大肠杆菌中dctA基因敲除及其苹果酸摄取功能鉴定

大肠杆菌(Escherichia coli)K12基因组中,仅dctA基因编码1个在有氧条件下负责摄取四碳-二羧酸的转运蛋白。为鉴定Dct A能否摄取四碳-2-羟基羧酸(如苹果酸),首先以p KD3为模版PCR扩增含有氯霉素抗性dctA基因同源臂,电转入E.coli K12/p KD46感受态细胞,筛选具有氯霉素抗性的基因敲除突变株E.coliΔdctA/p KD46。通过消除质粒p KD46构建大肠杆菌dctA基因敲除突变株E.coliΔdctA。构建dctA基因表达载体p Easy T3-dctA。通过苹果酸摄取功能互补试验,证实基因敲除菌株E.coliΔdctA丧失摄取苹果酸功能,四碳-二羧酸摄取蛋白Dct A具有摄取苹果酸功能。研究首次报道Dct A具有摄取苹果酸功能,该基因敲除突变株的构建可为其他菌株来源2-HCT转运蛋白的基因克隆与功能分析奠定基础。     

In Vitro Assessment of Probiotic Potential of Lactobacillus acidophilus and Antagonistic Activity Against Escherichia coli O157:H7

The antagonistic activity of Lactobacillus acidophilus KLDS1.0901, KLDS1.0902, KLDS1.1003 and NCFM against Escherichia coli O157: H7 were investigated in this study. The culture supernatants of all the L. acidophilus stains showed high bacteriostatic activities against E. coli O157: H7 and the bacteriostatic substances of their Cell-Free Supernatants (CFS) were preliminarily determined from organic acids. The bacteriostatic activity from CFS or viable L. acidophilus against E. coli O157: H7 was also assessed by using co-incubation methods, CFS had high bactericidal activity against E. coli O157: H7, no viable E. coli O157: H7 was detected when 5×107 cfu of E. coli O157: H7 was added to 5 mL of CFS and incubated at 37℃ for 2 h. However, L. acidophilus themselves had no bacteriostatic activity after directly contacted with E. coli O157: H7. The inhibition E. coli O157: H7 adhesion and colonization of L. acidophilus were also investigated based on competition, exclusion and displacement assays. L. acidophilus KLDS1.0901, KLDS1.1003 and NCFM strains were effective to displace E. coli O157: H7 from a Caco-2 cell layer in competition and exclusion assays. However, in displacement assay, all of the strains showed no significant antagonistic activities. Meanwhile, the probiotic potential of L. acidophilus strains was investigated based on adhesion assay to Caco-2 cells and anti-inflammatory effects by IL-8 produced in Caco-2 cells. The adhesion ability and anti-inflammatory effects of L. acidophilus strains showed a strain-dependent manner. In general,L. acidophilus KLDS1.0901 and NCFM showed better probiotic potential than KLDS1.0902 and KLDS1.1003. Thus, the use of L. acidophilus KLDS1.0901 and NCFM to prevent or treat of diseases associated induced E. coli O157: H7 in vivo was suggested.     

顺丁烯二酸-单酰丙酮酸及反丁烯二酸-单酰丙酮酸的制备

来自肺炎克氏杆菌M5a1菌株的龙胆酸1,2-双加氧酶(GDO,EC1.14.13),能够催化龙胆酸产生顺丁烯二酸-单酰丙酮酸(MP).利用龙胆酸1,2-双加氧酶基因工程菌以及MP被酸化时会转化成反丁烯二酸-单酰丙酮酸的特性小量制备了纯度分别为97.7%以及96.4%的顺丁烯二酸-单酰丙酮酸和反丁烯二酸-单酰丙酮酸,为该化合物的制备提供了一条具有一定可行性的生产途径.     

