巢式PCR快速检测西瓜细菌性果斑病菌

【目的】建立nested-PCR方法,快速检测西瓜种子中的燕麦嗜酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. citrulli,Aac）,为西瓜细菌性果斑病（bacterial fruit blotch of watermelon,WFB）的防控提供技术支持。【方法】 根据Aac BOX短重复序列的PCR产物设计两对引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2,建立以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR,以5 µL样品处理液于99℃高温裂解10 min,再放置冰上冷却5 min,以所释放病原DNA为模板进行PCR扩增,采用50 μL反应体系：5 μL 10×PCR buffer（25 mmol?L-1 MgCl2）,4 μL dNTP （D4030RA,2.5 mmol?L-1）,引物（5 μmol?L-1）各3 μL,0.4 μL Taq DNA酶（DR001B,5 U?μL-1）,通过退火温度优化,反应条件为：引物BX-L1/BX-R5各3 μL进行第一轮扩增,95℃,2 min;95℃,30 s;65℃,45s;72℃,1 min;35个循环;72℃,延伸7 min;取扩增后的产物1 μL为模板,以引物BX-L1/BX-S-R2各3 μL进行第二轮扩增,95℃,2 min;95℃,30 s,66℃,45 s,72℃,1 min,30个循环,72℃,7 min。在此条件下对梯度Aac菌悬液、模拟带菌种子提取液进行特异性、灵敏性及重复性检验,对不同带菌率的西瓜种子提取液进行检测。【结果】引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2在检测不同来源的Aac菌株时都产生了预期大小的片段,并且对其近源种燕麦嗜酸菌卡特莱兰亚种（A. avenae subsp. cattleyae）、魔芋假单胞菌（A. avenae subsp. konjaci）及其不相关菌株未扩增出目标片段。以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR,对Aac纯菌液和模拟带菌种子提取液的最低检测限4.7×101 cfu/mL,比direct-PCR灵敏度高出1 000倍。当西瓜种子带菌率在0.1%-0.5%时,nested-PCR阳性检测率为66.7%;当种子带菌率为1%-10%时,nested-PCR的阳性检测率为83%-100%。【结论】以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR方法,能够快速、高效检测携带微量Aac的西瓜种子,检测结果重现性高。     

香蕉细菌性枯萎病菌实时荧光PCR检测方法的建立

根据香蕉细菌性枯萎病菌与其它细菌菌株16SrDNA序列差异，设计并合成一对引物和一条具有稳定点突变特异性探针，建立了对香蕉细菌性枯萎病菌的实时荧光PCR检测方法。除烟草青枯病菌和马铃薯青枯病菌外，还对其它属细菌菌株进行了荧光PCR检测。结果表明，只有香蕉细菌性枯萎病菌产生荧光，其它细菌都没有荧光产生。从而证明此方法特异性强，灵敏度高，适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。     

西瓜细菌性果斑病菌现场快速双模荧光RPA检测方法的建立

瓜类细菌性果斑病菌(bacrerial fruit of blotch,BFB)是中国检疫性病害,其传播非常迅猛,且目前没有商品化抗病品种。为建立西瓜果斑病菌现场快速荧光重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)检测方法,针对细菌性果斑病菌特异性序列设计并筛选出了RPA最佳的引物和探针组合,利用两种模式[实时荧光监测RPA(real time RPA,RT-RPA)和终端荧光可视化检测RPA(end point RPA,EP-RPA)]对RPA的结果进行分析,并与实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果进行对比。结果显示,建立的细菌性果斑病菌双模荧光RPA检测方法特异性强,且其对病原物的检测灵敏度与qRT-PCR的灵敏度相当。在实际样品检测中,RT-RPA、EP-RPA和RT-PCR的检测结果一致性为100%。在检测时间上,EP-RPA的检测时间为20 min,RT-RPA平均检测时间约为5 min,qRT-PCR的平均检测时间约为44 min;RPA的检测速度最快,而且不依赖大型的仪器,方便快捷,适用于现场检测。该恒温快速检测方法的建立为植物病害的现场检测提供了新的技术支持。     

