罗汉果性别相关RAPD标记的克隆与序列分析

以罗汉果雌雄株叶片为材料,用90个随机引物进行筛选,其中S60和S90扩增得到3条雄株特异性片段.将这3条差异片段回收、克隆及测序,获得的序列分别为305bp、405bp和746bp.序列分析结果表明,这3个片段为罗汉果中新发现的DNA序列,与一些动物的性染色体有较高的同源性.该结果为进一步将RAPD标记转换成更稳定的SCAR标记,用于罗汉果早期性别的鉴别研究提供了条件.     

花椰菜自交不亲和性的RAPD分析

应用随机扩增多态性DNA（RAPD）分析方法，分别对3组花椰菜自交不亲和系和自交系的基因组DNA进行差异分析。筛选出20个10bp随机引物进行RAPD反应，扩增片段分子量在0．3－3kb之间。其中分别有3、2、3个引物在各组中扩增出差异片段5、4、5条。结果表明，花椰菜自交不亲和系与自交系基因组DNA之间存在明显差异，扩增出的差异片段与花椰 菜自交不亲和性相关。初步探讨了花椰菜自交不亲和性的遗传机制及RAPD技术在自交不亲和系选育过程中的应用前景。     

瓯柑微芽嫁接脱毒及试管苗的快速培育技术

研究了不同大小的瓯柑茎尖分生组织进行微芽嫁接脱除黄龙病病原的效果。在双目实体显微镜下,分别切取含有生长锥及1、2、3和4个叶原基的茎尖分生组织嫁接到黄化砧木上,以获得茎尖微芽嫁接苗,用PCR进行黄龙病分子检测。试验表明:用含1个和2个叶原基的茎尖嫁接获得的试管苗全部不带病毒;含有3个和4个叶原基的茎尖嫁接获得的试管苗其脱毒率分别为95.7%和73%,感病母株和长春花阳性对照可以扩增出535 bp的特异性片段;尽管在含2个叶原基条件下获得的STG成活率为47.7%,但可以达到理想的脱毒效果。试验还证明,瓯柑二次嫁接与茎尖嫁接直接移栽苗的生长量差异极显著。     

番茄抗晚疫病基因ph-3的RAPD及CAPS标记

将番茄抗晚疫病ph-3基因已有的RAPD特异片段进行克隆、测序.根据该测序结果设计SCAR引物对抗病亲本、感病亲本、抗病池、感病池、F_1个体进行扩增,均获得一条592bp的特异片段.感病基因型和杂合抗病基因型存在Xba Ⅰ酶切位点,酶切后分别产生了261bp、193bp和95bp以及592bp、261bp、193bp和95bp的特异性片段,纯合抗病基因型无此酶切位点,酶切结果仍为592bp的产物.这些片段能成功区分抗病材料、感病材料和F_1个体,很有可能是与ph-3基因连锁的CAPS标记.     

太空诱变玉米细胞核雄性可育和不育材料的遗传多态性分析

利用mRNA差异显示技术,对太空诱变玉米细胞核雄性不育和可育材料的mRNA进行了初步分析,用24对锚定引物和5对随机引物的不同组合对不育和可育RNA池进行DD-PCR扩增,1对引物组合BO308(锚定引物)/BO312(随机引物)扩增出了8条差异片段,其中500 bp和600 bp条带清晰,信号较强,而其他片段信号较弱。推断8条差异片段可能与细胞核雄性不育基因有关。     

猪肌生成抑制素下游编码基因的合成及其克隆

将猪肌生成抑制素编码序列下游883～1 126bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化，将优化后序列双链分成12个单链片段，F1、F2、F3、R6、R5、R4、F4、F5、F6、R3、R2和R1，采用化学合成方法合成，每对相邻互补片段之间有20bp序列交叉重叠。Fl长38bp，R1长36bp，其他片段均40bp长，Fl和R1片段两端分别加上限制性内切酶NCoⅠ和XhoⅠ的识别位点序列。经PCR扩增出254bp片段，该片段与pMDI8-T载体连接，转化JM109感受态细胞，所得阳性克隆进行测序分析，得到的克隆序列与设计的序列完全一致。表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体。     

