一株棉花黄萎病拮抗芽孢细菌的分离鉴定及活性检测

 采用改良的琼脂平板扩散法,通过初筛和复筛,得到一株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）具有较强的抑菌活性的拮抗细菌Z-5菌株。通过对该菌株的形态特征观察、生理生化鉴定和16S rDNA的序列分析,确定拮抗细菌Z-5菌株为Bacillus malacitensis。盆栽实验表明Z-5菌株对大丽轮枝菌的防治效果达到76.05%,对棉花黄萎病具有明显的防治作用。     

棉花黄萎病拮抗细菌的筛选与抗菌物分析

对21株芽孢杆菌属细菌分别进行了摇瓶震荡培养,其发酵液上清液用硫酸铵盐析,杯碟法测定了沉淀物对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)的拮抗活性,并对其中6株具有较强抑菌活性菌株的抗菌物进行了蛋白酶稳定性、热稳定性等分析.结果显示,BDT-25、JJ-5、DHT-12、80b-2、DHT-13和JJ-134菌株的抑菌活性较高;6株拮抗细菌发酵液沉淀物均对氯仿敏感,抗菌物溶液经蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后活性丧失或显著下降,对温度也较敏感,认为这些抗菌物质为蛋白或多肽类物质.拮抗菌株产生的抗菌蛋白通过抑制大丽轮枝菌孢子萌发和使菌丝体原生质凝集而抑制其生长.     

大丽轮枝菌拮抗细菌的分离与抗菌物质鉴定

从黄萎病发病棉田未发病棉株根际土样中分离芽孢杆菌,利用对峙培养法对大丽轮枝菌进行平板拮抗实验,筛选出6株对大丽轮枝菌有拮抗作用的芽孢杆菌,其中3株菌发酵代谢产物具有抗菌活性。S4-3菌株发酵液滤液经100℃、30min热处理丧失抗菌活性,发酵液氯仿抽提物不具有抗菌活性,发酵液硫酸铵沉淀物有抑菌活性,但经蛋白酶处理后活性丧失,认为S4-3菌株抑菌活性物质是蛋白质。而菌株S4-5发酵液经100℃热处理后还有较高的抗菌活性,发酵液氯仿抽提物也具有抗菌活性,但硫酸铵沉淀物对病原菌无抑制作用;S5-6菌株发酵液滤液经100℃热处理丧失抗菌活性,硫酸铵沉淀物也不具有抗菌活性,而发酵液氯仿抽提物有抗菌活性,因此认为S4-5和S5-6菌株产生的抑菌物质不是蛋白质类。     

棉花根部拮抗枯萎病菌或黄萎病菌的可培养内生细菌多样性分析

为解析棉花内生细菌的种群结构,更好地开发利用生防内生细菌,以棉花枯萎病菌、黄萎病菌为指示病原真菌,对常抗棉和泗棉3号根部分离获得的内生细菌进行拮抗活性筛选,获得87株至少对其中1个指示病原真菌具有拮抗作用的内生细菌。ARDRA分析(Amplified ribosomal DNA restriction analysis)和16S r DNA序列测定表明棉花根部可培养内生拮抗细菌可分为13个ARDRA类群,分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、农杆菌属(Agrobacterium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、不动杆菌属(Acinetobacter)和假单孢菌属(Pseudomonas)7个属。其中常抗棉根部内生拮抗细菌分属于芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属和农杆菌属,而泗棉3号根部内生拮抗细菌则分属于芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、中华根瘤菌属、不动杆菌属和假单孢菌属,二者的优势种群都是芽孢杆菌属细菌。BOX-PCR分析显示这些内生拮抗细菌具有丰富的遗传多样性。通过测定这些内生拮抗细菌对棉花黄萎病菌和棉花枯萎病菌的拮抗力大小,以及是否具有产纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶和嗜铁素的活性,表明这些内生拮抗细菌具有不同的生防作用机制。     

木霉菌对棉花黄萎病菌拮抗的作用

以绿色木霉(Trichoderma viride)、康氏木霉(Trichoderma koningii)，以及二株未知种名的木霉菌株(Trichoderma spp.)为供试菌，采用对峙培养测定其对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)的抑制作用，并研究了四种木霉菌产生的非挥发性代谢物对菌丝干重的影响。结果表明：在对峙培养中，木霉菌对棉花黄萎病菌均有明显抑制作用，木霉菌产生的非挥发性代谢物可以强烈抑制棉花黄萎病菌生长，明显降低其菌丝干重，并具有热稳定性。光学显微镜下观察，木霉菌丝在棉花黄萎病菌丝上平行或波浪式生长且棉花黄萎病菌丝出现细胞原生质浓缩和菌丝断裂等现象。     

