海南省槟榔病理性黄化发生分布情况及其植原体检测分析

槟榔是海南省重要的热带经济作物,受多种病害组成的槟榔病理性黄化的影响,尤其是槟榔黄化病,使槟榔产量造成严重损失。为明确当前海南省槟榔病理性黄化的发生分布情况及槟榔黄化病的危害情况,本研究对全省槟榔病理性黄化的发生分布进行调查,并对全省采集的槟榔黄化样品进行植原体检测分析。结果显示,当前海南省槟榔病理性黄化发生面积为38 300.04 hm²,占全省槟榔种植面积的33.27%,主要发生在海南东部、南部及中部市（县）,三亚市发生率最高,为77.48%,万宁市发生面积最大,为9734.66 hm²,西部市（县）的病理性黄化发生率均低于10%;当前海南省槟榔黄化病发生面积为32 102.38 hm²,占全省槟榔种植面积的27.89%,全省各市（县）均有槟榔黄化病发生,主要在海南中部和东部地区的发病率较高,琼海市、定安县、文昌市、屯昌县及琼中县的植原体检出率分别高达100%、100%、100%、98%、95.38%,除临高县、白沙县及东方市外,其余市（县）检出率均高于50%,万宁市槟榔黄化病发生面积最大,为7909.41 hm²,其次为琼海市;每个市（县）槟榔植原体在各树体间的含量分布差异较大,定安县植原体的平均含量最高,为1443.36 copies/μL,向周边市（县）递减,除了在海南东北部市（县）的槟榔植原体含量较高外,其他市（县）植原体含量较低。以上研究表明,当前海南槟榔病理性黄化发生严重,植原体是造成海南省槟榔病理性黄化的主要病原之一。     

中国“槟榔黄化病”研究40年——病原、防控措施新进展

自1981年海南省屯昌县首次发现槟榔黄化病（yellow leaf disease of areca palm, YLD）以来,槟榔黄化问题日趋严重,现已成为制约中国槟榔产业可持续发展的最重要的因素。同时,鉴于生产中除槟榔黄化病外,炭疽病、细菌性叶斑病、椰心叶甲、干旱等一些其他因素也可引起槟榔黄化,以及“槟榔黄化病”病原或病因认识上存在混淆的问题,学界暂用“槟榔黄化现象”的表述。近年来,针对上述问题开展了一系列深入研究并取得突破性进展。本文首先简要回顾了中国槟榔黄化病的发生及病原方面的研究进展,介绍了另一种致黄关键新病害——由槟榔隐症病毒1（Areca palm velarivirus 1, APV1）引起的槟榔黄叶病毒病（areca palm leaf yellowing virus disease, ALYVD）,以及其他2种新发现的病毒病害——槟榔坏死环斑病毒病和槟榔坏死环斑病毒病的研究进展。对6个示范基地的病原检测结果表明,部分黄化植株被槟榔黄化植原体（areca palm yellow leaf phytoplasma, AYLP）或APV1单独感染,部分植株被AYLP和APV1复合感染。本文还探讨了槟榔黄化病研究中存在的病原分布不均、含量低引起的检测困难和田间诊断易混淆等问题,并对YLD、ALYVD、叶斑类病害、根腐病害、芽腐病、椰心叶甲、干旱、寒害、除草剂药害等9类因子引起的黄化症状特征进行了总结。进而分析了YLD和ALYVD 防控中存在的问题以及现阶段面临的紧迫形势,从防控策略和具体措施解读了《槟榔“黄化病“防控明白纸》,并指出了其有待进一步完善之处及防控中亟待解决的问题。最后,展望了YLD和ALYVD 2种致黄关键病害综合防控中亟待实施的措施。本文旨在让广大科研工作者和农技人员更好地了解槟榔“黄化病”方面的最新成果。     

