烟草Ⅰ类几丁质酶,β—1,3—葡聚糖酶cDNA的克隆和序列分析

我们以烟草花叶病毒感染７天后的三生烟为材料，对经过修饰的烟草Ⅰ类几丁质酶和Ⅰ类β－１，３－葡聚糖酶ｃＤＮＡ进行了克隆和序列分析。结果表明，Ｃｈｉ－Ｉ，Ｇｌｕ－－Ⅰ的全长ｃＤＮＡ分别为９９０ｂｐ和１０２０ｂｐ。另外，核苷酸及由此推断的氨基酸序列与文献报道的序列相比较，分别具有Ｃｈｉ－Ⅰ：９９．９％ＧＮＧ ９９．７；Ｇｌｕ－Ⅰ：９９．６％与９９．４％的同源性。     

不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA全长的克隆与表达分析

以不结球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)抗病自交系雪克青为实验材料,通过RACE技术,获得了不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因的cDNA全长序列。序列分析发现,该基因全长1275bp,编码363个氨基酸,分子量40.66kD,等电点(pI)9.27。推导的氨基酸序列与芜菁bg1基因具有96%的同源性,与拟南芥bg2基因具有61%的同源性,与其它植物β-1,3-葡聚糖酶基因的同源性为49%￣57%。将该序列提交GenBank,登录号为AY836001。Southern杂交显示该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于1个。半定量RT-PCR分析表明,该基因有低水平的组成型表达,在霜霉病菌(Peronosporaparasitica)诱导后24h其表达量达到高峰。     

地衣芽孢杆菌β-1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆和表达

提取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)基因组，通过PCR克隆了该菌的β-1，3-1，4．葡聚糖酶基因全长。该基因全长818bp,ORF为732bp,编码243个氨基酸，计算分子量为27.35kD，等电点为8．31。经Blast分析，该序列与短小芽孢杆菌(B．pumilus)同源性最高(99％)，而与基因库中地衣芽孢杆菌的同源性为94％，该基因已被GenBank接受(AY225317)。用BamHI和XhoⅠ双酶切目的片断和表达载体pET-30a( )后相连接，构建重组表达载体pET-lic，并导人大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中表达。酶学特性表明：SDS-PAGE电泳在27kD左右有表达蛋白带，该工程菌总酶活达67．34U／mL，是出发菌的60倍，最适温度在50℃左右，最适pH在5～6之间。该工程菌可作为材料构建耐热性好和酶活高的杂合基因工程菌。     

硅对水稻防御性关键酶活性的影响及其与抗稻瘟病的关系

通过室内溶液培养试验,研究了硅酸盐对接种稻瘟病菌后水稻的病情指数、植株生物量、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影响。结果表明,施硅能显著降低水稻稻瘟病的发病率和病情指数,防治效果达60.59%;显著减轻稻瘟病对水稻地上部的危害,干物质量显著高于不施硅处理,但对地下部生长影响不明显;接种后水稻叶片POD活性均升高,在第5 d达到最大值,施硅处理显著低于不施硅处理,与稻瘟病抗性成负相关;水稻叶片PPO活性在接种后第5 d达到峰值,从第4 d开始施硅处理显著高于不施硅处理;接种后水稻叶片的PAL活性快速升高,在第24 h达到最大值,施硅处理显著高于不施硅处理,是其1.44倍。说明硅能提高防御性关键酶的活性,参与水稻本身防卫机制,通过一系列的生理生化作用来增强水稻的抗性。     

