16SrRNA/rDNA序列分析在瘤胃微生物区系研究中的应用

随着rRNA为主的分子生物学技术在瘤胃微生态研究中的不断应用与发展,动物瘤胃内环境微生物区系研究进入了一个新阶段,为动物营养学研究技术的发展提供了新的可靠的方法和手段。笔者综述了rRNA／rDNA序列分析技术应用于瘤胃微生物区系研究中的理论依据,以及该项技术在瘤胃微生物区系分析中的应用现状和前景。     

荧光原位杂交技术在动物肠道微生物定量中的应用

以16S rRNA为靶序列的寡核苷酸探针荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)已广泛应用于分析环境中复杂的微生物群落构成。作者简要介绍了荧光原位杂交技术的原理和操作方法,对其在动物肠道中微生物鉴定和计数上的应用进行了概述,最后探讨了FISH技术的局限性及其应用前景。     

宏基因组DNA分析技术在传统发酵乳制品微生物多样性研究中的应用

本文对近几年广泛应用于传统发酵乳制品微生物多样性分析的宏基因组DNA分析技术进行了综述,尤其是对基于16S rRNA基因序列的分子标记技术,如:变性梯度凝胶电泳、限制性片段长度多态性分析、末端标记限制片段长度多态性分析、单链构象多态性等以及这些方法的研究进展.     

藏猪食草机理的研究——藏猪肠道微生物的多样性分析

采用PCR/DGGE技术和16S rDNA序列分析方法,对2种猪(普通猪、藏猪)肠道细菌优势菌群结构进行了比较分析.研究结果表明,从DGGE图谱中均可以发现2种猪肠道细菌具有一定的相似性,种内个体间相似性明显高于种间相似性.同时进行了部分优势细菌16S rDNA基因V6～V8区序列的系统发育分析发现,DGGE图谱中优势条带的16S rDNA基因序列中有7条克隆的序列与基因库最相似菌的相似性大于97％,其余的克隆序列相似性在90％～96％,其中有1条序列被鉴定为与纤维素分解菌产琥珀酸厌氧螺菌相似.本试验分析结果可为进一步研究藏猪及其肠道微生物的特性及其食草机理提供依据.     

赣南地区柑橘黄龙病菌遗传多样性分析

为探究赣南地区柑橘黄龙病菌的遗传多样性。从赣南16个县市区采集32个具典型柑橘黄龙病症状的脐橙样品,运用PCR-RFLP(聚合酶链式反应-限制性长度多态性分析)技术研究了柑橘黄龙病菌16S rDNA序列、16S/23S rDNA间隔区序列和核糖体蛋白基因的遗传多态性;并对三个基因片段进行测序,分析其序列的碱基含量、转换与颠换、同源性、核苷酸遗传距离和系统进化特征。RFLP结果表明：赣南16个县市区柑橘黄龙病菌XbaⅠ酶切图谱均与亚洲韧皮部杆菌（Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas）的一致;进一步分析显示,三个基因片段各自之间的RFLP指纹图谱一致,并未表现多态性。序列分析结果表明：32个分离物三个基因片段各自的同源性均在98%~100%,与CLas的同源性最大,且与CLas的遗传距离最小。系统进化树展示赣南地区柑橘黄龙病菌与CLas处于同一分支,结合酶切图谱、序列同源性及系统进化分析结果表明： 赣南地区柑橘黄龙病菌均为CLas。结论：赣南地区柑橘黄龙病菌的16S rDNA序列、16S/23S rDNA间隔区序列和核糖体蛋白基因未表现遗传多样性,表明赣南地区柑橘黄龙病菌间遗传多样性不显著。 关键词：柑橘黄龙病;16S rDNA序列;核糖体蛋白基因;16S/23S rDNA间隔区;RFLP;序列分析     

利用PCR-DGGE技术分析桑天牛成虫肠道细菌菌群

利用PCR-DGGE技术分析桑天牛成虫肠道菌群结构及优势菌群,获取桑天牛肠道微生物的多样性信息。从桑天牛成虫肠道中提取细菌基因组DNA,以细菌16S rDNA基因通用引物27F/1495R和27F/519r+GC进行V3可变区PCR扩增,将长约500 bp的扩增产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离后,进行优势条带分析、DNA回收、克隆、测序等,初步得到分别属于肠杆菌属(Enterobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、志贺菌属(Citrobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸菌属(Shigella)、泛菌属(Pantoea)和沙雷氏菌属(Serratia)的8个细菌菌株,其中优势细菌为克雷伯氏菌属的细菌菌株,其次是沙雷氏菌属的细菌菌株。将获取的细菌16S rDNA序列在GenBank数据库中进行BLAST比对分析,相似度在97%以上的有6个菌株,其中有5个菌株与传统方法分离菌株的鉴定结果一致,表明基于16S rDNA的PCR-DGGE技术可用于桑天牛肠道菌群多样性研究。     

