兔出血症病毒的特性

从实验发病兔肝经过聚乙二醇葡聚糖硫酸钠(PEG-DS)二相分配法和蔗糖密度梯度离心提取和纯化兔出血症病毒。紫外测定呈典型的病毒紫外吸收曲线,260nm/280nm比值为1.33,1％的琼脂电泳检查呈一条带。负染电镜下观察,病毒无囊膜,二十面体立体对称,直径34—36nm,病毒子表面有直径5—6nm的壳粒32个。另外,电镜下还见到22nm左右的病毒颗粒。病毒在氯化铯中的浮密度为1.36—1.38g/cm~3,沉降系数为162S。琼脂糖电泳在pH8.3条件下,病毒子向阴极移动。     

兔出血症研究

一种新的病毒病-兔出血症（Rabbit Haemorrheagic Disease,RHD）已被确认,其病原-兔出血症病毒（RHDV）首次在中国得到鉴定,RHDV为二十面体的小病毒,直径32-34nm,无囊膜,浮密度1.36-1.38g/cm#+3,沉降系数162 S。核酸为ssDNA,线性,分子量2.4×10#+(6)d,碱基的mol%为C=23.7、G=20.5、T=31.9、A=24,G+Cmol%为44.2,含4条结构多肽,分子量为VP#-(1)58-60kd、VP#-(2)54.7kd、VP#-(3)51-53kd和VP#-(4)26kd,能凝集人红细胞,抵抗乙醚、氯仿,对pH3和50℃60分钟稳定,能形成核内包涵体。据此,该病毒似可归于细小病毒属,为该属的一个新的有特殊个性的成员。该病为一种急性烈性传染病,只侵害成年家兔,在易感兔中传播迅速,发病率和死亡率均极高,常引起毁灭性流行,人工接种多于24-72小时内死亡,以全身性出血和多发性血管内凝血为主要特征。临床诊断的流行病学特点为：急性猝死,肺严重出血,肝充血、出血和坏死。用肝、脾等匀浆或血清作血凝（ HA）和血凝抑制（HI）试验即可确诊该病。脏器甲醛灭活疫苗能在3-4天内控制该病流行,免疫血清效果亦佳。由于预防接种、正确诊断和综合防治措施的贯彻执行,该病在我国已基本得到控制。     

兔出血症的研究

从呼和浩特市郊区分离1株兔出血症病毒,命名NM株,对其进行了病毒理化、生物学特性检测,并研究了应用SPA协同凝集试验诊断兔出血症的方法。结果表明,病毒在兔体连续传6代,均出现典型症状及病理变化,是1株毒力稳定的强毒株,病毒粒子在电镜下呈球形,直径30.3nm,无囊膜,边缘有均匀排列的齿状突起,有实芯(占40.6％)和空芯(占59.4％)2种病毒粒子。还有少量形态不一、大小不等的类似病毒的粒子。用冷酚法提取的病毒核酸,经二苯胺显色及紫外扫描,证明为DNA。病毒的蔗糖浮密度为1.192g/ml,对氯仿、乙醚及胰蛋白酶不敏感,耐酸(pH5、pH3)耐热(50℃、56℃、60min)。病毒对人的各型红细胞有高度凝集性。经氯仿、乙醚、酸(pHs、pH3),热(50℃、56℃ 60min)处理后血凝价不降或稍降,经胰蛋白酶处理后血凝价明显降低(降5个滴度)。37℃放置4h,4℃冰箱放置48h血凝价不降,4℃放置4～13d降低一个滴度,15d降2个滴度。兔体血清HI抗体滴度与保护力呈正相关,1∶40以上可以完全抵抗强毒攻击。用内蒙古生物制药厂生产的兔出血症组织灭活苗免疫兔,可以抵抗强毒的攻击。采用原代乳兔肾细胞、Vero及BHK_(21)传代细胞,培养病毒均未成功。应用SPA协同凝集试验诊断兔出血症,特异性和可靠性均好,可作为本病的1种快速诊断方法。     

