牛Meg8基因5'末端的克隆及生物信息学分析

利用RACE方法从奶牛中克隆得到了Meg8基因的5 '端cDNA序列(GenBank登录号:HQ407410～HQ407413),序列比对发现该基因存在4种可变剪接体.选取牛Meg8基因的5'侧翼区作为研究对象,生物信息学在线分析发现:在人、绵羊、鼠、猪、狗和马这几个物种中,牛Meg8基因5'侧翼区与绵羊相似性最高,为80.45%;该区域内存在2个SINEs、1个Simple repeat,未发现CpG岛;可能存在2个启动子位点,位于牛Meg8基因的Exon1前3 402～4 118 bp和1 200～1 367 bp处,并富含Sp1、SRY、CdxA、GATA-1、MZF1等多个潜在的转录因子位点.Meg8基因5'侧翼区密集存在的转录因子可能与基因的转录起始有关.可变剪接体及侧翼区域的诸多转录因子可能是Meg8基因行使调控功能的原因,本研究结果将为阐明该基因的功能及其调控机理提供分子基础.     

德保矮马生长激素基因的克隆与序列分析

克隆和分析德保矮马的生长激素(GH)基因全序列.阳性重组质粒测序表明:德保矮马GH基因碱基序列全长1 922 bp(GenBank登录号为EU939447),包含完整的5个外显子和4个内含子.与纯血马比较,有19个碱基位点突变,其中11个位于外显子区域,有义突变4个,第924位碱基C→T致使第70位氨基酸由Thr→Ile,第1 249位碱基C→T使第112位氨基酸Pro→Leu,第1 287位碱基A→T使第125位氨基酸Ser→Cvs,第1 309位碱基A→C使第132位氨基酸Asp→Ala.以GH编码区构建物种的亲缘进化树,GH基因在进化中比较保守.     

草鱼C–反应蛋白基因上游调控序列的扩增与分析

C–反应蛋白(CRP)是一种急性时相血清蛋白,与鱼类的天然免疫和炎症反应有密切的关系。通过Genome Walker方法扩增草鱼CRP基因的上游序列,获得长度为1 055 bp的DNA片段,测序后经过PLACE和BDGP等启动子和转录因子结合位点预测软件的预测,初步鉴定草鱼CRP基因的复制起始子序列为保守的TCAGATC,G为转录起始位点。高度保守的RNA聚合酶II的结合位点TATAA–box位于–41～–35 bp,CAAT–box位于–94～–91 bp,在–54～–5 bp处存在1个高度保守的核心启动子序列。此外,还发现与转录诱导调控有关的转录因子结合位点,包括4个E–box元件、3个GT1共有序列、2个GT1核心序列和2个I–box核心序列。     

贵州矮马与伊犁马基因组的RAPD分析

应用RAPD技术对贵州矮马的遗传多样性进行研究,并与伊犁马进行比较.以120条RAPD引物对两个马品种的混合基因组DNA进行筛选,发现6条引物可产生多态性,并用其对84份样品进行扩增,共获得123条带,其中101条为多态性条带.研究结果表明,贵州矮马与伊犁马的Nei指数分别为0.3136和0.3098,两个品种间遗传分化系数为4.74％,说明贵州矮马的遗传变异较伊犁马小,贵州矮马与伊犁马品种间的基因交流很少;计算个体的遗传相似系数并建立了系统发育树,获得9个分支.其中3个分支中两种马的分布比例相近,其他分支由1个马品种独享占主导,第4、5、6支中两种马所占的比例相近,说明两个马品种拥有共同的祖先,在较早的时间分离后单独进化.     

