兔出血症病毒JL株分离鉴定及VP60基因主要抗原表位分析

采用血凝试验、电镜观察、RT－PCR方法分离鉴定了1株JL株兔出血症病毒（RHDV）,扩增衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMDl8－T载体上,经酶切鉴定后测序。结果显示,VP60基因全长1740bp,编码580个氨基酸;JL株与其他RHDV分离株比较,核苷酸同源性为93．7％－99．2％,氨基酸同源性在97．3％－99．5％,在VP606个区中,A、B、D、F是稳定区,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区,表明毒株具有高度保守性;将JL株与国内外标准株蛋白氨基酸变畀及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行比较分析,预测RHDV VP60细胞表位。     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因克隆与序列分析

自感染RHDV致死的兔肝脏组织中提纯病毒，提取病毒总RNA，以RT－PCR方法扩增得到RHDV VP60基因全长片段，克隆到T载体中，经酶切分析及PCR鉴定后进行序列测定。同一毒株不同克隆产物进行3次测序，测序结果已输送到GeenBank中（注册号为AF453761）。将测得序列与GeneBank中记录的RHDV不同分离株进行比较。比较结果表明：各毒株间核苷酸的同源性为91％－98％，氨基酸同源性为94％－99％，氨基酸变异多发生在高变区，进一步证明了毒株的高度保守性，为明确我国RHDV地方株VP60蛋白的分子特征、分子诊断试剂及新型疫苗的研制奠定了基础。     

兔出血症病毒Yaan株衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR方法扩增兔出血症病毒（RHDV）Yaan株衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMD 18-T载体上,经酶切及PCR鉴定后测序.结果显示,VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸.将Yaan株与其他RHDV分离株进行比较,结果显示,核苷酸同源性为90.5%～97.5%,氨基酸同源性为94.3%～99.5%,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区,表明毒株具有高度保守性;同时对Yaan株与国外标准株AST/89的VP60蛋白氨基酸变异及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行了比较分析.     

兔出血症病毒RC株VP60基因扩增与序列分析

本实验应用RT—PCR方法从兔出血症病毒荣昌分离株（RHDV—RC）中扩增出衣壳蛋白VP60基因并测序,从GenBank下载已发表的16株RHDVVP60序列,运用生物信息学软件分析并构建系统进化树和氨基酸序列同源性表。结果表明。RC株的VP60基因大小为506bp,GC含量为56．35％．与其它16株RHDVVP60基因核苷酸序列的同源性较高,最高达98.2％;而氨基酸序列的同源性达80％左右。     

兔出血症病毒镇江株的分离鉴定及VP60蛋白活性表达

试验旨在分离兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)镇江株,分析其遗传进化变异,并表达具有良好活性的重组VP60蛋白。通过排除细菌感染、血凝(HA)和血凝抑制(HI)检测、动物攻毒试验与病毒传代、LD50测定等方法,自江苏省镇江市某兔场发病死亡动物肝脏组织样品中分离病原并鉴定;RT-PCR方法获得VP60基因,通过分析VP60基因核苷酸及氨基酸序列研究其遗传进化;将VP60基因与pCold-Sumo载体连接,构建低温诱导、融合Sumo标签原核表达载体,15℃、IPTG诱导表达重组VP60蛋白并对表达产物进行反应原性鉴定。结果显示,分离鉴定获得RHDV ZJ2015毒株,该毒株能凝集人"O"型红血球,HA效价为11log2,其血凝性能被RHDV(AV33)抗血清抑制,该毒株的LD50为10-6.38/mL,具有较强的毒力;RT-PCR扩增得到大小约为1 740bp的特异性条带,系统进化树分析显示,该毒株属于RHDV1抗原遗传变异株(RHDVa),与RHDV1和RHDV2VP60基因核苷酸序列同源性分别为89.4%～97.6%和81.1%～81.5%,氨基酸序列同源性分别为93.8%～98.3%和87.4%～87.6%。构建的低温原核融合表达质粒pCold-VP60在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功表达,通过SDS-PAGE及Western blotting分析,在分子质量74ku处有特异性表达蛋白条带,且与抗血清发生特异性抗原抗体结合反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。本研究为开展兔病毒性出血症流行病学研究、开发新型重组疫苗与诊断试剂提供参考依据。     