兔出血症病毒结构多肽的研究

纯化ＲＨＤＶ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,硝酸银染色显示８条多肽,分子量分别为８５．１,７１．２,６４．５,６１．４,５７．３,５４．０,２９．２,２８．１ｋＤ,免疫转印结果确认其中的６条多肽为病毒结构多肽,分子量分别为６４．５,６１．４,５７．３,５４．０,２９．２,２８．１ｋＤ且其相对百分含量分别为６５．８７,３．１７,３．９７,１０．３２,９．５２,７．１４％,表明分子量为６４．５ｋＤ的多态为病毒主要     

检测兔出血症病毒抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测兔出血症病毒(RHDV)抗体的间接ELISA方法,应用杆状病毒表达系统表达的RHDV VP60包被酶标板,经间接ELISA的最佳反应条件优化试验确定:抗原的包被浓度为4.62μg/ml,标准阴、阳性血清稀释度为1∶200,封闭液选用2%明胶;羊抗兔IgG最佳稀释度为1∶4 000。阻断试验、特异性试验、敏感性试验、重复性试验结果显示,该方法具有较高的特异性、敏感性和重复性。用建立的ELISA方法与血凝抑制试验对临床血清样品进行检测,结果显示,ELISA与HI检测兔血清的RHDV抗体阳性率分别为84.7%(955/1 127)和76.0%(857/1 127),符合率为91.3%。该方法的建立为检测RHDV抗体提供了一种安全、特异、敏感、快速、操作简便经济的检测方法,为兔出血症免疫监测和预防控制提供了科学的技术手段。     

兔出血症病毒感染性克隆的优化

为避免细胞外转录步骤,使RHDV感染性克隆的转录和病毒拯救过程一步化,试验通过PCR反应在RHDV cDNA序列的5′端添加T7启动子核心序列,3′端添加具有自身切割功能的核酶核心序列.然后,将RHDV基因组的不同cDNA片段装配到pTVT转录载体中,构建了含有RHDV全长cDNA序列的重组质粒pTVT-RHDV.在转染能稳定表达T7RNA聚合酶的BHK细胞后,将收获的细胞培养物感染MA104细胞.分别用逆转录PCR、间接免疫荧光检测以及一步生长曲线等方法对拯救病毒进行了鉴定.结果表明,试验成功拯救出了RHDV,优化了RHDV感染性克隆的构建过程.     

兔出血症病毒核酸的电镜图

病毒性出血症病兔肝悬液离心去杂后其上清用聚乙二醇浓缩,又经正丁醇-异戊醇除去杂蛋白,然后以差速离心和蔗糖梯度离心,提取兔出血症病毒(RHDV)。提纯的病毒用核酸酶降解污染的细胞核酸后,加入8mol/L尿素,使核酸从病毒粒子中释放出来,经水相法展开,附于有碳膜的铜网上。检样经醋酸铀染色和铂旋转喷涂投影,于透射电镜下观察。RHDV核酸呈线状,平均长度为1.92μm。经公式推算出分子量为2.30×10~6道尔顿(Dalton)。     

兔出血症病毒人工感染兔的病理学研究

采用兔出血症病毒贵州分离株人工感染家兔,观察其临床表现、病理形态学及病理组织学变化。结果,临床表现:体温升高、被毛蓬乱、抽搐、呼吸困难等症状;肝,心、脾、肾等实质性器官出血或淤血,其中肝和肾有部分坏死;组织病理变化表现:肝、肾等实质性器官充满红细胞、大量中性粒细胞和淋巴细胞。贵州毒株具有高致病潜力。     

等电聚焦分析兔出血症病毒多肽

人工感染ＮＪ株ＲＨＤＶ病毒死兔肝经低温反复冻融,氯仿处理,ＰＥＧ沉淀、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ柱层析得纯化病毒。纯化病毒经尿素－聚丙烯酰胺圆盘等电聚聚焦,考马斯亮蓝染色紫外扫描显示８条多肽,其等电点及相对百分含量分别为Ａ：６．３,１８,５１％;Ｂ＝６．７,１１．２２％;Ｃ：７．４％;Ｄ：７．７,８．５３％;Ｅ：８．１,７,２７％Ｆ：８．７,１２．４４％Ｇ：９．０。１６,１８％,Ｈ：９．５,２２．２     