斜纹夜蛾气味结合蛋白基因GOBP2转录调控区的克隆及活性分析

[目的]本文旨在鉴定重要农业害虫斜纹夜蛾(Spodoptera litura)气味结合蛋白基因GOBP2的顺式作用元件,为揭示GOBP2的转录调控机制和开发基于嗅觉干扰的害虫防治技术奠定基础。[方法]利用5′RACE技术克隆GOBP2的5′UTR,确定转录起始位点;利用染色体步移技术(chromosome walking)克隆GOBP2的5′侧翼区,并利用在线网站预测转录因子结合位点;利用PCR克隆GOBP2的5′侧翼区逐步缺失片段,并构建到pGL3-Basic载体上;将各重组载体分别转染Sf9细胞,48 h后收获细胞并利用双荧光素酶报告系统检测转录活性。[结果]获得斜纹夜蛾GOBP2长23 bp的5′UTR,由此确定GOBP2的转录起始位点。通过染色体步移获得斜纹夜蛾GOBP2的5′端调控区2 025 bp的序列,发现启动子的典型TATA框;针对-1 000 bp序列的转录活性分析表明,最强转录活性区域位于-243～-207 bp,具有1个增强子;此外,在-971～-891 bp及-890～-811 bp各有1个增强子,在-244～-315 bp存在1个沉默子。[结论]获得斜纹夜蛾GOBP2的转录起始位点及顺式作用元件,为进一步研究GOBP2的转录调控机制奠定了基础。     

中华蜜蜂气味受体AcerOr1基因启动子克隆及序列分析

为获取中华蜜蜂气味受体AcerOr1基因启动子并分析调控元件,以前期获得的中华蜜蜂AcerOr1基因的cDNA序列为模板,设计特异性引物并采用染色体步移的方法,从中华蜜蜂基因组中克隆到AcerOr1基因部分序列及其5'侧翼区,并分析其调控元件组成。生物信息学分析结果表明,克隆产物长1 831 bp,3′侧翼序列与Gen Bank中AcerOr1基因序列的5'端序列同源性为92%;在1 100～1 139 bp处存在基础启动子,其序列为:5′-ATTATATAAATATTGCTCGTGGCAAAATGATTCATAAGT-3′,转录起始位点可能位于翻译起始密码子ATG上游621 bp处的碱基T,其可能性为0.98。除含有基本启动子元件(TATA-Box、CAAT-Box等)外,还存在与胚胎发育或组织发育相关的元件CF2-Ⅱ、NIT2、CdxA和与环境应激相关的元件HSF,表明AcerOr1基因在中华蜜蜂体内的转录和表达可能受到胚胎、组织及外界环境的调控。     

福建黄兔INHBA基因5’端cDNA克隆及序列分析

为扩增福建黄兔INHBA基因5’端,根据GenBank上已公布的家兔序列KC831577,设计了2条巢式引物,利用5’ RACE技术克隆福建黄兔INHBA基因5’端序列,获得1个682bp片段,对该片段克隆测序,获得包括5’ UTR、第1外显子及部分第1内含子的片段。利用在线软件预测在-229~-180bp处存在可能的启动子,同时还发现9个潜在转录因子结合位点,其中包含对转录有重要调控作用的TATA-box位点。     

三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因5′侧翼序列的克隆与分析

根据三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)5′端序列设计特异引物,采用反向PCR技术从三角叶滨藜总DNA中扩增并克隆了该基因的5′侧翼区约855bp的片段。距起始密码子ATG77bp处的T碱基为可能的转录起始位点。在-25～-30bp、-260～-265bp、-337～-342bp以及-715～-720bp含有推测的TATA box(TATAAA),在-389～-393bp和-720～-724bp含有推测的CAAT box(CCAAT),以及在-112～-116bp和-397～-401bp含有推测的ABA作用元件CACGT。仅其-178～-1bp区与中亚滨藜BADH基因启动子区高度同源,同源性为90%。该BADH基因5′侧翼区与其它植物BADH基因的启动子区无同源性。     

驴生长激素基因的克隆与分析

 【目的】克隆驴生长激素基因DNA和cDNA的全序列,分析其序列和cDNA编码的蛋白序列特征及其在不同物种中的遗传差异。【方法】根据不同物种同一基因序列的同源性比对结果设计引物,应用RT-PCR和PCR 技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的DNA和cDNA及推定的氨基酸序列进行分析。【结果】从驴肝组织和血液中分别得到驴GH基因全序列1 928 bp和包括完整的编码区的cDNA序列706 bp,两者序列比对后证明驴GH基因DNA序列由5个外显子和4个内含子组成,编码216个氨基酸的GH前体蛋白,其中包括26个氨基酸的信号肽和190个氨基酸的成熟肽。序列比较结果表明,驴GH基因的序列与马同源性最高,启动子不是哺乳动物的典型TATA盒,而是CATA盒,该基因在进化过程中是保守的。【结论】从驴肝组织和血液中克隆了GH基因DNA和cDNA,DNA序列在1 267位的C→G可能影响到驴和马生长发育的差异,为下一步驴GH基因的表达调控、进化和多态性分析奠定了基础。     