兔出血症病毒镇江株的分离鉴定及VP60蛋白活性表达

试验旨在分离兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）镇江株,分析其遗传进化变异,并表达具有良好活性的重组VP60蛋白。通过排除细菌感染、血凝（HA）和血凝抑制（HI）检测、动物攻毒试验与病毒传代、LD₅₀测定等方法,自江苏省镇江市某兔场发病死亡动物肝脏组织样品中分离病原并鉴定;RT-PCR方法获得VP60基因,通过分析VP60基因核苷酸及氨基酸序列研究其遗传进化;将VP60基因与pCold-Sumo载体连接,构建低温诱导、融合Sumo标签原核表达载体,15℃、IPTG诱导表达重组VP60蛋白并对表达产物进行反应原性鉴定。结果显示,分离鉴定获得RHDV ZJ2015毒株,该毒株能凝集人"O"型红血球,HA效价为11log2,其血凝性能被RHDV （AV33）抗血清抑制,该毒株的LD₅₀为10^-6.38/mL,具有较强的毒力;RT-PCR扩增得到大小约为1 740 bp的特异性条带,系统进化树分析显示,该毒株属于RHDV1抗原遗传变异株（RHDVa）,与RHDV1和RHDV2 VP60基因核苷酸序列同源性分别为89.4%~97.6%和81.1%~81.5%,氨基酸序列同源性分别为93.8%~98.3%和87.4%~87.6%。构建的低温原核融合表达质粒pCold-VP60在大肠杆菌Rosetta （DE3）中成功表达,通过SDS-PAGE及Western blotting分析,在分子质量74 ku处有特异性表达蛋白条带,且与抗血清发生特异性抗原抗体结合反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。本研究为开展兔病毒性出血症流行病学研究、开发新型重组疫苗与诊断试剂提供参考依据。     

RHDVCD株VP60主要抗原表位基因的克隆与序列分析

本实验用RHDVCD株人工感染家兔,发病死亡后,取肝脏匀浆,用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物,采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后,进行序列测定。测序结果表明,VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDVVP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示,CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97．5％,与其它毒株的同源性在92．0％～96．6％之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexi—co-89株同源性最高为99．4％,与其它毒株的同源性在96．6％N98-3％之间。     

RHDV CD株VP60主要抗原表位基因的克隆与序列分析

本实验用RHDV CD株人工感染家兔,发病死亡后,取肝脏匀浆,用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物,采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后,进行序列测定。测序结果表明,VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDV VP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示,CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97.5%,与其它毒株的同源性在92.0%～96.6%之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexi-co-89株同源性最高为99.4%,与其它毒株的同源性在96.6%～98.3%之间。     

兔病毒性出血症病毒YL株衣壳蛋白(VP60)基因的克隆和生物信息学分析

应用RT-PCR方法从兔出血症病毒（RHDV）西北分离株YL株中克隆出衣壳蛋白VP60基因并测序,YL株是中国西北地区首株被测序的RHDV,测序结果显示VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸,测序结果在GenBank中注册（登录号为DQ530363）。从GenBank下载全部已发表的40株RHDV序列,运用生物信息学软件分析,构建系统进化树和氨基酸序列同源性表,结果表明,世界不同地区RHDV分离株基因序列虽然非常保守,达到90%以上,但可以分为5个基因群,并且基因型和地域性没有必然联系,中国的分离株除了WX84株外,其它均处于第V基因群,该基因群内近年分离出的中国4个不同大地区（西北、华东、东北、西南）的RHDV毒株与NJ85株遗传距离很近,很可能都来自同一毒株NJ85。同时,对4个不同大地区的近年的4个代表性分离株的二级结构、抗原性进行了预测分析,结果显示二级结构有一定差异,但抗原性相同,这与RHDV只有一个血清型的看法相一致。     

