步克隆、测序和序列分析。结果表明,11份样品的马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒血清学检测结果为阳性,大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）血清学检测结果均为阴性;应用Potyvirus属通用引物从11份样品中扩增得到预期大小约660 bp的目的片段,序列比对发现,其中10份阳性样品与已报道的夜来香花叶病毒（Telosma mosaic virus,TeMV）核苷酸序列高度一致,1份样品与已报道的EAPV核苷酸序列一致性超过98.3%。针对EAPV疑似样品（命名为FJBXG-P1）,利用特异性引物扩增得到预期大小约955 bp的目的片段,获得的外壳蛋白（Coat protein,CP）基因序列全长870 bp（GenBank登录号：MG650164）。序列比对发现,EAPV分离物FJBXG-P1的CP基因序列与已报道的EAPV核苷酸序列、氨基酸序列一致性分别为81.0% ~ 97.6%和84.0% ~ 96.9%;系统发育分析结果表明,38个EAPV分离物在系统发育关系上聚为两簇（GroupⅠ和GroupⅡ）,其中GroupⅠ为AO株系,GroupⅡ为IB株系,FJBXG-P1分离物属于AO株系。福建西番莲上EPAV的检出,是该病毒在中国大陆地区发生的首次报道。     

柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的二重RT-PCR检测体系的建立与应用

选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。     

辣椒CMV广州分离物的鉴定及辣椒材料抗病性筛选

应用RT-PCR方法从黄瓜花叶病毒广州分离物CMV-GZ中扩增出外壳蛋白基因,并进行测序分析,证明该分离物归属于黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ。对45份辣（甜）椒材料进行室内苗期人工接种抗CMV鉴定,结果表明,4份辣椒材料对CMV表现为抗病,21份辣椒材料表现为中抗。结合农艺性状调查结果,筛选出5份抗CMV且农艺性状优良的辣椒材料。     

陕西杨凌地区番茄斑萎病毒外壳蛋白基因的克隆与分析

番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)是世界上危害最大的十大病毒之一,为了确定陕西杨凌地区的番茄感染TSWV情况,采集该地区4份疑似感染TSWV的番茄样品,通过表型观察以及PCR分子鉴定进行分析。结果显示,2份材料扩增出234bp的特异性条带,表明样品感染了TSWV。采用同源克隆方法获得了杨凌地区757bpTSWV的外壳蛋白基因(CP),其与西班牙TSWV分离物同源性最高,为99%,而与昆明的TSWV分离物亲缘关系较远。     

应用实时荧光RT-PCR检测柑橘黄化脉明病毒

为更快速准确检测柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）,根据病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异性引物,通过体系优化得到最佳反应条件,建立基于SYBR GreenⅠ的CYVCV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法可特异性检测CYVCV,而测试的柑橘衰退病毒、碎叶病毒等5种柑橘病毒均不能检测出。灵敏度较普通RT-PCR提高了100倍,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率和相关性系数分别为102%和0.999。对田间样品的检测结果表明,建立的实时荧光RT-PCR适用于检测不同柑橘品种中CYVCV的含量。