普通小麦抗条锈新种质—体克2号的抗性遗传分析

对普通小麦抗条锈新种质-体克2号进行了遗传学分析和RAPD标记研究。结果表明,体克2号对条中32号生理小种的的抗性是由1对显性基因控制的。RAPD分析筛选出重复性强、在抗病亲本和抗性基因池稳定出现的特异DNA片段2个,即引物S369的扩增片段和引物S1397的扩增片段,其长度分别约为770bp和1400bp。利用Mapmaker3．0对引物S369扩增出来的特异片段与目的基因的遗传连锁性进行分析,该多态性差异与目的基因的连锁距离为10．4cM。     

基于Iso-Seq技术的野生马齿苋叶片转录组分析

基于全长转录组测序(isoform sequencing, Iso-Seq)技术对野生马齿苋叶片(对照、干旱和低温胁迫3种处理的叶片)转录组进行测序及其转录组信息分析的结果显示，总共得到641 732条原始片段，质控后得到合格的插入片段26 758 071条，总碱基量为44 Gb,利用CCS软件获得442 760条一致性序列，根据smrtlink软件得到全长的插入片段和全长的去除嵌合体的插入片段分别为391 258条和301 412条，去除冗余得到103 298条转录本，最终得到39 717条unigene,预测出40 952条LncRNA和38 419条CDS序列；并将unigene与Uniprot、Pfam、GO、KEGG、eggNOG、Pathway和Nr等数据库进行同源比对，其中36 381条unigene被注释，从这些unigene里查找到25 898个简单重复序列标记(simple sequence repeats, SSR)位点。利用差异表达分析软件DESeq2筛选不同处理组间的差异表达基因，对照和干旱处理、对照和低温胁迫处理及干旱和低温胁迫处理间分别鉴定出16 194(...     

中华蜜蜂mrjp3基因cDNA的克隆及序列分析

 以东方蜜蜂（Apis cerana）mrjp3基因部分片段为探针筛选中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）8日龄工蜂头部cDNA文库，得到120个阳性克隆。对这些阳性克隆进行进一步的筛选和序列测定，获得含有中蜂MRJP3 (AccMRJP3)cDNA的阳性克隆，对阳性克隆的插入片段进行测序，得到AccMRJP3的cDNA序列全长。中蜂MRJP3的cDNA全长为1 987 bp（包括10 bp长的poly A尾巴），包含一个长1 779 bp，编码593个氨基酸的ORF，在5'端和3'端各有一个长46 bp和160 bp的非编码区。类似于西方蜜蜂（Apis mellifera）和大蜜蜂（Apis dorsata），由AccMRJP3 cDNA编码的氨基酸序列也存在一个长片段重复区。但比较结果显示中蜂、西方蜜蜂、大蜜蜂MRJP3重复区之间存在一定差异。     

青花菜花芽分化前后内源激素含量及酶活性的变化

青花菜的花芽分化过程伴随着GA3、IAA的含量、POD和转化酶的活性变化。当植株进入花芽分化临界期时,叶片中GA3含量以及POD和转化酶活性均开始剧增,而IAA含量开始剧减;当植株进入第1侧花茎原基分化期和第2～3侧花茎原基分化期,叶片中GA3含量和POD、转化酶活性均出现一高峰值,而IAA含量出现一低峰值。可见,青花菜侧花茎每一级的花芽分化要求较高含量的GA3、较低含量的IAA和较高活性的POD、转化酶。     

花叶病毒侵染的果蔗(Badila)的基因表达

采用荧光标记差异显示技术(d ifferential d isp lay,简称DD-PCR)对甘蔗花叶病毒(Sugarcane m osaic virus,SCMV)侵染的果蔗(Bad ila)基因表达进行研究.用随机筛选出的23对引物组合扩增出9条差异条带,其中4条是有明显差异表达的cDNA条带,5条是表达强弱的差异条带.同时对一些影响荧光标记DD-PCR的因素进行了分析.     