禽脑脊髓炎病毒VR株衣壳蛋白基因的克隆及序列分析

用冻存的禽脑脊髓炎病毒Van Roekel(AEV VR)株通过SPF鸡胚传代复壮，获得了试验用病毒株样本。根据已知禽脑脊髓炎病毒1143(AEV 1143)株的衣壳蛋白VP0、VP3、VPl基因序列，设计了3对引物，分别扩增AEV VR株的VP0、VP3、VP1基因，将RT-PCR产物进行分子克隆和序列分析。结果表明，AEVVR株与AEV1143株VP0、VP3、VP1基因的核苷酸同源性分别为95．1％、93．6％和93．9％；氨基酸的同源性分别为97．57／6、97．5％和99．6％。     

伊维菌素耐药及敏感捻转血矛线虫国内分离株的鉴定

为解决国内开展驱虫药耐药性相关研究中虫种资源缺乏问题,该研究采用国际通用方法开展了华北地区捻转血矛线虫耐伊维菌素虫株的分离工作,并采用传统形态学方法对其进行鉴定。对来源不同的耐伊维菌素捻转血矛线虫虫株进行分离,结果显示：华北地区分离到了4株对伊维菌素6倍耐药及1株对其敏感的捻转血矛线虫。该研究将为国内开展捻转血矛线虫耐伊维菌素研究及新型驱虫药物的开发提供虫种资源。     

堆型艾美耳球虫早熟株与强毒株致病性和繁殖力的比较

为了比较堆型艾美耳球虫（E．acervulina）早熟株与强毒株的致病性和繁殖力情况,通过测定接种 E．acervulina 早熟株与强毒株后鸡只的精神状态、临床症状、增重、病变记分和卵囊产量,表明早熟株的排卵囊高峰出现在第5天,比强毒株提前1 d,早熟株的繁殖力是强毒株的85．8％;早熟株感染后对鸡只增重的影响较小,接种剂量在2．40×104个卵囊／羽之内时,相对增重率均大于90．0％,早熟株组鸡的肠道病变记分显著低于同剂量的强毒株组的肠道病变记分（P ＜0．05）。由此认为,该早熟株符合球虫早熟株的低致病性特性,可用于鸡球虫病早熟苗的制备。     

山羊痘病毒疫苗株与野毒株PCR-RFLP鉴别方法的建立及应用

为了建立区分疫苗株与广西分离株的检测方法,根据GenBank上的山羊痘病毒序列设计1对引物,用来扩增山羊痘病毒P32基因,通过对国内疫苗株及6株广西分离株的P32基因进行克隆、测序比较发现,所有广西分离株核苷酸651位的碱基全部由T变为C,647位~652位核苷酸构成由TGTATA变异为TGTACA,多了1个限制性内切酶Bsp1407Ⅰ位点,因此用特异性引物扩增出739 bp的目的片段后,再用限制性内切酶Bsp1407Ⅰ进行酶切分析,疫苗株可以切成135 bp和604 bp 3个片段,广西分离株可以切成135、226、378 bp 3个片段。结果表明,所建立的PCR-RFLP方法可以区分疫苗株和广西分离株。     

鸡传染性支气管炎病毒TJ9602、HN9604、BJ9601分离株特性的研究

从天津、河南、北京的鸡场分别分离到TJ9602、HN9604、BJ9601鸡传染性支气管炎病毒毒株,对其进行了动物回归、生物学特性、理化特性、血清学试验、抗原定位,对分离株的S1基因进行了RT-PCR扩增、核酸序列分析等研究.确定3株分离毒株为致肾病变的IBV,亲嗜器官为肾脏.HN9604和BJ9601与M41和H120均有较强的中和抗原交叉反应性,S1基因同源性分析,HN9604和BJ9601 S1基因与H120毒株的同源性最高,与H120毒株同属于A分支,均属于Ⅰ群.U9602与H120、M41等参考毒株的中和抗原交叉反应均较低,S1基因同源性分析,属于Ⅱ群.     