鸭骨骼肌TNNI1基因CpG岛区甲基化与mRNA差异表达

本研究旨在通过克隆鸭慢速骨骼肌型肌钙蛋白I 1(Slow skeletal muscle troponin I 1,TNNI1)基因5'侧翼区序列,检测鸭骨骼肌组织TNNI1基因的mRNA表达水平和启动子CpG岛区甲基化状态,初步探索TNNI1基因转录调控机制。采用染色体步移方法克隆测序获得鸭TNNI1基因5'侧翼区序列,进行生物信息学分析,采用荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-PCR)检测鸭胸肌和腿肌TNNI1基因mRNA表达水平,采用亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)检测核心启动子区CpG岛在鸭肌肉组织中的甲基化水平。结果表明,克隆获得鸭TNNI1基因5'侧翼区序列2 078 bp,预测存在2个CpG岛,其中CpG岛(-2 032～-1 833 bp)位于预测的核心启动子区内,并存在多个真核生物结构元件和转录因子结合位点;甲基化检测发现,其总体甲基化水平在胸肌和腿肌组织中分别为52. 66%、57. 04%,差异不显著(P0. 05);荧光定量检测结果表明,鸭胸肌和腿肌TNNI1基因表达量差异显著(P0. 05);相关性分析结果表明,CpG4位点甲基化程度与胸肌TNNI1基因表达量呈极显著负相关(P0. 01)。鸭胸肌和腿肌TNNI1基因的mRNA表达量存在显著差异,其总体甲基化水平无显著差异。在胸肌中,启动子区CpG4位点可能通过甲基化修饰影响TNNI1基因的转录调控。     

贵州矮马、西南马和伊犁马刺豚鼠信号蛋白基因的多态性

为了探索贵州矮马、西南马、伊犁马刺豚鼠信号蛋白(Agouti signaling protein,ASIP)基因与马品种毛色之间的关系,采用缺口PCR技术分析了141份贵州矮马、西南马、伊犁马的ASIP基因型,并进行克隆测序。结果表明,扩增出的793 bp和385 bp 2个片段为ASIP基因,793 bp片段中缺失一段11 bp的核苷酸,定义为a基因型,385 bp片段结构完整,定义为A基因型;3个马群体中A等位基因在骝毛中占优势;但aa基因型对应的毛色只有小部分为黑毛,绝大部分为栗毛、骝毛和复色毛,与已知的aa基因型决定黑毛的规律不相符,说明aa基因型可能不是中国马品种黑毛的决定基因型。     

猪生长激素启动子的克隆及功能分析

[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1 821～+61 bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1 882 bp的片段,并构建了9个pGL3-mGH promoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110 bp以内,启动子区-218～-110 bp和-429～-218 bp间存在正向调控元件。     

两个西南马种GHR基因第10外显子SSCP分析

通过PCR-SSCP检测10匹宁强矮马和12匹贵州马GHR基因第10外显子的多态性分析,结果表明,宁强矮马和贵州马GHR基因外显子10的第2和第4区域的保守性较高,基因多样性相对较低,第1和第3区的遗传变异较大,基因多样性水平较高。分析比较发现宁强矮马GHR基因外显子10的多态性比贵州马稍高,首次表明宁强矮马在GHR10上存在较大的遗传多态性。     

猪生长激素启动子的克隆及功能分析(英文)

[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1821~+61bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1882bp的片段并构建了9个pGL3-mGHpromoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110bp以内,启动子区-218~-110bp和-429~-218bp间存在正向调控元件。     