气管滴注大肠杆菌对肉仔鸡肝脏抗氧化能力的影响

为研究呼吸道大肠杆菌对肉仔鸡肝脏抗氧化能力的影响,选取24只初始体质量相近、健康状况良好的固始肉仔鸡,随机分为2组,对照组肉仔鸡气管滴注1 m L无菌培养液,大肠杆菌组肉仔鸡气管滴注1 m L大肠杆菌培养液(1×10~9cfu/m L)。滴注后2 h采集血液和肝脏组织,测定血清中细菌脂多糖(LPS)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量,以及肝脏组织中丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果表明,气管滴注大肠杆菌后2 h,大肠杆菌组肉仔鸡血清中LPS含量为33.86 U/mg,较对照组升高了26.15%;AST和ALT含量较对照组分别增加了50.89%(P0.05)和298.77%(P0.01);大肠杆菌组肉仔鸡肝脏组织中SOD活性和GSH-PX活性分别为186.60 U/mg和13.20 U/mg,较对照组分别降低了43.83%(P0.01)和31.18%(P0.05);MDA含量增加了51.72%(P0.05)。综上,气管滴注大肠杆菌后2 h,大肠杆菌大量繁殖,释放出的LPS通过血液循环进入肝脏,肝脏中抗氧化酶活性降低,引起脂质过氧化物堆积,破坏肝脏细胞,导致血清中转氨酶水平升高。     

取代苯氧乙酸类化合物的超声合成及抑菌活性研究

采用超声波法在碱性条件下用取代苯酚与氯乙酸合成取代苯氧乙酸,并测试其抑菌活性．共合成了3个取代苯氧乙酸衍生物,即对氯苯氧乙酸,邻氯苯氧乙酸,对溴苯氧乙酸,用IR,^1 H NMR,UV及元素分析确证了其结构．同时选取大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌等四种细菌对所合成的取代苯氧乙酸类化合物测试其最小抑菌浓度（MIC）．抑茵活性表明：对氯苯氧乙酸和对溴苯氧乙酸的抑菌谱较广,而邻氯苯氧乙酸的抑菌谱较窄．     

大肠杆菌对黄粉虫不同虫态诱导动力学的研究

通过对黄粉就同虫态衣导动力学的研究,结果表明：用大砀杆菌对黄粉 同虫态进行诱导,均能诱导其产生抗菌物质,成虫、蚴、幼虫诱导剂量阈值依次为每虫体１０＾３、１０＾４、１０＾２菌体;每虫体用１０＾６菌体对不同虫态诱导后,抑菌活力时显上升的时间分别为７、１０、７ｈ菌体;每虫体用１０＾左右：ＰＡＧＥ（ＰＨ４．５）研究表明,不同虫态诱导产生及增强表达成分存在差异。     

鹌鹑大肠杆菌与沙门氏菌混合感染的病原分离与鉴定

通过对病鹌鹑的肝脏和脾脏中分离到的细菌，进行培养、生化鉴定及动物接种试验，确诊为大肠杆菌和沙门氏菌混合感染，在不同禽舍中采取的三处水样中，同样分离出了上述两种细菌，分离的6株大杆菌血清型鉴定结果Y2，Y6，Y8为O1；Y3，Y7，Y9为O22，并且均产生肠毒素，药敏试验结果从脏器中分离细菌对庆大霉素、卡那霉素、新霉素高度敏感；水样中分离的细菌对氯霉素高度敏感。     

人源中心体新基因E9730在大肠杆菌中的表达及其多克隆抗体的制备

E9730是从人胎肝cDNA文库中分离出来的一个中心体新基因,其在mRNA水平上经5’端选择性剪 切为两个剪切体E9730—A和E9730—B,它们分别编码99个和142个氨基酸残基的多肽链。试验成功实现了 E9730-A和E9730—B在大肠杆菌JM109中的高效表达,并制备了相应的多克隆抗体,后经Western blot检测 具有良好的特异性。     

