PEDV、TGEV和PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）及猪轮状病毒（PRoV）的快速鉴别检测方法,本试验针对PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计3对特异性引物PEDV-N、TGEV-M和PRoV-VP6,分别扩增PEDV N基因、TGEV M基因和PRoV VP6基因。经优化反应条件,成功建立了能同时检测并区分PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法可特异扩增PEDV、TGEV、PRoV相应的基因片段,而与猪瘟病毒（CSFV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）均无交叉反应;对PEDV、TGEV、PRoV基因重组质粒标准品的检出限分别为1.41×10³、1.41×10²和1.41×10³拷贝/μL;在相同条件下重复试验可获得一致的结果。应用该方法对临床采集的190份腹泻病料进行检测,结果PEDV阳性42份,阳性率22.11%;TGEV阳性58份,阳性率30.53%;PRoV阳性34份,阳性率17.89%,且存在不同病毒混合感染的现象。结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的优点,可用于PEDV、TGEV和PRoV的临床检测和流行病学调查。     

PEDV、TGEV、PoRV和PKV多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为快速鉴别诊断猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪嵴病毒(PKV),根据PEDV的M基因、TGEV的N基因、PoRV的VP6基因和PKV的3D基因序列设计4对特异性引物,通过PCR扩增目的片段并构建重组质粒,建立了一种可同时检测4种病毒的RT-PCR诊断方法,该方法可特异性扩增这4种病毒的相应片段,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)均无扩增,最低检出量分别为1.33×10^4、1.33×10^3、1.33×10^4、1.33×10^5copies/μL。应用该方法对临床55份猪腹泻样品进行检测,结果检测出14份PEDV、1份PoRV和27份PKV,未检出TGEV,其中PEDV和PKV混合感染9份。上述结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法快速、特异、敏感,可用于以上4种腹泻病毒的临床检测和流行病学调查。     

PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)的方法,本研究分别针对PEDVN基因、TGEVM基因、PDCoVM基因和PRoVVP6基因设计特异性引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,建立了同时检测4种病毒的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的质粒标准品的最低检出限分别为2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^1拷贝/μL、2.06×10^3拷贝/μL,具有较高敏感性;组内与组间变异系数均小于1.1%,具有良好的重复性。应用该方法和普通多重RT-PCR检测临床采集的243份腹泻病料样品,两者的符合率为96.71%。本研究建立的方法为临床PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段。     

青海省部分地区PEDV、TGEV和RV感染情况调查与分析

为了解青海省部分地区猪群中猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(RV)导致猪病毒性腹泻疫病的感染情况与发生现状,本研究首次应用RT-PCR方法对2012年采集的青海省部分地区60份伴有腹泻症状的疑似猪病毒性腹泻病毒感染的临床病料进行猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒的检测与分析.结果显示PEDV、RV和TGEV的阳性率分别为76.7％、51.7％和30.0％;总单独感染率为35.0％,各自单独感染率分别为25.0％、8.33％和1.67％;总混合感染率为51.67％,PEDV/RV、PEDV/ TGEV、PEDV/RV/TGEV的混合感染率分别为23.33％、8.33％和51.67％,不存在RV/TGEV混合感染型.结果表明,青海省部分地区存在这3种导致猪病毒性腹泻疫病病毒的流行,包括单独感染流行和混合感染流行;单独感染中以PEDV流行为主,混合感染中以PEDV/RV和PEDV/RV/TGEV混合感染流行为主;总混合感染率比总单独感染率高.目前青海省部分地区发生的猪病毒性腹泻以PEDV为主要病因,且PEDV/RV、PEDV/RV/TGEV混合感染现象严重,为该地区猪病毒性腹泻的诊断和防控积累了资料.     

同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的四重实时荧光RT-PCR方法的建立及应用

为实现对猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)、猪传染性胃肠炎(porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)和猪流性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的同时鉴别检测,根据PDCoV M基因、TGEV S基因、PoRV VP6基因和TGEV N基因保守区域序列合成特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了一种可同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的实时荧光RT-PCR方法。结果显示,所建立的四重实时荧光RT-PCR方法仅对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV出现阳性扩增,与PRV、PPV、PRRSV、CSFV、PCV2等猪常见病原无交叉反应;对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的最低检出限分别为1.17×10³,1.13×10³,1.31×10²和1.18×10^2<...     

猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A型轮状病毒多重RT-PCR方法的建立及其应用

为了建立一种能够同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(RVA)的敏感、特异的多重RT-PCR(mRT-PCR)方法,本试验分别针对PEDV和TGEV的N基因、RVA的VP7基因设计了4对引物(其中针对PEDV N基因的引物为内、外2对),结合mRT-PCR和PEDV的套式RT-PCR(nRTPCR),建立了检测PEDV、TGEV和RVA的mRT-PCR方法。mRT-PCR能够同时扩增出针对3种病毒的预期大小的目的核苷酸片段,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒及猪圆环病毒2型等病毒无交叉反应;可以检测到PEDV、TGEV和RVA的最低核酸浓度分别为16.07、803.9和321.5μg/L。应用mRT-PCR检测了31份腹泻仔猪的血清、肛拭子或小肠组织,其中PEDV、TGEV与RVA的阳性率分别为61.29%、6.45%和25.81%,并检测到了PEDV与RVA或TGEV双重感染及PEDV、TGEV和RVA三重感染的样品。在检测临床样品时,mRT-PCR和单项RT-PCR检出PEDV、TGEV和RVA的符合率分别为96.77%、93.54%和93.54%。上述结果表明,mRTPCR能够快速鉴别检测PEDV、TGEV和RVA 3种病毒,PEDV是引起当前仔猪腹泻的主要病原。     

3种致猪腹泻病毒的多重RT-PCR检测

试验建立了用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与猪轮状病毒(PRV)的三重RT-PCR方法,以调查猪群中腹泻病毒感染情况.通过该方法对采自广东省规模化猪场的95份临床疑似病毒性腹泻病料进行了检测,结果表明,猪流行性性腹泻病毒阳性率为33.7%,猪传染性胃肠炎病毒阳性率为4.2%,猪轮状病毒阳性率为20%;猪流行性性腹泻病毒和猪轮状病毒混合感染率为8.4%,猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒混合感染率为2.1%.     

猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。     

多重RT-PCR检测猪传染性胃肠炎与流行性腹泻病毒

猪传染性胃肠炎(TGE)与流行性腹泻(PED)是仔猪腹泻的两种重要疾病。二者在流行特点、临床症状和病理变化上都十分相近,不易区分〔1〕。针对TGEV与PEDV基因的保守区域各设计一对引物,在同一反应管中反转录扩增,产物通过1%琼脂糖凝胶电泳,出现528bp和403bp两个条带,两个扩增条带的大小与预期相符。     

检测猪流行性腹泻病毒的R-PCR方法的建立

根据猪流行性腹泻病毒 (PEDV)的N基因自行设计和合成了一对可扩增长度为 641bp目的片段的引物 ,成功地建立了检测的猪流行性腹泻病毒的RT PCR方法。对猪轮状病毒 (PRV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)的RT PCR检测结果均呈阴性。对PEDV JS株的RT PCR产物的序列分析表明 ,与CV777株的同源性为 97 3 %。     

Establishment and Application of a Double RT-PCR Method for Detection of PEDV and TGEV

The study was aimed to establish a rapid one-step duplex RT-PCR detection method,which could be used to identify and diagnose PEDV and TGEV in clinical diarrhea cases.According to the gene sequences of PEDV and TGEV from GenBank,two pairs of specific primes were designed.Through optimizing and selecting of the best reaction conditions,we finally pinpointed the duplex one-step RT-PCR detection method with strong specificity,which could detect 1×10^-5 diluent degree of vaccine. Suspected samples,which were collected from different pig farms in 2015,were detected of PEDV with 100% positive rate.The method was rapid,high sensitivity and specificity,which could be used for clinical detection of PEDV and TGEV,and also for epidemiological investigation.     

猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒一步法双重RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究旨在建立一种用于临床腹泻病例中猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）快速检测的一步法双重RT-PCR方法。根据GenBank中收录的PEDV和TGEV的基因序列,分别设计两对特性引物,经最佳反应条件的优化和选择,结果显示,该一步法双重RT-PCR检测方法能同时特异性扩增PEDV和TGEV,该方法可检测到稀释度1×10^-5的疫苗毒。应用本方法检测2015年度实验室收集的疑似样品,PEDV阳性率为100%。本研究建立的方法快速、敏感性高、特异性强,可用于临床PEDV和TGEV的快速检测及流行病学调查。     

抗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体制备及其临床应用研究

本研究旨在制备猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒高免卵黄抗体,研究其治疗效果。以猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻二联灭活苗免疫产蛋鸡,琼脂扩散方法检测抗体效价达到1∶64时,收集卵黄,采用氯仿抽提和硫酸铵盐析法纯化卵黄抗体,进行微生物学检测、安全性试验,通过人工感染治疗试验和临床应用,观察其治疗效果。结果人工感染治愈率为100%,临床应用治愈率为88.0%,表明制备的卵黄抗体对猪传染性胃肠炎和流行性腹泻具有显著的治疗效果。     

Establishment and Application of a Multiplex RT-PCR Assay for Detection of PEDV,TGEV and PRoV

In this study,a multiplex RT-PCR assay was established to differentially detect porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine rotavirus (PRoV) after optimization of the reaction conditions.Three pairs of primers PEDV-N,TGEV-M and PRoV-VP6 were designed for specifically amplifying PEDV N gene,TGEV M gene and PRoV VP6 gene,respectively.The assay could specifically amplify PEDV,TGEV and PRoV,but not classical swine fever virus (CSFV),porcine foot and mouth disease virus (FMDV),pseudorabies virus (PRV),porcine parvovirus (PPV) and porcine circovirus type 2 (PCV2).The detection limits of PEDV,TGEV and PRoV standard recombinant plasmids were 1.41×10³,1.41×10² and 1.41×10³ copies/μL,respectively.The repeated reaction under the same conditions obtained uniform results.The assay was used to detect a total number of 190 clinical samples,of which 42 (22.11%) samples were positive for PEDV,58 (30.53%) samples for TGEV and 34 (17.89%) samples for PRoV,and there were mixed infection among these viruses.The results indicated that this multiplex RT-PCR assay had the advantages of sensitivity,specificity and repeatability and provided a useful tool for differential detection and epidemiological investigation of PEDV,TGEV and PRoV.     

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,针对TGEV N基因全序列设计合成了一对引物,以TGEV疫苗株为模板,建立了检测TGEV的RT-PCR方法.应用该方法对TGEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为1 168 bp的特异性目的片段;测序结果与已报道的TGEV不同毒株序列的同源性为95%～97%;敏感性测定结果为可扩增到18 pg的TGEV N基因cDNA.结果表明,建立的RT-PCR方法对TGEV的检测敏感性高、特异性强,可用于TGEV感染的诊断和流行病学调查.     

猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二重PCR检测方法的建立

通过对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因和猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因进行序列分析,本试验利用DNAStar软件分别设计2对特异性引物,扩增片段长度分别为299和437 bp,建立一种针对TGEV和PEDV感染的二重PCR鉴别诊断方法.该方法能同时检测到TGEV和PEDV,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等均无扩增,其检测TGEV、PEDV的极限为10⁴ 拷贝/μL;用该方法对临床收集的68份疑似病毒性腹泻仔猪粪便和肠道组织样本进行检测,结果表明本试验建立的二重PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查.     

Establishment of Double PCR Detection Method of Transmissible Gastroenteritis Virus (TGEV) and Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)

Two pairs of primers used to respectively amplify transmissible gastroenteritis virus (TGEV) S gene and porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) M gene were designed to develop a method of differential diagnosis of TGEV and PEDV.The established double PCR could detect S gene of TGEV with the length of 299 bp and M gene of PEDV with the length of 437 bp.Negative results using CSFV,PCV2,PRRSV and PRV as control were obtained.The detection limit of this method was 10⁴ copies/μL.68 clinical samples collected from swine farm were submitted to detect TGEV and PEDV,and the result showed that the established double PCR method with the characteristics of high sensitivity and high specificity could be widely used in clinical diagnosis and epidemiological investigation.