甘、芥种间杂交后代DH株系K0959 PEG干旱

【目的】了解甘、芥种间杂交后代抗旱材料K0959在干旱胁迫处理下相关基因的表达情况。【方法】利用cDNA-AFLP技术,以经25% PEG-6000胁迫处理的K0959植株叶片为材料,比较其与非胁迫处理对照的基因表达差异。【结果】从128个引物组合中筛选出16个引物组合,可获得30余条差异片段;经二次扩增,可获得15个大小为102～384 bp、在胁迫中表达的差异片段。通过对片段的克隆测序、同源性比对,15个差异片段中,有7个片段与拟南芥的mRNA同源性较高,其中4个片段（2B, 2D, 3-2B和14B）为非重复的TDFs;1个片段（3D）与甘蓝的同源性较高,1个片段（2C）与甘蓝型油菜的mRNA同源性较高,而6个大小为102～240 bp的片段（D2-1、6A和9-2C等）在GenBank中与已知基因或序列无任何同源性,可能为尚未发现的新基因。其中6个已知功能的TDFs片段分别参与能量、新陈代谢、细胞运输途径以及细胞周期和DNA加工等过程。【结论】获得的差异表达基因对于了解甘、芥种间杂交后代油菜抗旱性形成的调控机制具有参考价值。     

花生种仁特异表达基因的初步筛选

应用抑制消减杂交技术,以花生种仁cDNA作为消减杂交的试验方(tester),以花生果皮cDNA作为驱动方(driver)进行消减杂交。经过两轮抑制PCR后,将第2次PCR产物与pGEM-TEasy载体相连,电击转化大肠杆菌,成功构建种仁特异表达cDNA文库。所长出菌落中91.2%为白色克隆,采用PCR法对阳性克隆进行鉴定,发现其中单一扩增条带的克隆约占86.5%,片段大小集中分布于200～800 bp之间。用花生种仁cDNA探针和果皮cDNA探针分别对文库高密度杂交点阵膜进行反向Northern杂交检测。根据杂交结果,初步从文库中挑取出254个差异点。花生种仁特异表达基因的初步筛选,为了解花生产量、品质形成相关的重要功能基因,也为将来应用植物基因工程手段改良花生产量和品质奠定基础。     

杨树幼茎特异表达基因及PsnLAC基因的克隆

利用cDNA-AFLP技术对小黑杨茎、叶基因的差异表达进行分析.结果表明,64对引物组合在茎和叶中共扩增出4 192条带,其中差异条带2 275条.通过对茎中特异表达基因的克隆和测序,获得了4条cDNA序列.经Blast-x比对分析表明,它们分别是类伸展蛋白、漆酶、过氧化物酶和细胞壁相关水解酶.进行RT-PCR分析发现...     

棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的克隆及特征分析

【目的】克隆棉花木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3全长cDNA序列,分析其在不同组织部位的表达情况并进行原核表达研究。【方法】根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的EST序列设计引物,采用RT-PCR技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定的氨基酸序列进行分析。采用半定量RT-PCR方法研究GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在不同组织中的表达。构建了基因的原核表达载体,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。【结果】从发育的棉花纤维中克隆了3个COMT基因cDNAs,GhCOMT1(GenBank登录号为FJ479708)、GhCOMT2(GenBank登录号为FJ479709)和GhCOMT3(GenBank登录号为FJ848869)分别具有1101bp、1098bp、1071bp的开放阅读框,各自编码366、365和356个氨基酸。GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在棉花各个组织中都有表达,GhCOMT1和GhCOMT2在根部的表达量最高,GhCOMT3在茎中表达量最高。SDS-PAGE电泳分析表明,3个蛋白的最佳诱导表达条件均为0.2mmol·L-1IPTG在37℃下诱导6h。【结论】从棉花中克隆了3个木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3,为进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。     

