猪CD80 mRNA定量检测方法的建立

用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞中扩增和克隆了猪CD80基因部分片段,经测序鉴定后,用反向PCR技术构建了CD80的缺失竞争cDNA分子。通过竞争PCR方法,建立了CD80标准竞争曲线,并得到其直线回归方程。本方法操作简单,特异性和敏感性高,可用于猪CD80 mRNA水平的定量检测,从而为分析猪的免疫状态提供了一种重要技术手段。     

用竞争PCR方法定量检测猪MHC-DM mRNA

根据GenBank中猪MHC-DM基因序列,用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞中扩增和克隆了猪DM基因部分片段,经测序鉴定后,用反向PCR技术构建了其缺失竞争cDNA分子。通过竞争PCR方法,建立了猪DM标准竞争曲线,并得到其直线回归方程。本方法操作简便,特异性和敏感性高,可用于猪DM mRNA水平的定量检测。     

猪圆环病毒2型减少猪肺泡巨噬细胞中伪狂犬病疫苗载量和CD80-CD86基因转录

[目的]探明猪圆环病毒2型(PCV2)干扰伪狂犬病疫苗(PRV)免疫效果的可能机制.[方法]用PCV2与PRV在体外分别单接种和共接种仔猪肺泡巨噬细胞(AM),在接种后不同时间用荧光定量PCR技术检测PRV载量与共刺激分子CD80-CD86 mRNA水平的动态变化.[结果]PRV组上清中PRV载量在接种后都显著(P＜0.05)高于PCV2+ PRV组.与对照组相比,在接种后48 h内,PRV组CD80 mRNA水平在接种后增加并在48 h时达到显著水平,而PCV2组与PCV2+ PRV组的CD80 mRNA水平都显著减少;在接种后48 h内,CD86 mRNA水平在PRV组都显著增加,在PCV2+ PRV组则都显著减少,但在PCV2组仅在接种后48 h显著减少.[结论]PCV2能够减少猪AM中PRV载量与CD80-CD86基因转录,这可能是PCV2抑制PRV免疫效果的机制之一.     

猪IL-18 mRNA定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪白介素(IL)-18基因序列,设计1对引物,用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞总RNA中扩增出其411 bp cDNA片段,将其与pGEM-T Easy载体连接,经转化、筛选阳性克隆、酶切与测序鉴定后,构建出含猪IL-18 cDNA部分片段的重组质粒。后用反向PCR技术构建出与扩增411 bp片段共用同1对引物,但缺失174 bp的竞争重组质粒。通过上述2种质粒的竞争PCR方法,建立了猪IL-18 mRNA的标准竞争曲线,得到其直线回归方程^y=0.583 2x-2.903 4(R2=0.9898)。     

猪TNF-α竞争定量RT-PCR标准曲线的建立

根据GenBank中猪TNF-α的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增402 bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-T载体中,构建成含TNF-α部分基因片段的重组质粒.利用反向PCR技术构建与扩增402 bp片断共用同一对引物,但缺失137 bp的竞争重组子.通过重组质粒与竞争重组子竞争定量PCR方法(qc-PCR),建立猪TNF-α的标准竞争曲线和直线回归方程.     

猪IL-12p40竞争定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪IL-12p40的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增377 bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含IL-12p40部分基因片段的重组质粒. 利用反向PCR技术构建与扩增377 bp片段共用同一对引物但扩增255 bp片段的竞争重组子. 通过重组质粒与竞争重组子竞争定量PCR方法(qc-PCR),建立了猪IL-12p40的标准竞争曲线和直线回归方程.     

猪CD163的分子克隆、原核表达及免疫血清制备

采用生物信息学软件分析猪CD163结构,用RT-PCR从猪巨噬细胞RNA中扩增猪CD163前1 511 bp cDNA片段,再用PCR扩增抗原指数较高的697 bp cDNA片段,将其克隆人质粒载体进行序列测定;将cDNA片段克隆入含细胞毒性T细胞相关抗原4 (CTLA-4)胞外区(IgV)编码序列的原核表达载体,用I...     