甜瓜种子细菌性果斑病菌PCR检测方法的研究

以携带细菌性果斑病菌(Acidovoras avenae subsp. citrulli)的甜瓜种子为材料,比较了不同引物、不同种子处理方式、不同浸提液及不同提取时间对细菌性果斑病菌PCR及实时荧光定量PCR检测结果的影响。结果表明:以完整带菌种子浸提液为模板进行PCR扩增,操作最简单且特异条带亮度最高,种壳+种仁处理次之,而以磨碎种子浸提液为模板,未能扩增出特异条带。以无菌水作为浸提液的PCR扩增效果明显优于磷酸缓冲液和液体KB培养基,浸提时间以3—12 h为宜。实时荧光定量PCR检测结果与普通PCR一致。在3对特异引物中,引物BX-L_1/BX-S-R_2的普通PCR扩增效果最佳,引物SEQID4~m/SEQID5更适用于实时荧光定量PCR检测。     

利用PCR技术专化性检测瓜类细菌性果斑病菌

将hrpB2基因作为检测靶标,根据hrpB2基因设计了1对特异性引物HB2F2/HB2R2,用此特异引物从瓜类细菌性果斑病菌菌株中扩增出290 bp的特异性片段,而其余参试菌株和甜瓜组织的PCR反应结果为阴性,灵敏度试验证明可以检测到103CFU/ml靶标菌体。对市售的17个品种的甜瓜种子进行PCR检测,其中4个品种检测出携带有瓜类细菌性果斑病菌。将hrp基因作为靶标,为快速检测瓜类细菌性果斑病菌提供了新的方法。     

西瓜细菌性果斑病菌在不同场所存活期的检测

选择西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac)的抗利福平菌株RifAac,通过人工模拟接种试验,采用选择性平板分离、菌落PCR(Bio-PCR)和常规PCR方法,观察该病原细菌在西瓜种子、土壤、病残体和田水中的存活期。结果表明,果斑病细菌在种子表面可存活4～5个月,在田水中可存活2个月,在不含植物残体的土壤中可存活8个月,在含西瓜残体的土壤中可以存活12个月以上。     

西瓜细菌性果斑病菌的室内药剂筛选试验

采用含毒介质法进行6种杀菌剂对西瓜细菌性果斑病的室内毒力测定，结果表明：链霉素、可杀得抑菌效果较好，抑菌最低有效浓度分别为15μg/mL和150μg/mL；其次是细菌灵、细菌杀，抑菌有效浓度均为300μg/mL，而叶青双、百菌清效果较差，抑菌最低有效浓度高达600μg/mL。     

猪瘟病毒实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速检测猪瘟病毒的基因检测方法,根据GenBank中猪瘟病毒(CSFV)基因组NS2基因序列设计并合成引物和Taq Man探针,通过各项条件优化并以10倍稀释度的质粒为标准品进行实时定量PCR扩增制作标准曲线,建立检测CSFV的实时定量PCR方法。该方法的检测灵敏度可达每微升10个拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高出1个数量级;对标准品质粒检测的线性范围是1.0×109～1.0×101μL-1。对1.0×107、1.0×105、1.0×103μL-13种稀释度的标准品质粒进行重复试验,批内变异系数分别是0.30%、0.85%、0.43%,批间变异系数分别是0.81%、1.36%、0.63%,具有良好的重复性。应用该方法对45份临床样品进行检测,检出26份阳性样品,而常规PCR只检测出19份阳性样品,说明该实时定量PCR方法的敏感性高于常规PCR。可见,该方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,可用于检测病料中的猪瘟病毒。     

山东省西瓜细菌性果斑病的病原菌鉴定

近年来,在山东省临沭县、昌乐县、章丘县等地西瓜育苗基地的西瓜苗上发现了一种新病害——西瓜细菌性果斑病。从病果和病叶片上分离到15个细菌菌株,选取8个菌株进行致病性测定,结果表明,该8个菌株均能侵染西瓜,发病症状和自然发病症状完全一致;从接种发病的病果上可重新分离到相同的细菌。对该8个菌株菌体形态、染色反应、培养性状及其生理生化特性等项目进行观察测定,确认供试菌株为燕麦食酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli Willems et al.,1992)。     

菜豆细菌性萎蔫病菌16S rDNA基因克隆及TaqMan探针实时荧光PCR检测

将菜豆细菌性萎蔫病菌(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)16S rDNA基因进行克隆测序,并依据此序列设计菜豆细菌性萎蔫病菌的实时荧光PCR引物和特异性探针,对所收集的样品进行了检测. 结果表明,该检测方法具有快速、特异、灵敏、重复性好等优点,只有菜豆细菌性萎蔫病菌产生荧光,其他细菌没有荧光产生. 检测的灵敏度为105 CFU/mL的细菌悬浮液,相对灵敏度为106 CFU/mL.     