兔出血症病毒形态学的研究

用氯仿抽提、PEG沉淀、Scpharosc 4B柱层析、超离及蔗糖密度梯度离心等方法纯化了兔出血症病毒。电镜下观察到兔出血症病毒粒子为无囊膜,大小为32～34nm。外观呈现独特的结构。正二十面体对称,髓蕊直径15～17nm,衣壳厚8～9nm。由内、外衣壳组成。外衣壳上按T=3排列着32个壳粒,壳粒呈中空的管状,长5～6nm,直径约4～5nm。中心孔径约2nm。有一环状呈不连续的内衣壳,厚2～3nm,内环上不连续每段约4nm,与壳粒相连。在5、3和2次轴对称时,病毒表面有大的、3个以上特征性的表面凹陷(Surfacc dcpression),这种表面凹陷呈一定的分布。呈五次轴对称时,病毒表周有10个向外管状突起。病毒表周不规则,表面含丰富的突起和大、小的凹陷(dcpression and small indentation)是兔出血症病毒形态学特点之一,其大小和形态,在动物病毒中比较类似于嵌杯样病毒。     

应用高效液相色谱分析兔出血症病毒核酸

本试验应用聚乙二醇(PEG)沉淀、有机溶剂抽提和差速离心等方法,提取和纯化兔出血症病毒。用核酸酶降解病毒子表面污染的核酸后,再抽提,得到病毒核酸,并经琼脂搪凝胶电泳-电洗纯化,得到高纯度的病毒核酸。应用高效液相色谱对提纯的病毒核酸分析结果表明,兔出血症病毒的核酸为ssDNA.它的碱基组成为:C23.7,G20.5,T31.9,A 24.0。它的G+Cmol％为44.2。     

实验性兔出血症超微结构研究

取实验感染发病的兔出血症病例和健康对照兔的肝、肾、脾、淋巴结和大脑皮层,以2.5％戊二醛—钺酸固定、常规超薄切片、染色、电镜观察。除见细胞病变外,在肝细胞、肾小管上皮细胞、网状细胞、淋巴细胞和神经细胞的胞核内,有时也在胞浆中发现有病毒粒子,后者呈类圆形,直径为26.7～31.1nm。观察表明,病毒粒子在胞核内生成并存在于核内,但随感染细胞病变加剧、核膜变性与破损,病毒粒子可从核内扩散到胞浆中。同时还在肝细胞核内发现病毒性包含物。     

兔出血症病毒套式PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的兔出血症病毒的VP60基因序列，设计了2对引物，建立了检测兔出血症病毒的套式PCR检测方法．先用外引物扩增一段389bp的DNA片断，继而用内引物以扩增产物为模板进行第2次扩增（即套式PCR），以提高结果的准确性，避免一次性PCR的假阳性结果．用该方法对12份RHD样本进行检测，检出率为100％．     

兔出血症病毒双夹心ELISA检测方法的建立

为建立特异性好、敏感度高、稳定可靠的检测兔出血症病毒的双夹心ELISA方法。该试验制备了兔出血症病毒多抗和小鼠腹水单抗,并将他们提纯。用方阵法筛选最佳反应浓度,用特异性试验、敏感度试验和重复性试验对该方法进行鉴定,并同时用双夹心ELISA和血凝试验(HA)对52份待测兔肝脏样品进行检测,比较这两种方法的符合率。结果显示...     

兔出血症诊断方法的比较研究

应用血凝和血凝抑制试验、SPA协同凝集试验、生物素——亲和素免疫酶组化技术,检查5例健康对照兔和25例实验感染RHDV的不同发病阶段病兔的肝脏,联系病理组织学变化,比较上述3种方法在诊断RHD中的可靠性与灵敏度。结果表明:SPA协同凝集试验、生物素——亲和素免疫酶组化技术,同血凝与血凝抑制试验一样,是诊断RHD的特异、灵敏的可靠方法。三种方法比较以生物素——亲和素免疫酶组化法最灵敏,其次是血凝和血凝抑制试验,SPA协同凝集试验居第3位,但从定性角度而言此方法与血凝试验无差别。而且特异、简便。