猪转移因子增强猪细小病毒灭活疫苗猪体细胞免疫活性的研究

为探讨猪转移因子增强猪细小病毒灭活疫苗对猪体免疫效果,从健康猪的新鲜脾脏中提取转移因子,分别与自制猪细小病毒灭活油苗和猪细小病毒商品灭活苗联合免疫仔猪,并设猪转移因子和生理盐水对照组。免疫后分别用间接ELISA方法和流式细胞技术检测仔猪抗体水平变化和仔猪外周血T淋巴细胞亚群动态变化。结果显示,免疫后猪转移因子联合灭活疫苗组能有效提高抗体水平,且免疫后猪转移因子联合PPV灭活疫苗组的CD3~+、CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+T淋巴细胞比值均高于相应的PPV灭活疫苗组。表明猪转移因子主要增强PPV油乳剂灭活疫苗的细胞免疫应答。     

猪IL-18增强猪细小病毒灭活疫苗猪体细胞免疫效果的研究

为了研究猪白细胞介素18是否增强猪细小病毒(PPV)灭活疫苗在猪体免疫效果,分别将猪白细胞介素18与自制猪细小病毒灭活疫苗和猪细小病毒灭活疫苗联合免疫仔猪,并设猪白介素18和生理盐水对照组。免疫后分别用间接ELISA方法和流式细胞技术检测仔猪抗体水平变化和仔猪外周血T淋巴细胞亚群动态变化。结果显示,免疫后猪白细胞介素18联合灭活疫苗组抗体水平与无猪白介素18灭活疫苗组相似,但免疫后猪白介素18联合PPV灭活疫苗组的CD3~+、CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+T淋巴细胞所占比值均高于相应的PPV灭活疫苗组,但差异不显著,且CD4~+/CD8~+在正常范围内。研究证实猪白介素18主要增强PPV油乳剂灭活疫苗的细胞免疫应答。     

猪细小病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV的VP2和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了2种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV的313 bp和PCV2的447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明二者的总符合率为100%。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这2种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用山西省农科院畜牧兽医研究所动物基础医学研究课题组研究的多重PCR检测方法,检出猪圆环病毒2型阳性56份,阳性率为27%;猪细小病毒病阳性42份,阳性率为20%;二者混合感染17份,阳性率为8%。这为掌握山西这2种病毒的感染情况提供了依据。     

左旋咪唑刺激猪内皮细胞抑制单核源树突状细胞的抗原递呈功能

【目的】研究左旋咪唑(LMS)刺激的猪内皮细胞(VEC)对单核源树突状细胞(MoDC)的抗原递呈功能的影响。【方法】通过LMS刺激猪血管内皮细胞后,筛选出能够使内皮源IL-8表达量上调的低质量浓度LMS(10~(-6) mg/mL),将经LMS处理的内皮细胞与MoDC共培养,收集共培养的MoDC。流式细胞术检测MoDC的CD80/86和MHC-II的表达;丝裂霉素C处理后的MoDC与淋巴细胞混合,MTS法和流式细胞术分析MoDC抗原递呈和对淋巴细胞转化的影响。共培养分为诱导后共培养和诱导共培养。【结果】LMS处理VEC后,两种共培养方式所得MoDC的MHC-II与CD80/86阳性率、淋巴细胞刺激指数、Tc和Treg细胞阳性率均显著下调,而Th细胞阳性率和CD4~+/CD8~+比值显著上调。【结论】低浓度LMS处理的VEC可抑制MoDC的抗原递呈能力。     

Characterization and Differentiation into Adipocytes and Myocytes of Porcine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） could differentiate into various cell types including adipocytes and myocytes, which had important scientific significance not only in the field of tissue regeneration, but also in the field of agricultural science. In an attempt to exhibit the characterization and differentiation into adipocytes and myocytes of porcine BMSCs, we isolated and purified porcine BMSCs by red blood cell lysis method and percoll gradient centrifugation. The purified cells presented a stretched fibroblast-like phenotype when adhered to the culture plate. The results of flow cytometry analysis and immunofluorescence staining demonstrated that the isolated cells were positive for mesenchymal surface markers CD29, CD44 and negative for hematopoietic markers CD45 and the adhesion molecules CD31. Cells were induced to differentiate into adipocytes with adipogenic medium containing insulin, dexamethasone, oleate and octanoate. Oil Red O staining demonstrated that the porcine BMSCs successfully differentiated to adipocytes. Moreover, the findings of real-time PCR and Western blotting indicated that the induced cells expressed adipogenic marker genes （PPAR-y, C/EBP-c~, perilipin, aP2） mRNA or proteins （PPAR-3,, perilipin, aP2）. On the other hand, porcine BMSCs were induced into myoctyes with myogenic medium supplemented with 5-azacytidine, basic fibroblast growth factor, chick embryo extract and horse serum. Morphological observation by hochest 33342 staining showed that the induced cells presented as multi-nucleus muscular tube structure. And myogenic marker genes （Myf5, desmin） mRNA or proteins （MyfS, MyoD, myogenin, desmin） were found in the induced cells. In addition, the results of immunofluorescence staining revealed that myogenic marker （Myf5, MyoD, myogenin, desmin, S-MyHC） proteins was positive in the induced cells. Above all, these results suggested that the isolated porcine BMSCs were not only consistent with the characterization of mesenchymal stem cells, but also exhibited the multipotential capacity to form adipocytes and myocytes, which provided the basis to investigate the regulation mechanism involved in the selective differentiation of porcine BMSCs.     