油菜矮化突变体茎段伸长初期茎尖差异表达基因的初步分析

采用抑制性消减杂交技术,以甘蓝型油菜矮化突变体"NDF-1" 及野生型"3529"为材料构建与植株高矮性状关系最为密切的茎尖差异表达抑制消减cDNA文库.所建cDNA文库插入片段大小主要集中在100～500 bp之间.斑点杂交筛选得到30个阳性克隆,序列测定和同源性对比分析表明,所得克隆功能涉及到第二信使、转录因子、激素代谢、蛋白质降解及转运等多个方面.并对其中几个差异表达基因的功能进行了初步分析,为进一步认识油菜植株矮化机理奠定了基础.     

A/J小鼠感染猪链球菌2型后脾脏消减cDNA文库的构建及相关差异基因表达分析

为了分离与猪链球菌2型感染密切相关的基因,利用抑制性消减杂交(SSH)技术构建了8周龄A/J小鼠感染猪链球菌2型后的脾脏消减cDNA文库,并对其中169个阳性克隆进行测序,去除冗余的cDNA序列载体并聚类拼接后共获得110条差异表达序列标签(EST)。利用GenBank的BLAST软件分析比较核酸和蛋白质同源性,发现共有36个基因与这些EST具有高度的同源性,它们分别参与细胞成分、免疫、信号转导、凋亡、转录等重要功能。这些差异表达基因主要有ATP/GTP结合蛋白1(Agtpbp1)、天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸盒多肽5、核蛋白p68、ATP-依赖RNA解旋酶、真核生物转录因子2亚基(Eif2s2)、Na+/K+-ATP酶转运β3多肽、溶菌酶1、溶菌酶2等基因。结论:这些差异表达基因在猪链球菌2型感染过程中可能发挥重要功能。     

超级杂交水稻两优培九光抑制差异表达基因的遗传来源

 利用改进的银染mRNA差异显示技术研究杂种超级杂交水稻两优培九及其母本培矮64S和父本9311在光抑制胁迫条件下基因表达的变化，共得到了杂种的167个差异表达基因片段。对这些差异片段进行分类和遗传来源分析表明，杂种光抑制差异表达基因多数为父母本所共有，是母本和父本共同遗传的结果。少数基因表现为母本或父本的单亲特异性，或无明显亲本来源，说明某种未知机制可能参与了光抑制相关基因从亲本到杂种的遗传过程。     

南疆扁桃品种自交不亲和S-Rnase基因型鉴定

[目的]鉴定南疆扁桃品种自交不亲和S-RNase基因型,可为科学合理地配置授粉品种提供依据,有效提高南疆扁桃的产量.[方法]以南疆10个扁桃品种的叶片为试材,利用蔷薇科通用引物PaConsⅡ-F+PaConsⅡ-R、EM - PC2consFD+ EM - PC3consRD对叶片基因组DNA进行S-RNase特异性扩增,将克隆测序结果在GenBank上进行同源性比对.[结果]显示10个扁桃品种均获得2条带,共20条带,包含16种不同的S基因核苷酸序列,其中4个为GenBank上登录的已知S -RNase基因序列,分别为S1(1 370 bp)、S12(2 479bp)、S14(740bp)、S52(1 626bp),12个为新的S-RNase基因序列,暂时分别命名为SA(780bp)、SB(530bp)、SC(1261 bp)、SD(432 bp)、SE(1266bp)、5F(270 bp)、SG(1263 bp)、SH(272 bp)、SI(690 bp)、SJ(1 523bp)、SK(755bp)、SL(1 486bp).[结论]鉴定出10个品种的S- RNase基因型.