哈密瓜细菌性果斑病种子带菌的PCR检测

利用特异性引物PCR技术,用水或PBST浸提哈密瓜带菌种子中的病原物,浸提液直接作模板就可以扩增出特异性的条带,检测出瓜类果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)的种子带菌情况,种子的浸提时间对检测结果的影响不大,同时查明种皮是种子带菌的主要部位;病瓜种子只有在2粒以上才能检测.采用PCR技术对市售的11个哈密瓜品种的种子带菌情况进行检测,结果检测出8个品种携带瓜类果斑病菌,进一步说明这一方法的可行性和实用性.     

新疆籽瓜细菌性果斑病的发生与分子鉴定

[目的]明确新疆部分地区籽瓜细菌性果斑病发生情况,分析不同分离物16S ～ 23S rRNA的ITS区序列,确定不同分离物该基因区遗传变异情况.[方法]采集并分离来自阜康、额敏、沙湾等地的籽瓜以及五家渠甜瓜的病原细菌,应用细菌ITS区通用引物对各分离物16S～23S rRNA的ITS区序列进行扩增测序,并在GENEBANK数据库中作序列比对确定所分离病原种类,同时分析该ITS区序列差异.[结果]从四个地区籽瓜或甜瓜病组织上分离获得分离物均为噬酸菌属燕麦种西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.Citrulli),研究获得的7个果斑病菌分离物与国内外已报道7个分离物间ITS区序列同源性达99.5;～100;,该区遗传序列间并无显著差异.[结论]新疆阜康、额敏、沙湾等地籽瓜均有细菌性果斑病发生,参与比对的细菌性果斑菌分离物16S～23S rRNA的ITS区基因序列高度保守,该基因区遗传变异较小.     

玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆及TaqMan 探针实时荧光PCR

为给农业和植物检疫部门提供一种特异性强、灵敏度高，可以快速、直接检测植物病原菌的方法，将玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆测序，根据该细菌与其他细菌菌株16S rDNA序列差异，设计出对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定点突变的特异性探针，除泛菌属3个种和欧氏菌属3个种外，还对假单胞菌属1个种，黄单胞菌属1个种，棒形杆菌属1个种，短小杆菌属1个种以及5种植原体进行了实时荧光PCR检测．结果表明：只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光，其他细菌和植原体都没有荧光产生．检测的灵敏度为10^4CFU／mL的菌悬浮液，相当于4个细菌细胞的基因，灵敏度高，也就是说，反应体系中只要有2个活细菌，实时荧光PCR就能检测到．相对灵敏度为10^7CFU／mL，而且整个检测过程只需2h，由于实验采用独特全封闭反应管及光电传导系统，不用凝胶电泳，降低了污染．     

副猪嗜血杆菌实时荧光PCR快速检测方法的建立和应用

[目的]建立一种快速准确定量检测副猪嗜血杆菌（HPS）的检测方法。[方法]根据GenBank公布的副猪嗜血杆菌16 S rRNA基因序列,选择其保守区域设计1对特异性引物。通过优化引物浓度和退火温度,建立快速定量检测副猪嗜血杆菌的实时荧光PCR方法,并评价了其特异性和稳定性。[结果]建立的实时荧光PCR方法最低检测限是50拷贝/μl,重复性好,变异系数均小于2%。该方法特异性强,只能检测副猪嗜血杆菌,不能检测到猪链球菌2型、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5α和猪伤寒沙门氏菌。采用该方法对10份临床疑似HPS感染样本进行检测,其结果与细菌分离培养和常规PCR的结果一致。[结论]建立的实时荧光PCR方法快速、灵敏、特异、重复性高,可用于HPS感染的临床快速检测。     