瘤胃微生物生态研究方法评述

瘤胃微生物生态研究方法主要经历了微生物纯培养、混合培养、微生物分子生物学技术[(从瘤胃中提取DNA,进行PCR-16S rDNA(rRNA)技术]、变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术),在不同程度上揭示了瘤胃微生物群落丰富的多样性和生态功能.但由于各种方法本身的局限性,限制了人类对瘤胃微生物的全面了解,现代生物技术和传统微生物研究方法的配合将为瘤胃微生物生态研究提供较好的前景.     

基于16S/18S rRNA/rDNA的分子技术在定量瘤胃微生物中的研究进展

瘤胃微生物是反刍动物与日粮间的纽带。用传统或经典的亨氏滚管法和最大似然法测定瘤胃内微生物总数的结果可能偏低。采用培养方法培养的已知菌种可能不完全适合或进入了未培养状态。由于缺少可行的方法,未知菌种从未培养过。由于任何一个细胞都含核糖体,rRNA/rDNA有进化守恒的特性,建立在16S/18S rRNA/rDNA的现代分子技术在不需要培养微生物的条件下,不仅能用于描述分子特性,而且能检测数量和提供用于预测自然进化关系的分类方法。基于不同的16S/18S rRNA/rDNA的守恒区能设计出通用、属、种甚至株特异性探针或引物,通过分子杂交能检测、量化细胞含量和测定细胞活性。杂交可得到某个序列或微生物的相对或绝对量。然而,杂交的灵敏度较低,它仅能检测出超过106个细菌/m l瘤胃液。竞争PCR和实时PCR已开发并用于检测瘤胃微生物,其灵敏度达到检测单个细菌。16S/18S rRNA/rDNA方法已成功用于瘤胃环境研究而且很快获得认可。但是基于16S/18S rRNA/rDNA的现代分子技术不能排斥经典传统微生物方法,但它将成为一项便利技术用于瘤胃微生物研究。     

仔猪12种致病菌的16 S rRNA分析

研究仔猪12种致病菌的16 S rRNA基因序列,分析其亲缘关系,为设计其16 S rRNA基因的诊断探针提供理论依据.从美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因库中下载332条仔猪12种致病菌的16S rRNA基因序列,应用双序列比对和构建系统进化树的方法对这些序列进行种内分析,选出每种细菌的代表序列,再对代表序列用同法进行种间分析,并将种间分类结果与伯杰氏细菌分类手册(第8版)的分类结果进行比较.从每种细菌的数据库中选出一条接近16 S rRNA基因序列全长,与同种其他序列的核苷酸替代率差异较小的序列为该种细菌的代表序列,进行种间16 S rRNA基因序列系统进化分析,结果与伯杰氏细菌分类手册(第8版)的分类基本一致.该16 S rRNA基因的系统进化分析所提供的信息将用于下一步针对这12种致病菌的16 S rRNA基因诊断探针的设计.     