棉花黄萎病拮抗细菌LC-04菌株的抗菌蛋白产生条件研究

LC-04菌株是从棉花叶部组织中分离出的一株类芽孢杆菌,其发酵液上清液的硫酸铵沉淀物对大丽轮枝菌V-190菌株的生长具有明显的拮抗作用,实验证明发酵液中含有蛋白质类抗菌物质。LC-04菌株的适宜发酵条件为:在pH7的LBG培养基中于30℃,180 r.min-1摇床振荡培养48 h,用70%硫酸铵对LC-04菌株发酵液上清液进行盐析,可以沉淀最多的抗菌蛋白。     

拮抗细菌C-02防治棉花黄萎病的机理研究

 从抗生、竞争和诱导系统抗性三个方面对拮抗细菌C-02防治棉花黄萎病的机理展开了研究,结果表明,C-02分泌的抗菌蛋白能溶解病原菌VD-11的细胞壁,抑制其致萎毒素的分泌。与病原菌VD-11相比,C-02利用碳源有明显优势,在棉花根际土壤中具有显著的营养竞争优势和很好的定殖能力。C-02处理棉苗后,棉叶中植株防御性酶系PAL、POD和PPO的活性提高幅度大,维持时间长。C-02防治棉花黄萎病的机理是抗生、溶菌、竞争和诱导棉苗系统抗性的综合表现。     

兰花枯萎病拮抗细菌的筛选与鉴定

为筛选对兰花枯萎病病原菌尖孢镰刀菌具有拮抗作用的芽孢细菌,从各地采集的土样中分离获得的237株芽孢杆菌进行初筛、复筛,最终从衡水饶阳县棉田的土样中筛选出的芽孢杆菌3A3-15,对病原菌有较强的抑菌活性,且抑菌谱广。结合形态学观察、生理生化试验,根据16S rDNA序列相似性分析,此菌株与Bacillus velezensis标准菌株CR-502的16S rDNA序列相似度达99.92%,因此,鉴定拮抗菌株3A3-15为Bacillus velezensis。     

棉花黄萎病菌鉴定技术进展

黄萎病作为一种危害严重的世界性病害，如何快速有效地鉴定黄萎病菌已成为当今学术界普遍关心的问题。本文综述国内外有关黄萎病菌鉴定技术的发展动态，旨在为从事棉花黄萎病研究的科学工作者提供可资借鉴的研究信息     

棉花黄萎病拮抗细菌2-70（Bacillus subtilis）菌株定殖能力的研究

试验通过灭菌土和非灭菌土两种土样,试验前分别对这两种土样进行三种不同的处理,即：用拮抗菌芽孢液浸种,土壤全部混菌,部分混菌进行盆栽试验。主要通过盆栽试验,考察棉花黄萎病拮抗细菌2—70在土壤中的定植情况及在棉花根内和根际的定植情况。结果表明,在实验室条件下,拮抗细菌2．70能够在灭菌土和非灭菌土中定殖,且定殖数量达10^6cfu／g土左右,经过五个月后仍能保持较高的抑菌活性,并且菌株在灭菌土中的定殖数量高于非灭菌土中的数量。通过对棉苗根内细菌的回收,证实拮抗细菌2．70能在棉花根内定殖,数量达到10^3cfu／g。     

一株大丽轮枝菌拮抗细菌7-47菌株的分离与鉴定

 从全国各地棉田采集土样,筛选对棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）具有拮抗作用的芽孢杆菌菌株。通过初筛得到具有拮抗作用的菌株68株,复筛选出1株拮抗活性较高的菌株7-47,并通过生理生化试验,形态特征的观察及16S rDNA的序列分析对其进行了鉴定,认为菌株7-47属于漠海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）。     

棉花黄萎菌拮抗菌BDT-25的鉴定及抗菌蛋白产生条件研究

拮抗细菌BDT_25是从根际土壤中分离到的一株对棉花黄萎病菌具有强烈抑制作用的芽孢杆菌。经生理生化特征的鉴定,证明BDT_25菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。此外,该菌株还对棉花枯萎病菌、棉花立枯病菌等10种其他病原真菌的生长具有显著的抑制作用,为一株广谱拮抗细菌菌株。通过对BDT_25菌株培养条件的研究发现,采用NB液体培养基,28℃,170 r/min培养48 h所得发酵液对棉花黄萎病菌的抑制作用最强。其发酵液经硫酸铵沉淀粗提到对棉花黄萎病菌具有抑制作用的提取物,进一步实验表明,该拮抗物质对热和多种蛋白酶敏感,证实其为抗菌蛋白。     