枯草芽胞杆菌TR21喷叶对粉蕉根系分泌酚酸的影响

为探索枯草芽胞杆菌TR21喷叶对广粉1号和粉杂1号粉蕉根系酚酸分泌的影响,测定了不同处理不同时间根系分泌物中的酚酸含量,并利用高效液相色谱测定第13天的根系分泌物中的酚酸组成,以及甲醇溶解物对香蕉枯萎病病原菌1号和4号生理小种孢子萌发的影响。结果显示,广粉1号TR21处理后4d和6d根系酚酸分泌量高于对照,处理后8、9、11、13d低于对照;TR21处理粉杂1号根系酚酸分泌量始终高于对照。广粉1号对照根系处理后13d分泌物中检测到阿魏酸、反式肉桂酸、芥子酸、对香豆酸、水杨酸和邻苯二甲酸,TR21处理仅检测到阿魏酸和反式肉桂酸;粉杂1号对照和TR21处理后13d的根系分泌物只检测到阿魏酸。不同处理的甲醇溶解酚酸显著抑制香蕉枯萎病1号生理小种小型分生孢子萌发,粉杂1号的抑制效果比广粉1号明显,TR21处理的粉杂1号抑制效果最显著。甲醇溶解酚酸对4号生理小种的分生孢子也有显著抑制作用,但不同处理间差异不显著。TR21喷叶可以改变粉蕉根系酚酸的分泌,但在抗感品种中引起的变化存在差异。     

一株孔雀源大肠杆菌分离鉴定与致病特性初步研究

无菌采取病死孔雀肝脏,进行病原菌的分离、鉴定、生化试验、毒力基因检测、动物毒力试验。结果表明：致病菌为大肠杆菌,至少携带有papC、iucD、tsh、irp2、iss5种毒力基因,具有高致病性,并且该菌对小白鼠和鸡有较强的致死性。     

抗鸡致病性大肠杆菌中药的筛选及其疗效观察

1材料与方法 1．1材料 1．1．1供试动物。1日龄雏鸡,常规雏鸡饲料隔离平面笼养至7日龄（鸡苗和饲料皆购自河北北方学院实验牧场）。     

不同烟草品种烟籽油理化性质及脂肪酸和挥发性成分评价

本研究采用索氏提取法提取8个烟草品种的烟籽油,进行理化性质分析,并用气相色谱（GC）、气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分别测定烟籽油的脂肪酸组成和挥发性成分。结果表明,除皂化值和折光率外,8种烟籽油在酸价、比重、过氧化值及碘值中均差异显著,红大和NC89两个品种的酸价最低,保山4号的过氧化值最低,NC89的碘值最高,大竖把直把品种的比重最大,8个品种烟籽油的皂化值范围为176.13~190.81 mg·g^-1、折光率约为1.470,综合理化性质数据,品质较好的是Burley21,它的酸价、皂化值、比重、过氧化值、碘值及折光率分别是0.75 mg·g^-1、185.04 mg·g^-1、0.84 g·cm^-3、1.17%、1520.5 g·kg^-1及1.467 81。8个烟籽油品种的多不饱和脂肪酸含量均较高（785.99~965.99 mg·g^-1）,多不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸（PUFA/SFA）值在5.61~6.60,亚油酸在8个品种测得的所有脂肪酸中均含量最高（772.41~944.20 mg·g^-1）。在8个品种的烟籽油中检测出棕榈酸甲酯、棕榈酸、亚油酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸、己内酰胺和2,2'-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)7种挥发性物质,其中亚油酸含量最高,与脂肪酸含量测定结果具有一致性。比较脂肪酸及挥发性物质结果,云雪2号及Burley21两个品种较好。综合理化性质、脂肪酸与挥发性物质结果,Burley21是较为理想的烟籽油原料。     