一株具有抗菌活性红树林土壤放线菌的分离和鉴定

分离和鉴定具有抗菌活性的红树林土壤放线菌。基于形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析,研究通过稀释分离法从广西北海红树林的高盐泥样中分离到1株细菌。系统进化分析表明,分离菌株与链霉菌属Aurantiogriseus AY999773具有99%的同源性,因此,BH0951初步被鉴定为链霉菌属Aurantiogriseus AY999773的变种。说明放线菌BH0951具有抗菌活性,本研究能为本菌株乃至广西北海红树林的微生物资源的开发和利用提供初步数据。     

具有抗菌活性红树林土壤放线菌BH0951的分离和鉴定

以广西北海红树林高盐泥样为材料,采用高氏1号培养基对其中的菌株进行分离纯化,通过抗菌试验筛选出1株放线菌BH0951,该菌株的发酵产物具有较强的抗菌活性,其最适生长温度为28℃,最适生长pH值为7.0。提取其总DNA,采用通用引物对其16S rDNA进行PCR扩增,并对扩增产物进行序列测定。结果表明,BH0951为链霉菌属（Streptomyces aurantiogriseus）AY999773的变种。     

微囊藻毒素降解菌EMB分离鉴定及其降解特性

以藻毒素提取液作为唯一碳源和氮源,从太湖蓝藻堆积点底泥中分离筛选高效微囊藻毒素降解菌。结果表明:经过驯化筛选得到1株高效降解菌EMB。在培养温度30℃、pH值为7时其降解毒素效率最高,培养21h内可将初始浓度为2.99 mg/L和2.15 mg/L的MC-RR和MC-LR完全降解,此外菌株EMB可以将太湖水华样品中的MC-RR和MC-LR在2周内降解到安全饮用水标准范围内。形态、生理特性和16 S rDNA序列分析表明,菌株EMB属于芽孢杆菌属(Bacillus.sp.),与已报道的B.subtilisB-FS06在进化树上距离最近。     

脂肪酶菌种的筛选及分子鉴定

通过固体平板法,从温泉水样中筛选出1株耐热脂肪酶产生菌X-33。对该菌株进行了产酶条件的初步探索,得出其摇瓶发酵条件为：2%可溶性淀粉,3%酵母膏,MgSO4·7ddH2O 0.1%,K2HPO40.1%,三丁酸甘油酯乳化液0.1%,起始pH值7.5,通气量50 mL/250 mL摇瓶,250 r/min,发酵温度37℃,发酵周期24 h。该酶在60℃条件下温浴30 min,可保留部分活性。为鉴定该菌株,克隆并测序了其16S rDNA基因序列,NCBI上比对分析表明,该菌株与sphingomonas yabuuchiae（鞘氨醇单胞菌）有最紧密的亲缘关系。     

一种快速高效提取革兰氏阳性菌微杆菌基因组DNA的新方法

[目的]探索可以快速从革兰氏阳性菌微杆菌中提取高质量基因组总DNA的新方法。[方法]采用3种不同方法提取微杆菌基因组DNA,并进行DNA纯度、完整度鉴定及16SrDNA扩增检测。[结果]紫外吸收结果表明,采用改良方法所获DNAA260/A280大于1.80,A260/A230为2.0,5ml过夜菌液可得6.5μg基因组总DNA。DNA凝胶电泳结果表明,DNA完整度高且无RNA污染。以此方法提取的基因组总DNA样品为模板,可灵敏有效地扩增16SrDNA基因。[结论]该方法用时短,操作简易,纯度好、产率高、成本低,适用于革兰氏阳性菌各相关的分子生物学研究。     

腐烂柑橘中两株细菌的分离与鉴定

以腐烂的柑橘为材料,分离纯化得到两株致病的细菌。根据菌株的形态特征并结合16SrDNA序列比对分析,确定两株细菌分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)和短芽孢杆菌属(Brevibacillus)。与此同时对两株细菌的生长曲线、抗生素抗性进行测定,以期为柑橘由细菌导致的病害的防治提供理论基础。