基于16S rRNA高通量测序技术分析中国西门塔尔牛瘤胃微生物多样性和功能预测的研究

为系统探讨中国西门塔尔牛瘤胃内的微生物多样性及其功能,本试验利用16S rRNA基因高通量测序技术检测分析西门塔尔牛(20月龄,平均体重约为550 kg)瘤胃液样本菌群结构并进行PICRUSt功能预测。结果显示,两组样本通过Illumina Miseq测序平台共获得66 712条优质序列,聚类分析得到1 797个操作分类单元(OTU),经分类学鉴定分属13个门20个纲22个目33个科及59个属;厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势菌群,所占比例分别为62.46%和22.45%;基于属的组成,依次为粪杆菌真核菌群([Eubacterium]_coprostanoligenes_group,9.16%)、瘤胃球菌属_2 (Ruminococcus_2,7.90%)、未知属f型拟杆菌目RF16菌群(norank_f__Bacteroidales_RF16_group,6.23%)、未知属f型瘤胃菌科(norank_f__Ruminococcaceae,4.79%)、理研菌科_RC9菌群(Rikenellaceae_RC9_gut_group,4.72%)、未知属f型拟杆菌目BS11菌群(norank_f_Bacteroidales_BS11_gut_group,4.49%)、瘤胃球菌属_1(Ruminococcus_1,4.43%)等;16S rRNA基因组的PICRUSt功能预测发现,瘤胃菌群功能主要集中在碳水化合物转运及代谢上,可能含有大量的纤维素和木质素降解酶基因。综上,基于16S rRNA基因的高通量测序技术全面揭示了西门塔尔牛瘤胃菌群的多样性,并预测其含有丰富的蛋白质分解、木质纤维素降解酶系,为探索西门塔尔牛瘤胃微生物奠定基础,也为进一步挖掘与某些重要营养生理功能密切相关的瘤胃微生物功能基因提供参考。     

基于16S rRNA高通量测序技术分析草原红牛瘤胃微生物多样性和功能预测的研究

为系统探讨草原红牛瘤胃内的微生物多样性及其功能,本试验利用16S rRNA基因高通量测序技术检测分析草原红牛(20月龄左右,均重为577.5 kg)瘤胃液样本菌群结构并进行PICRUSt功能预测。结果显示:通过Illumina Miseq测序平台共获得35 848条优质序列,聚类分析得到387个操作分类单元(OTU),经分类学鉴定分属15个门、20个纲、25个目、41个科及110个属;厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势菌群,所占比例分别为50.09%和41.11%;基于属的组成,依次为普雷沃菌属(Prevotella)15.20%、未知属f型拟杆菌目(norankfBacteroidales)BS11菌群8.66%、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)NK4A214菌群6.96%、理研菌科(Rikenellaceae)RC9菌群5.56%、未知属(Christensenellaceae)R-7菌群4.01%、瘤胃球菌属2(Ruminococcus2)3.33%等;16S rRNA基因组的PICRUSt功能预测结果显示,瘤胃内菌群功能主要集中在碳水化合物转运及代谢,表面草原红牛体内含有大量的纤维素和木质素降解酶基因。综上,基于16S rRNA基因的高通量测序技术全面揭示了草原红牛瘤胃菌群的多样性,且预测其含有丰富的蛋白质分解、木质纤维素降解酶系,为探索草原红牛瘤胃微生物的认知提供了基础,也为挖掘其他重要营养生理功能相关的瘤胃微生物功能基因提供了参考。     

16SrRNA指纹分析技术在瘤胃微生物研究中的应用

随着试验生物学和生物信息学的快速发展,对瘤胃微生物的多样性开展了系统的研究.利用传统的方法很难鉴别瘤胃微生物的差异,基于16SrRNA的指纹分析技术就很好地解决了该问题.该技术具有可靠性强和方便快捷等优点,可应用于瘤胃微生物群落多样性分析.     

冬夏季长白猪精液中细菌多样性与精子质量特性关联分析

为探究冬夏季长白猪精液中细菌多样性变化和精子质量特性之间的相关性,利用16S rRNA基因高通量测序技术得到冬夏季长白猪精液中微生物的特征序列(ASV),计算机辅助精子分析系统(CASA)分析冬夏季精子活力参数指标的变化.结果 显示:长白猪精液中细菌多样性在冬夏季之间差异显著(P＜0.05),门水平冬季优势菌群为厚壁菌...     

DGGE技术的原理及其在动物胃肠道微生态系统研究中的应用

利用传统的培养方法很难将动物胃肠道的所有菌群进行培养,因此也很难鉴别各个时期动物胃肠道微生物之间的差异。变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术可以避免传统方法的弊端,进而可以进一步确定动物胃肠道微生态系统的差别以及菌群的多样性。主要综述了DGGE技术的原理﹑优缺点以及在动物胃肠道微生态系统研究中的应用和前景。     

苜蓿细菌性萎蔫病菌16S rDNA片段的克隆及序列分析(简报)