越冬暂养对雌性中华绒螯蟹的营养品质及风味的影响

为探究越冬暂养后雌性中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis,以下简称河蟹)是否存在营养流失或风味品质下降现象,该研究利用嵌入在池塘循环水养殖系统中的网箱对雌性河蟹进行105天暂养,分析了暂养前后河蟹一般生物学指数、营养成分、脂肪酸、游离氨基酸、呈味核苷酸及挥发性风味物质的变化差异。结果显示,河蟹在越冬暂养期间处于稳定的生长状态,未出现“掉膏”。暂养后的河蟹,肌肉中必需氨基酸含量(E)显著上升(P<0.05),必需氨基酸与游离氨基酸总含量比值(E/T)显著上升(P<0.05);可食组织中腺苷酸(AMP)和肌苷酸(IMP)显著增加(P<0.05),次黄嘌呤(Hx)和肌苷(HxR)显著下降(P<0.05);虽然可食组织及卵巢中粗脂肪、C22:1和C22:4含量显著下降,但C20:2、C20：4和C20：5等多不饱和脂肪酸含量显著升高(P<0.05),同时PUFA/SFA比值显著上升;河蟹暂养105天后,1-辛烯-3-醇,己醛,壬醛和2-戊基呋喃为主要的挥发性物质,这些具有良好气味的物质占主导地位,表明河蟹的风味整体优于暂养前。以上结果表明,越冬暂养后河蟹的营养有一定的流失,品质和食用风味有所改善。     

亚临界提取甜瓜籽油风味与脂肪酸关系分析

【目的】分析5个品种甜瓜籽油的挥发性风味成分与脂肪酸之间的关系。【方法】采用气相色谱-质谱联用仪测定不同品种甜瓜籽油的挥发性风味成分和脂肪酸,采用R语言分析PCA和变量投影重要性。【结果】5个品种甜瓜籽油中共鉴定出65种挥发性化合物,新蜜1号样品检测到的挥发性物质种类最多为37种,皇后品种的油脂中有30种,香瓜和86-1样品中有29种,绿宝石样品检测到最少,为26种,分析发现5个样品之间的挥发性物质有显著性差异。5个品种甜瓜籽油在挥发性物质成分共分成4大类,皇后与绿宝石较相近归为一类。5种甜瓜籽油中富含不饱和脂肪酸,平均为75.34%,其中亚油酸最高,平均含量达56.81%。【结论】二十四酸、十八碳烯酸、花生酸、棕榈酸、亚麻酸、蓖麻油酸与某些香气物质有较强相关性。     

鸡源致病性大肠埃希氏菌产肠毒素能力的检测

用家兔肠袢试验和乳鼠灌胃试验检测了６株鸡源致病性大肠杆菌的产肠毒素能力．结果表明：检测的６株鸡源大肠杆菌均不产生耐热肠毒素（ＳＴ），另检测３株鸡源大肠杆菌亦不产生不耐热肠毒素（ＬＴ），因而认为鸡源大肠杆菌的致病性与肠毒素无关．     

枯草芽孢杆菌XF1菌株中XFsacA基因的克隆及功能验证

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XF1是从土壤中分离的一株利用蔗糖快、能高效防治根肿病的专利菌株.为探明其高效的蔗糖代谢机制,用PCR从该菌中扩增到蔗糖代谢关键基因蔗糖-6-磷酸水解酶基因(XFsacA基因),其编码的蛋白质氨基酸序列与枯草芽孢杆菌B168菌株中的XFsacA基因有97%的相似性,且发生了12个氨基酸突变.将该基因中约1.4 kb的编码框序列连接到表达载体pQE30上,构建了重组表达质粒pQE30-XFsacA,该质粒转入到不能利用蔗糖的Escherichia coli BL21中,后者能在以蔗糖为唯一碳源的M9无机离子培养基中正常生长,并表达出了一条约54 000蛋白条带.结果预示XFsacA基因氨基酸序列的替代可能是XF1高效利用蔗糖的基础,同时XFsacA基因的克隆与其在E.coli中的表达研究,为利用蔗糖发酵的工程E.coli构建奠定了基础.     