花生β-1,3-葡聚糖酶基因启动子功能区的缺失分析

花生β-1,3-葡聚糖酶基因启动子(Arachis hypogaea promoter of β-1,3-glucanase,Ah-Glu-Pro)属于诱导型的启动子.为分析该启动子序列中对外源信号分子响应的重要顺式调控元件,利用交错式热不对称PCR(thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction,TAIL-PCR)方法扩增得到长度为970 bp的Ah-Glu-Pro序列.PLACE和PlantCARE在线预测结果表明,该启动子序列中含有对病原菌及水杨酸(salicylic acid,SA)响应的顺式调控元件,如GRWAAW、GTl-motif、W-box、RAV lAAT、INRNTPSADB、AMMORESIVDCRNIA1和BIHD 1OS.根据预测结果,在5’端设计5个正向引物Glu-F、Glu-P4、Glu-P3、Glu-P2和Glu-P1,3’端设计一个反向引物Glu-R,5个引物对扩增得到该启动子序列Ah-Glu-P以及5'端4个缺失片段Ah-Glu-P4～Ah-Glu-P1,长度分别为931、767、650、376和217 bp.将这5个片段分别克隆到pCAMBIA 1301-xylA载体中,构建以木糖异构酶基因(xylose isomerase gene,xylA)作为安全筛选标记、以β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase gene,GUS)作为报告基因的相应5个植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-Glu-P～pCAMBIA 1301-xylA-Glu-P1.将这5个表达载体分别转化洋葱(Allium cepa)表皮细胞,进行GUS蛋白组织化学染色及GUS酶活性检测,结果表明,经SA诱导后,转入Ah-Glu-P～Ah-Glu-P3 3个载体的洋葱表皮细胞中的GUS酶活性分别提高1.45、2.16和1.27倍,转入Ah-Glu-P2～Ah-Glu-P1载体的洋葱表皮细胞在SA诱导前后GUS酶活性无明显差别.结合软件预测结果推测,在启动子Ah-Glu-P、Ah-Glu-P4和Ah-Glu-P3内部存在的RAV1 AAT、MYBCOREATCYCB1和INRNTPSADB为对SA响应的正调控元件;在Ah-Glu-P～Ah-Glu-P4之间存在的GT1-motif和AMMORESIVDCRNIA1为对SA响应的负调控元件.对这些重要顺式调控元件功能的进一步确认将为通过调控实现花生内源β-1,3-葡聚糖酶基因的高效表达、提高花生(Arachis hypogaea)的抗病性、以及在花生遗传转化过程中特异诱导表达启动子的有效利用提供理论依据.     

转几丁质酶基因水稻对土壤化学性状及酶活性的影响研究

对种植转几丁质酶基因水稻“竹转68”农田土壤化学性状的变化研究结果表明，当年种植和连续2年种植转基因水稻“竹转68”农田土壤有机质、可溶性N、P以及过氧化氢酶、多酚氧化酶、蔗糖酶和脲酶活性与非转基因水稻对照相比无显著差异，且其叶片的化感作用大于非转基因水稻对照，但其腐殖过程化感效应及残体腐殖速度均小于非转基因水稻对照；经过冬季腐殖过程2种水稻土壤腐殖化程度基本一致，表明种植转基因水稻“竹转68”对水稻生产不会产毕不利影响．     

含粘质沙雷氏菌几丁质酶SchiA基因的植物转化质粒pBGll12构建和水稻遗传转化

将一个2．8kb的CaMV35S启动子／SchiA编码区／Nos终止区融合基因插入到植物转化载体pCAMBIAl301的多克隆酶切位点,得到1个14．6kb的新植物转化质粒pBGlll2,用花器介导法转化水稻(Oryza sativa),经PCR检测,初步证实已将目的基因整合到受体植物的基冈组中。一部分转基因T3代潮霉素抗性阳性植株对水稻纹枯病(Rhizoctonia solani)和稻瘟病(Pyricularia oryzae)的抗性较非转化对照增强。RT—PCR表明抗病性植株为阳性,而不抗病的植株为阴性。将RT—PCR产物测序后,用BLAST软件分析序列可知,该序列为细菌几丁质酶基因核苷酸序列而不是植物几丁质酶基因的核苷酸序列。T4代转基因水稻的几丁质酶活力高于对照未转基因植株,表明转入的外源几丁质酶基因能正常表达。     

β-葡聚糖酶的热稳定性改造及酶学性质分析

为了获得热稳定性有所提高的β-葡聚糖酶，本研究利用定向进化技术对β-葡聚糖酶基因进行改造，并对野生酶和突变酶的酶学性质进行研究。结果获得了两株热稳定性有所提高的突变体，分别命名为EGs1和EGs2；酶学性质分析结果显示：与野生酶相比，EGs1和EGs2突变酶的Tm值分别提高了3℃和5℃，达到了65.5℃和67.5℃；突变酶的最适反应温度也提高了5℃，达到了60℃；两个突变酶对地衣多糖的水解能力分别被提高28％和降低21.6％；对地衣多糖的亲和力未见改变；野生酶和EGs1突变酶的最适pH值为6.5，而EGs2突变酶的最适pH值为7.0；野生型和突变型-葡聚糖酶都有较宽的pH稳定范围，在pH 6.0-8.5的范围内放置48小时，仍保持80％以上的酶活力；遗传稳定性检验结果表明突变株的遗传稳定性良好。这一结果说明了定向进化在改善酶性质方面是比较有效的策略。     

农抗211对水稻纹枯病菌细胞膜和抗氧化酶活性的影响

为探究链霉菌JD211所产活性物质农抗211抑制水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)的作用机制,采用不同浓度(0.46、0.63、1.26、2.53、4.00、5.06 μg·mL-1)农抗211作用纹枯病菌,检测纹枯病菌菌丝细胞膜透性和抗氧化系统的变化.结果表明,与对照相比,处理组荧光染料碘化丙啶(P...     