山羊PRNP基因启动子转录活性研究

【目的】分析山羊PRNP基因启动子活性区域,旨在筛选调节朊蛋白表达水平的关键区域或转录因子,为阐明山羊PRNP基因的表达调控提供理论依据,并为从遗传学角度降低朊蛋白病的发生提供思路。【方法】以山羊PRNP基因序列（GenBank登录号：EU870890）为模板,设计特异性引物,扩增山羊PRNP基因5′侧翼区片段,并将扩增片段克隆至pEASY-T3载体,鉴定为阳性的克隆进行测序;利用生物信息学方法和在线工具进行启动子区域和转录因子结合位点的预测;利用缺失突变技术扩增启动子区不同长度的片段11个,并克隆至pEASY-T3载体后,鉴定为阳性的质粒和pGL3-Basic载体分别用限制性内切酶Mlu I和Bgl II进行酶切,并回收酶切产物;利用T4连接酶进行目的片段与pGL3-Basic连接,鉴定为阳性的荧光素酶报告基因重组质粒进行测序,并提取无内毒素质粒,用脂质体转染法瞬时转染至SH-SY5Y细胞,转染48h后,利用双荧光素酶检测试剂盒进行各缺失突变重组质粒在细胞内的启动活性检测。【结果】成功克隆了山羊PRNP基因5′侧翼区片段,长度为2 332 bp,且该片段含有预测的启动子活性区域、保守的motifs和多个转录因子的结合位点;成功克隆了11个含有不同长度启动子的片段,并与荧光素酶报告基因连接,并构建了目的片段与荧光素酶报告基因的重组质粒;转染时脂质体与DNA的比例为1﹕0.5,萤火虫荧光素酶载体与海肾荧光素酶比例为50﹕1;山羊PRNP基因5′侧翼区存在着核心启动子,启动子活性最强的区域为-519-+82 bp,且在-220-+59 bp这一区域存在着正调控元件,外显子1对启动子活性中起重要的调控作用;4个motifs可能为正调控元件结合位点;在强启动子活性区存在10个Sp1结合位点,2个AP-2 alpha结合位点和1个AP-1结合位点;山羊PRNP基因motif 3和motif 4分别预测为转录因子Foxp3和COE 1的结合位点。【结论】确定了山羊PRNP基因启动子的核心区域（-519-+82bp）,外显子1对启动子活性起重要的调控作用。     

荷斯坦奶牛乳腺LAP基因的克隆与序列分析

为了研究奶牛乳腺防御素基因的表达调控机制,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出LAP基因的核心片段序列,并与NCBI数据库序列比对同源性;进一步扩增其DNA序列中间片段;其后运用反向PCR技术并结合半巢式PCR技术扩增其侧翼的序列。结果表明:序列与NCBI数据库中序列同源性为100%,确认为LAP基因;DNA序列扩增得到1 760 bp的中间序列,并预测了其酶切位点;得到5’侧翼序列107 bp,3’侧翼序列87 bp,经预测发现有转录因子GATA。为进一步研究防御素的防御功能、寻找防御素基因体外表达调控机制以及利用基因工程防治奶牛乳腺炎积累了基本资料。     

5个鸭品种生长激素基因座位遗传多态性检测

应用PCR-SSCP技术首次分析5个品种鸭生长激素基因座位5'端调控区、外显子与部分内含子和3'端调控区中的多态位点,对具有多态性的位点进行测序,以探讨鸭生长激素基因遗传变异情况,比较不同品种该基因座位遗传多样性差异.结果在5个品种鸭中共检测到5个多态位点,多态位点频率在5个不同品种鸭中存在明显差异.序列比较分析结果表明:鸭生长激素基因座位5'端与3'端调控区和外显子序列具有极高的保守性,在5个鸭品种间不存在任何差异,所测出的序列与已知鸭GH序列相应部分完全一致.检测出的6处突变点(包括4个替换、1个插入和1个缺失)均位于内含子区域.推测鸭生长激素基因表达差异可能受内含子序列影响.     

木薯细胞壁酸性转化酶MeCWINCV5基因启动子的克隆和序列分析

[目的]了解MeCWINCV5在植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答中的功能.[方法]采用PCR方法从木薯基因组中分离MeCWINCV5基因启动子序列,考察MeCWINCV5对植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答的影响.[结果]分析显示启动子的长度为1170bp,合有TATA box和CAAT box等多个典型的真核生物启动子基本元件元件,还存在大量逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,如HSE、MBS、SARE、GARE-motif和TATC-box等多个与植物逆境胁迫相关的元件.[结论]MeCWINCV5基因启动子与逆境胁迫有关,在木薯抵御逆境胁迫的生理过程中具有重要作用.