欧李八氢番茄红素合成酶cDNA克隆、序列分析及在大肠杆菌中的功能表达

 【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis（Bge）Sok]八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,最大开放读码框为1 194 bp,可编码398个氨基酸,命名为ChPSY。核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在70%和65%以上,并且发现欧李PSY的N末端存在1—55个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在37—58和219—240氨基酸区域包含2个跨膜结构域。SDS-PAGE分析表明,原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,相对分子量约为45.8 kD。通过大肠杆菌异源表达证实ChPSY可编码一个功能蛋白,促进工程菌株中β-胡萝卜素含量增加。【结论】该研究成功地克隆了欧李PSY cDNA全长并在大肠杆菌中功能表达,为进一步研究该酶蛋白特性和欧李果实类胡萝卜素的合成机制奠定了基础。     

杜梨花挥发油化学成分的研究

采用水蒸气蒸馏法从杜梨花中提取挥发油,用气相色谱-质谱法对化学成分进行鉴定。共分离出46个峰,确定了其中的45种,所鉴定化合物的含量占全油的87.84%,主要化学成分为:二十一烷(60.05%);二十八烷(4.48%);(E,E)-3,7,11-三甲基-2,6,10-三烯十二-1-醇(4.43%);6,10,14-三甲基-2-十五酮(2.27%);2-甲氧基[1]苯噻吩-[2,3-c]喹啉-6(5H)-酮(1.98%);Iron,monocarbonyl-(1,3-butad iene-1,4-d icarbon ic ac id,d iethyl ester)a,a'-d ipyridyl(1.61%);[(2-氟苯)甲基]-1H-嘌呤-6-胺(1.07%);1,2-苯二羧酸-二异辛酯(1.02%)。以上八种化合物占总挥发油的76.91%,所得挥发油为淡黄色油状物,具有浓郁的芳香气味。     

不同杂交家系铁皮石斛花多糖、浸出物及氨基酸质量分数分析

铁皮石斛Dendrobium officinale花是铁皮石斛药材的非药用部位,为测定其多糖、浸出物、氨基酸的质量分数,探讨3种成分之间的内在关系,全面了解铁皮石斛花中的物质分布规律,利用药典方法测定铁皮石斛花的多糖、浸出物质量分数,并采用17种氨基酸标准品,通过酸水解法提取、异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生处理样品,结合反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定10个不同杂交家系铁皮石斛花中的氨基酸组成与质量分数。结果表明:铁皮石斛花中多糖质量分数平均为71.00 mg·g-1,浸出物质量分数为300.00 mg·g-1;从铁皮石斛花中检测到16种氨基酸,总氨基酸平均质量分数为7.88%;3种成分质量分数差异显著（P < 0.05）。利用SPSS 17.0分析3种成分之间的相关性,多糖和浸出物在合成积累上呈现负相关,与氨基酸之间相关性不明显（P>0.05）。铁皮石斛花中含有较丰富的多糖、浸出物及氨基酸等营养及功效成分,具有一定的保健开发价值。图 1 表 3 参11     

烟曲霉脱乙酰几丁质酶cDNA的克隆及其在大肠杆菌中表达的研究

将烟曲霉的一种胞外脱乙酰几丁质酶（AF CSN）纯化,并测定该酶N-端氨基酸的序列。用此序列推测的寡核苷酸引物扩增得到脱乙酰几丁质酶（csn）的cDNA,其全长为804bp,编码一种251个氨基酸的单肽,对csn的序列比较分析表明,它与茄病镰刀菌在两个区域具有同源性,这两个区域分别有重复天冬氨酸及苏氨酸残基,这说明它与细菌具有相同的演化起源。cns与已知的细菌脱乙酰几丁质酶没有同源性,Southern杂交分析显示,cns在烟曲霉基因组中的单拷贝的。用质粒栽体pET28a(t),csn cDNA被导入E.coli中得到csn的融合蛋白,在IPTG诱导下,E.coli细胞中可获得大量的约28kDa的成熟蛋白。