氮、磷肥对裸燕麦子粒产量和β-葡聚糖含量的影响

以裸燕麦青永久887(Avena nuda L. cv. Qingyongjiu No.887)为材料,研究了施氮和施磷对子粒产量与β-葡聚糖含量的影响;分析了N、P肥对裸燕麦子粒产量构成因素,穗数、穗粒数、穗粒重、千粒重的影响,并进行了经济效益分析。结果表明,裸燕麦穗数、穗粒数、穗粒重、千粒重及子粒产量,随施氮量的增加呈先增后降变化趋势;随施磷量的增加而增加。β-葡聚糖含量随施氮或施磷量的增加而增加。在N 90 kg/hm2、P2O5 90 kg/hm2处理下,裸燕麦穗数、穗粒数、穗粒重、千粒重、子粒产量均达最高值;在N 135kg/hm2、P2O5 90 kg/hm2处理,裸燕麦子粒β-葡聚糖含量最高。经济效益分析表明,经济施肥量为:N 90 kg/hm2、P2O5 90 kg/hm2。裸燕麦子粒产量Y (kg/hm2),可用其与N (kg/hm2)和P (P2O5,kg/hm2)肥间的二元二次回归方程估测。     

含粘质沙雷氏菌几丁质酶SchiA基因的植物转化质粒pBG1112构建和水稻遗传转化

摘要:将一个2.8 kb的CaMV35S启动子/SchiA编码区/Nos终止区融合基因插入到植物转化载体pCAMBIA1301的多克隆酶切位点，得到1个14.6 kb的新植物转化质粒pBG1112,用花器介导法转化水稻（Oryza sativa ），经PCR检测，初步证实已将目的基因整合到受体植物的基因组中。一部分转基因T3代潮霉素抗性阳性植株对水稻纹枯病(Rhizoctonia solani )和稻瘟病（Pyricularia oryzae）的抗性较非转化对照增强。RT-PCR表明抗病性植株为阳性，而不抗病的植株为阴性。将RT-PCR产物测序后，用BLAST软件分析序列可知，该序列为细菌几丁质酶基因核苷酸序列而不是植物几丁质酶基因的核苷酸序列。T4代转基因水稻的几丁质酶活力高于对照未转基因植株，表明转入的外源几丁质酶基因能正常表达。     

饲料中β-葡聚糖酶活力的测定方法研究

针对按照农业行业标准NY/T 911-2004 《饲料添加剂β-葡聚糖酶活力的测定分光光度法》检测饲料中β-葡聚糖酶活力时存在的问题,对该标准方法中样品前处理方式、待测酶液浓度范围、样品空白测定准确性、计算公式等进行了优化。结果表明,用优化后的方法能简便、准确地检测饲料中的β-葡聚糖酶活力,且方法重现性较好。     

硅对水稻叶片抗氧化酶活性的影响及其与白叶枯病抗性的关系

以感白叶枯病的水稻品种日本晴(Oryza sativa L. cv. Nipponbare)为材料,在溶液培养条件下,研究了硅对接种白叶枯病菌后的水稻病情指数、叶片丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)含量以及超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、脂氧合酶(LOX)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的影响。结果表明,施硅能显著降低水稻白叶枯病的病情指数,防治效果达62.86%。接种白叶枯病菌后48 h内,施硅处理的水稻植株,叶片中丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)含量显著升高;显著提高感病植株叶片中脂氧合酶(LOX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性;降低过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性;促进过氧化氢(H2O2)在植物体内积累,加强膜脂过氧化作用。因此,硅可通过参与植株体内代谢,调节抗氧化系统酶活性,激发机体过敏反应(HR),增强植株对白叶枯病抗性。     