鸡马立克病病毒强毒与疫苗毒PCR鉴别检测方法的建立

在Ⅰ型马立克病病毒(MDV)基因组中针对132 bp串联重复序列的两侧合成一对引物,应用PCR技术对临床病例采集的疑似马立克病肿瘤病变鸡肝组织和1日龄接种CVI988弱毒疫苗的健康雏鸡羽髓样本进行检测。结果表明,从临床病例采集的10份肝脏组织,7份扩增出一条314 bp的条带,相当于2个拷贝数的132 bp串联重复序列;在接种疫苗健康雏鸡的羽髓样本中,扩增出与CVI988弱毒一致的PCR图谱,相当于6个~8个或更多拷贝数的132 bp串联重复序列。根据PCR图谱的差异即可鉴别MDV强毒株与CVI988疫苗弱毒株。     

鸡新城疫流行毒株与标准毒株的交叉免疫保护试验

用新城疫(ND)分离强毒油佐剂灭活苗和NDV La Sota油佐剂灭活苗分别免疫母源抗体平均为2 log2的12日龄公雏。免疫后每隔1周采集血清，用微量血凝抑制试验检测HI抗体。免疫后21 d抗体水平达到峰值，抗体水平在6log2以上，维持30 d以上。免疫40 d后，用ND分离强毒株和NDVF48E9分别进行攻毒试验，2种疫苗的保护率均为100％，攻毒结果表明，ND分离强毒株和NDVF48E9株的免疫原性差异不显著。     

脂肪型和瘦肉型北京鸭A-FABP基因组织表达特征

本实验旨在研究A-FABP基因在脂肪型和瘦肉型北京鸭不同组织的m RNA表达情况及在脂肪组织不同时期的m RNA表达差异。分别采集6周龄心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌胃、十二指肠、胸肌、腿肌组织样品,另外分别采集2、4、6、8周龄脂肪型和瘦肉型北京鸭的皮脂、腹脂样品,用荧光定量PCR方法检测该基因的m RNA表达情况。结果表明:鸭A-FABP基因主要在脂肪组织中表达,皮脂和腹脂中的表达量远远高于其他组织(P0.05),6周龄瘦肉型北京鸭A-FABP基因在不同组织中表达量顺序为皮脂腹脂肌胃十二指肠心脏腿肌胸肌脾肝肾,而脂肪型北京鸭顺序为皮脂、腹脂肌胃十二指肠心脏、腿肌胸肌、脾肝肾;且脂肪型北京鸭A-FABP基因在皮脂和腹脂中表达量显著低于瘦肉型北京鸭(P0.05);A-FABP基因在皮脂和腹脂中的表达量随着周龄的增加呈现增加的趋势。     

六安地区禽霍乱分离株与疫苗株抗原性的比较

六安地区是禽霍乱常发地区，生产上常出现禽霍乱疫苗免疫效果不理想的情况。通过菌体凝集试验、双向琼脂扩散试验和免疫保护试验比较临床分离到的禽多杀性巴氏杆菌与疫苗菌体的抗原性差异，发现两者的抗原性有明显不同，推测这是禽霍乱灭活疫苗在本地区使用效果不理想的主要原因之一。     

布鲁氏菌野毒株A544与疫苗株104M的差异蛋白筛选

为给布鲁氏菌病自然感染与疫苗免疫鉴别方法的建立提供参考,采用比较蛋白质组学研究技术,以野毒株A544和疫苗株104M的菌体蛋白为研究对象,以双向电泳技术为分离手段,以基质辅助激光解吸飞行时间质谱为检测手段,利用生物学信息解析所得实验结果。双向电泳结果分析显示,野毒株A544和疫苗株104M之间约有20个差异蛋白点,经质谱成功鉴定了9种蛋白。通过蛋白数据库检索发现,这些蛋白主要参与了一些代谢调节等生物过程,其中有6个蛋白点在野毒株A544上高表达,3个蛋白点在疫苗株104M上高表达。     

新城疫病毒SXFP株的分离鉴定

从陕西富平某种鸡场发病鸡群中分离出一株流行毒株,经HA—HI试验和动物回归试验,确定分离到的病毒为鸡新城疫病毒（NDV）,命名为SXFP株。经过测定。SXFP株鸡胚半数致死量（ELD50）为10^9.0／0．1mL;鸡胚最小致死量的平均致死时间（MDT）为52．3h,对1日龄SPF雏鸡脑内致病指数（ICPI）为1．92,提示SXFP株为强毒株。血清HI交叉反应试验显示SXFP株和La Sota株存在较小的抗原性差异。