不同品种猪生长激素基因的PCR-RFLPs分析

采用PCR-RFLPs技术,对香猪、上海白猪、大约克夏猪生长激素基因-119～＋715区域共834bp片段的扩增产物分别用ApaI、DraI、MspI三种限制性内切酶检测酶切位点的多态性。结果显示：ApaI酶切时．三个品种的猪都产生了3种基因型（AA、BB和AB）,BB基因型的频率以大约克夏猪最高．AB基因型的频率以香猪最高．三个猪种间基因型频率、等位基因频率的差异不显著（P〉0．05）;DraI酶切时．各品种猪均未呈现酶切位点的多态性;MspI酶切时,仅大约克夏猪表现出2种基因型（CC、CD）,香猪、上海白猪未产生酶切位点多态性。结论：AB基因型的频率以香猪为最高,它可能是小型猪的有利基因型;在香猪和上海白猪中DraI和Mspl酶切位点的多态性比较贫乏。     

猪CD8α分子胞外区基因片段的原核表达

采用PCR技术从pGEM-pCD8α重组质粒中克隆了pCD8α胞外区去信号肽基因片段,并构建原核表达载体pET-30a-pCD8α-ED,在不同IPTG浓度和时间下进行诱导表达.结果表明:SDS-PAGE表达出约25ku的融合蛋白,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,IPTG最佳诱导浓度为0.5mmoL·L-1,诱导6h时表达量达到峰值;Western-blot结果显示,在25ku左右出现杂交条带,表明表达的融合蛋白能被抗HIS标签的单克隆抗体识别,说明目的蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达.     

2010—2013年浙江省猪流行性腹泻病毒临床检测及PEDV S基因型分析

2010年以来,全国大部分地区暴发新生仔猪严重流行性腹泻,给养猪业造成巨大经济损失。为分析猪流行性腹泻病毒(PEDV)在浙江省的流行和遗传变异情况,对2010—2013年收集的临床腹泻样品,以针对PEDV S基因N端序列的RT PCR检测病原,并测序其中的41份样品的扩增序列,分析PEDV S1基因型变异情况。临床检测结果表明：　PEDV临床检出率由2010年的4286%提高到2013年的70%以上,并且浙江省各地的检出率都在50%以上;一年中7至8月份检出率明显降低。 PEDV S1基因N端序列分析结果表明,临床检测株的S1基因与传统毒株PEDV CV777的S基因序列及中国最早检测到的基因序列亲缘关系较远,可能浙江省PEDV的流行株可能属于一个新的基因型。同时研究结果提示PEDV S基因的变异可能是现有CV777毒株疫苗免疫保护力不佳的原因。     

健脾益肠散对溃疡性结肠炎大鼠CD86和ICAM-1表达的影响

目的 观察健脾益肠散对溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）大鼠CD86分子（CD86）和细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）表达的影响,探讨其对UC肠黏膜的免疫保护机制。方法 将60只SD大鼠先随机分为空白组和造模组,造模组采用2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS）溶液灌肠法制备UC大鼠模型,待模型复制成功后再将造模组随机分为模型组、西药组和中药高、中、低剂量组;干预21 d后,免疫组化法检测各组大鼠结肠组织中CD86的阳性表达,Western Blot、RT-PCR法分别检测结肠中ICAM-1的蛋白和mRNA表达。结果 与空白组比较,模型组大鼠结肠组织中CD86的阳性表达以及ICAM-1的蛋白和mRNA表达均显著增高（P<0.01）;与模型组比较,中药高、中、低剂量组和西药组CD86、ICAM-1的表达均不同程度地降低（P<0.05或P<0.01）,且以中药高剂量组最为明显（P<0.05或P<0.01）。结论 健脾益肠散可能通过降低结肠组织中CD86、ICAM-1的表达水平起到对UC结肠黏膜的免疫保护作用。