木霉β—1，3—1，4—葡聚糖酶性质及其cDNA片段克隆

本研究探讨了里氏木霉GXC的-1,3-1,4-葡聚糖酶特性，克隆和分析了酶基因片段。结果表明，粗酶液经硫酸铵沉淀、SephadexG-25、SephadexG-100和DEAE-SephadexA-50柱层析得到纯-1,3-1,4-葡聚糖酶；经12.5%SDS-PAGE凝胶电泳表明，该酶的分子量为35.21kD；酶最适反应pH5.0，最适反应温度为60℃；Michaelis-Menten动力学分析表明，-1,3-1,4-葡聚糖酶的Km和Vmax分别为10.86mg/mL和14286mol/(minmg)。通过RT-PCR方法扩增并克隆了-1,3-1,4-葡聚糖酶cDNA片段，测序表明,该片段长度为280bp；同源性分析显示，该cDNA片段与水解淀粉芽孢杆菌、厌氧真菌OrpinomycesstrainPC-2、枯草芽孢杆菌中的-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因片段有较高的同源性，分别为90%，79%，91%。     

内生解淀粉芽胞杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglS)的克隆与表达及酶学特性分析

β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶普遍存在于植物内生芽胞杆菌中,为了探讨其功能,以内生解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TB2菌株基因组为模板,克隆了β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因(bglS).测序结果表明,该基因的ORF全长732 bp,编码一条243个氨基酸的蛋白,理论分子量约为27.33 kD,等电点约为6.89,其ORF序列已登录GenBank(Accession No.EU368224).Blast同源性分析结果表明,该基因的ORF序列与植物互作生防解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens FZB42,GenBank Accession No.CP000560)的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因核苷酸序列的一致性达97.3%,氨基酸序列的一致性达97.1%.将β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因全长克隆至pUC18载体上,利用基因自身的启动子构建重组表达载体pUC-bglS,并导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中表达.SDS-PAGE分析表明,BL21::pUC-bglS菌株表达了27 kD左右的蛋白;该酶的最适反应温度为55℃,在50℃以下保温60 min后残余80%以上酶活;最适反应pH为6.2,在pH4.4～6.8 4℃保温30 min残余85%以上的酶活;Ca2+和Fe肛可提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性,而Cu2+、Zn2+、Mg2+和Mn2+对其活性具有显著的抑制作用.实验结果为进一步研究植物内生解淀粉芽胞杆菌TB2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的功能和应用打下了基础.     

金属离子对苏云金芽孢杆菌几丁质酶活力的影响

几丁质酶(EC3．2．1．14)是细菌、病毒、真菌等微生物、高等植物和昆虫体内普遍合成的一种具有生物催化活性的水解酶类。它能特异地催化水解几丁质的β-1,4-糖苷键生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)。几丁质酶因为具有水解几丁质破坏围食膜的作用而被作为防治真菌病害和害虫的潜在靶标(蒋红彬等,2000；沙莉等，2003)。几丁质酶能增强苏云金芽孢杆菌(Bt)的杀虫效果，有利于克服或延缓昆虫对Bt的抗性。     

枯草芽孢杆菌ZJF-1A5 β-葡聚糖酶基因的克隆、序列分析和表达

β-1,3-1,4-葡聚糖酶是重要的工业用酶,可有效减少大麦β-葡聚糖在啤酒酿造中所造成的麦汁过滤困难和啤酒的非生物性浑浊等负面影响.但内源β-葡聚糖酶在麦芽干燥和糖化过程中丧失了大部分活性.而微生物来源β-葡聚糖酶与麦芽内源酶有相同的底物专一性,且热稳定性优于麦芽内源酶.本研究对Bacillus subtilis mutant ZJF-1A5葡聚糖酶基因进行克隆、序列分析和表达,并对酶在细胞中的分布和酶的热学性质进行了研究.     

枯草芽胞杆菌ZJF-1A5的β-葡聚糖酶热稳定性改造及酶学性质分析

利用定向进化技术对来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)ZJF-1A5的β-葡聚糖酶基因进行改造,并对野生酶和突变酶的酶学性质进行研究。获得了2株可以产较高热稳定性酶的突变体,分别被命名为EGs1和EGs2。酶学性质分析结果显示,与野生酶相比,EGs1和EGs2突变酶的半失活温度分别提高了3和5℃,达到了65.5和67.5℃;突变酶的最适反应温度也提高了5℃,达到了60℃;2个突变酶对地衣多糖的水解能力分别提高28%和降低21.6%;对地衣多糖的亲和力未见改变;野生酶和EGs1突变酶最适pH6.5,而EGs2突变酶最适pH7.0;野生型和突变型β-葡聚糖酶都有较宽的pH稳定范围,在pH6.0～8.5的范围内放置48h,仍保持80%以上的酶活力。遗传稳定性检验结果表明,突变株的遗传稳定性良好。     