响应面法对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)12-7产抗菌蛋白条件的优化

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)12-7是从发病棉田土壤中分离得到的1株生防细菌,其对棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.V190具有明显的拮抗作用,已证明其抗菌物质为蛋白质。采用响应面法对该生防菌株的产抗菌蛋白条件进行优化,以期为棉花黄萎病生物农药的研制开发以及抗菌蛋白的后续研究奠定基础。以发酵液上清液对大丽轮枝菌的抑菌圈面积为考察指标,首先采用单因子试验考察培养时间、温度、初始pH、碳源、氮源、无机盐等因素对菌株12-7发酵产抗菌蛋白的影响;再根据响应面分析法的基本原理和方法,对发酵条件进行优化。得出该菌株产抗菌蛋白的最优发酵培养基和培养条件为:1.5%(质量分数)蔗糖、1.5%(质量分数)大豆蛋白胨、0.3%(质量分数)NaCl、0.1%(质量分数)K2HPO4、初始p H7.3的培养基,31℃发酵培养60 h。优化后抑菌圈面积从试验设计初期的171.95 mm2提高至320.3 mm2,且经过验证试验证实预测值与实际值之间具有较好的拟合度。     

棉花黄萎病拮抗蛋白的分离与纯化

从棉花叶组织中分离到的类芽孢杆菌(Paenibacillus)LC105菌株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌具有明显的拮抗作用.该菌株发酵液分别用过滤、高压灭菌及有机溶剂处理,初步证明对大丽轮枝菌产生拮抗作用的物质为蛋白质.LC105菌株发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析及Sephacryl S-100凝胶层析分离纯化,得到了分子量为27 kDa的抗菌蛋白.     

棉花黄萎病拮抗细菌B.velezensis6-61拮抗蛋白发酵条件的优化

为了提高棉花黄萎病拮抗细菌B.velezensis 6-61活性物质的产量,为进一步开展6-61菌株的后续研究奠定基础,对6-61菌株产生的活性物质的性质进行了分析,并对其发酵条件进行了优化研究.采用有机溶剂萃取、硫酸铵沉淀对菌株6-61发酵液进行处理并检测抑茵活性,初步确定了该拮抗物质为蛋白质.采用单因素试验对6-6...     

棉花黄萎病拮抗细菌DS45-2菌株在土壤和棉花根内的定殖

通过盆栽试验,对棉花黄萎病拮抗细菌DS45-2菌株在土壤和棉花根际、根内的定殖情况进行了分析。结果表明,在自然条件下,拮抗细菌DS45-2菌株能够在土壤及棉花根际、根内定殖。拮抗菌株DS45-2施到土壤中后的45d内,其定殖数量在开始25d内显著下降,但随后下降缓慢并逐渐趋于稳定,维持在106个·g-1土左右。接菌后45d,DS45-2在棉花根内的定殖菌量达2.35×104个·g-1根,在棉花根际的定殖菌量达97.4×106个·g-1土,且重新分离出的拮抗菌株保持较高的拮抗活性。DS45-2菌株在灭菌土中的定殖数量高于自然土中的数量。随土层深度的增加,定殖菌量呈下降趋势,但变化不明显。     

生防菌株NJ-18的鉴定及其对几种植物病原真菌的拮抗作用研究

NJ-18是从油菜田土壤中分离筛选获得的一株具有抗真菌活性的细菌,本研究从形态和生理生化特征及16S rDNA序列分析,鉴定NJ-18菌株为枯草芽孢杆菌。经平板对峙试验表明,NJ-18发酵液对Sclerotinia sclerotiorum、Rhizoctonia solani、 Fusarium moniliforme、Magnaporthe grisea、F. graminearum、R. cerealis、 Alternaria solani、Botrytis cinerea and Fusarium oxysporum等九种植物病原真菌菌丝生长都具有良好的广谱抑菌活性;盆栽植株试验表明,NJ-18发酵液对小麦白粉病具有很好的保护和治疗作用,发酵原液的保护和治疗作用效果分别高达到96.1%和88.2%,发酵液稀释200倍后处理,对小麦白粉病的保护和治疗作用效果分别达到58.8%和51.4%。