利用细菌16S rDNA保守序列通用引物对16sF/16sR对苜蓿细菌性萎蔫病菌的标准菌株(IPQ0019)总DNA进行扩增,得到了大约1.5 kb的片段。将此片段插入到pGEM-T载体并转化进大肠杆菌DH5α菌株中,经PCR鉴定、限制性内切酶分析及核苷酸序列同源性分析均表明克隆成功。该研究为制备苜蓿细菌性萎蔫病菌的DNA分子探针奠定了基础。     

分子生物学技术在瘤胃细菌多样性研究中的应用

反刍动物的瘤胃是一个复杂的厌氧微生态发酵系统,研究其瘤胃微生物区系组成与功能已成为反刍动物营养学的重要内容,分子生物学技术是开展瘤胃微生物研究的重要技术手段。本文就变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术、16S r DNA序列分析、宏基因组技术、DNA芯片技术等在瘤胃细菌多样性研究中的应用情况进行了总结与归纳,为今后开展此方面研究工作提供技术参考。     

微生物菌群培养组学在动物医学中的应用

实验室条件下可培养的微生物约占自然界中微生物总数的1%，这限制了人们对99%未知微生物的认识和利用，而研究表明，那些“不可培养的微生物”是可以被开发和利用的，未能被纯培养的微生物才是未知微生物的主体。微生物培养组学探索利用多种培养条件和长时间的培养，结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）和16S核糖体RNA（rRNA）测序可以大规模鉴定各种微生物，同时利用全基因组测序和宏基因组测序手段对未知微生物进行深入分析。本文综述了国内外近年来微生物菌群培养组学在反刍动物胃肠道、禽类盲肠及家畜鼻腔微生物菌群研究中的最新进展，探讨将动物体内菌群培养组学方法应用于动物疾病防治领域的可行性。作为一个新兴的研究方法，尽管该培养组学还存在一些不够成熟的方面，但它的发展前景十分广阔，微生物菌群培养组学方法和其他研究方法的互补已经逐渐成为发展兽医微生物学新的突破口。     

利用16S rRNA全长序列鉴定植物乳杆菌

从标明含有嗜酸乳杆菌的活菌胶囊中分离到一株乳杆菌Lal菌株，利用16S rRNA全序列分析法和传统分类法对Lal菌株进行分类鉴定表明：Lal菌株属于植物乳杆菌种新株系，该菌株现在已经被中国科学院北京微生物所菌种保藏中心收录保存，编号为ASl．2986。     

全自动微生物分析系统和16S rDNA序列分析技术对奶牛乳腺炎病原菌的鉴定

从四川成都、绵阳和眉山地区部分奶牛场共分离奶牛乳腺炎病原菌120株,采用VITEK全自动微生物分析系统和16S rDNA序列分析技术对分离菌株进行鉴定。研究发现引起四川成都、绵阳和眉山奶牛乳腺炎以细菌混合感染为主,主要致病菌有葡萄球菌、大肠杆菌、单胞菌属、鲁氏不动杆菌、吉氏库特氏菌和芽孢杆菌属。其中,葡萄球菌的感染最为普遍,检出率最高(33株,27.50%);其次为大肠杆菌(17株,14.17%)、单胞菌属(12株,10%)、鲁氏不动杆菌(11株,9.17%)、吉氏库特氏菌(9株,7.50%)和芽孢杆菌属(9株,7.50%);再次为巨型球菌(6株,5%)、阴沟肠杆菌(6株,5.00%)、产吲哚金黄杆菌(6株,5.00%)和链球菌属(4株,3.33%);最低的是棒杆菌属(3株,2.50%)、粪肠球菌(2株,1.67%)、弗氏志贺菌(1株,0.83%)和普通变形杆菌(1株,0.83%)。本研究为防治奶牛乳腺炎奠定了基础。     

家兔胚胎胃肠道细菌分离及16S rRNA基因序列分析

为研究家兔胚胎胃肠道细菌菌群的种类,对常规饲养、正常妊娠的家兔胚胎后期胃肠道细菌进行分离,基于分离细菌的生理生化特性、16S rRNA基因序列的同源性比较及系统发育分析,初步确定家兔胚胎后期胃肠道中存在的微生物菌群有微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、棒杆菌属(Corynebacterium)以及蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)等细菌,其序列同源性均为97%～99%。分离细菌均为G+细菌,家兔胚胎胃肠道中细菌的平均数量达到0.8×102cfu/g～1.2×102cfu/g,本研究为哺乳动物胚胎时期存在于胃肠道中细菌的深入研究奠定了基础。