编码日本梨树(Pyrus pyrifolia )花粉类β-1,3-葡聚糖酶蛋白的cDNA克隆与核苷酸序列

构建了日本梨树(Pyrus pyrifolia)花粉cDNA文库,发现了一个编码花粉管分泌的类β-1,3-葡聚糖酶蛋白(BGN-1)的cDNA(bgn-1)并测定了其序列.bgn-1由1408 bp组成,包括47 bp的5'-非翻译区,由1194bp组成并编码了397个氨基酸的ORF和167 bp的3'-非翻译区.3'-非翻译区含有1个NUE(AATTAA)和3个似FUE的基序,分别位于1369～1374(AATTAA)、1320～1325、1327～1332(TTTTTA)和1363～1368(TTTGGA).bgn-1编码的蛋白(BGN-1)与DDBJ中的植物β-1,3-葡聚糖酶的序列相似性范围为37%～59%,与3D结构已知的大麦β-1,3-葡聚糖酶(GⅡ)的序列相似性为39.7%.对GⅡ与BGN-1进行的疏水簇分析(HCA同源分为87.1%,＞75%的一般标准)和使用3D-PSSM软件进行的分析暗示,BGN-1的3D结构与大麦GⅡ同源性最大(≥95%的肯定度).BGN-1的信号肽长度为22 aa,成熟的BGN-1(375 aa)的理论分子量为4 0723 D,理论pI值为9.59,诊断氨基酸残基模式(D,L,S,L)与禾谷类的与生长相关的亚家族D的诊断氨基酸残基模式(D,L,S,Q)极相似.在BGN-1的C-端延伸区的位点352～367之间发现了1个功能不清,重复出现的ProXXPro结构.     

施硅对水稻白叶枯病抗性及叶片抗氧化酶活性的影响

【目的】水稻白叶枯病是一种细菌性枯萎病害,是限制水稻生产的重要生物因素之一。通过田间接种白叶枯病菌,研究施硅对水稻叶片中丙二醛含量及抗氧化系统酶活性的影响及其抗白叶枯病的机理,为安全有效的防治病害提供理论依据。【方法】以唐粳2号水稻品种为材料,2013年在河北省秦皇岛市进行田间试验,试验在两个施氮水平 [N 180 kg/hm2(正常供氮,N180), 450 kg/hm2(高量供氮,N450)]下设3个硅处理[不施硅(-Si),施硅酸钠(Si1, 以SiO2计,70 kg/hm2), 施硅钙肥(Si2, 以SiO2计,70 kg/hm2)],在水稻孕穗期采用剪叶法接种白叶枯病菌,研究硅对接种后30 d水稻病情指数和第1 d、 3 d、 5 d、 7 d和10 d水稻叶片中丙二醛(MDA)含量、 超氧化物歧化酶(SOD)活性、 过氧化氢酶(CAT)活性、 抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的影响。【结果】接种白叶枯病菌后,正常供氮水平,施硅处理的病情指数比不施硅处理平均降低17.8%(P0.05); 高量供氮水平,施硅钙肥的病情指数比不施硅降低15.1%(P0.05),而施硅酸钠的病情指数差异不显著。接种白叶枯病菌后,施硅处理的水稻叶片MDA均低于不施硅处理,且在正常供氮水平第7 d和高量供氮水平第3 d、 第7 d差异达显著水平。接种白叶枯病菌后,正常供氮水平第1 d、 第7 d和高量供氮水平第1 d、 第5 d,施硅处理的水稻叶片中SOD活性均显著高于不施硅处理,且第1 d施硅钙肥的叶片SOD显著高于施硅酸钠处理; 接种白叶枯病菌后,施硅处理的水稻叶片中CAT活性均高于不施硅处理,但未达显著水平; 高量供氮水平第1 d、 第7 d和第10 d施硅处理的水稻叶片中APX活性均显著高于不施硅处理。【结论】施硅能提高感病水稻叶片中SOD、 CAT和APX的活性,降低水稻叶片中MDA含量,有效清除植物体内活性氧(ROS),从而增强了水稻抗白叶枯病的能力; 在高量供氮水平下,硅钙肥抵御白叶枯病效果好于硅酸钠。