槟榔隐症病毒1型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、精准且能定量分析槟榔隐症病毒1型（Areca palm velarivirus 1, APV1）的检测方法。本研究参照GenBank中已登录的APV1全基因组序列,在p21蛋白基因保守区域和p60蛋白基因保守区域之间设计1对特异性RT-PCR引物,并构建阳性重组质粒;在p60蛋白基因保守区域部分设计荧光定量PCR特异性引物和TaqMan-MGB探针,利用阳性重组质粒,构建标准曲线,并对该检测方法的敏感性、特异性、稳定性及其应用效果进行验证。结果显示：该方法对阳性质粒标准品检测的敏感性达3.0×10¹ copies/μL级别,是常规RT-PCR敏感性的100倍;标准曲线显示,C_t值与拷贝数的对数呈线性关系,其标准曲线方程为y=-3.2748x+42.957,扩增效率为102%,相关系数R²为0.9992;该方法对APV1的检测具有较好的特异性,其他槟榔病原物及内生菌不会对本方法产生非特异性干扰;批内与批间重复性试验结果显示,该方法对APV1的检测具有较好的重复性和稳定性;利用该方法对海南万宁、琼海、定安、文昌等4个市（县）采集的181份疑似样品进行检测,阳性率分别为91.95%、86.95%、89.65%、73.68%,其阳性的病毒拷贝数最高达1.59×10⁷copies/μL,表明海南部分地区APV1病毒载量较高、流行情况比较严重。     

我国木薯花叶病毒病的发生危害及其病原鉴定

为明确国内木薯花叶病毒病（cassava mosaic virus disease）的危害情况、田间症状及其病原类型,本研究于2018—2019年调查了该病在国内的分布情况、症状特征及种质来源等数据,采集了8省（区）19地的384份样品,利用特异性引物检测2种木薯花叶病毒侵染引起的症状类型,并通过序列比对明确其病原特点。结果表明：木薯花叶病毒病已经在我国发生,种茎调运是该病远距离传播的主要原因;国内木薯花叶病毒病病原有斯里兰卡木薯花叶病毒株系（Sri Lankan cassava mosaic virus, SLCMV）和木薯普通花叶病毒（Cassava common mosaic virus, CsCMV）2种病毒,可分为单独感染、复合感染,其中SLCMV的检出率为21.1%,CsCMV的检出率为36.5%,SLCMV-CsCMV复合侵染率为15.1%;检测到的SLVMV与东南亚SLCMV序列同源性为99.4%~99.7%,检测到的CsCMV与拉丁美洲的CsCMV序列相似性为91%~96%。推测国内木薯花叶病毒病主要由2种病毒侵染引起,且普通花叶病毒有产生序列变异的可能性。     

基于转录组测序的槟榔叶片黄化的共同差异表达基因的分析

槟榔（Areca catechu L.）作为海南省重要的经济作物,其叶片黄化现象日趋严重,已成为当前制约槟榔产业持续健康发展的一大障碍。经田间调研发现,叶片黄化症状主要有从叶缘1/4处开始发生的特异性黄化和全叶型黄化两种类型。本研究应用转录组测序技术,筛选出440个在特异性叶片黄化组中共同显著差异表达的基因,这些差异基因主要富集在能量代谢通路、激素代谢通路和次级代谢通路中。本研究探讨了不同胁迫下槟榔叶片表现出特异性黄化症状的分子机理,为槟榔黄化病的综合防控工作提供理论依据。     

海南岛黄瓜病毒病种类鉴定及其发生分布研究

2018年11月—2019年3月,在海南省三亚、乐东、东方、儋州、澄迈、海口、万宁和五指山共8个市县,采集疑似病毒病的叶片样本302份,采用小RNA深度测序和RT-PCR检测发现,黄瓜样品中存在黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）、甜瓜黄斑病毒（Melon yellow spot virus, MYSV）、黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV)和瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV）共5种病毒,检出率分别为32.79%、31.46%、23.18%、9.61%和2.65%。病毒的复合侵染率为11.28%,有8种复合侵染类型,以其中2种病毒复合侵染为主。明确了海南岛黄瓜病毒病主要种类及发生分布情况。     

海南番木瓜PRSV和PLDMV病毒发生情况及分子鉴定

对海南昌江、乐东、澄迈、文昌和三亚5个主要番木瓜产区的病毒病发生情况进行调查。对76份番木瓜疑似病毒样品进行检测,检测结果表明海南番木瓜病毒病主要有2种：由番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus,PRSV）引起的番木瓜环斑病毒病和由番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV）引起的番木瓜畸形花叶病毒病。其中,番木瓜环斑病毒病最为常见,检出率达77.63％,是影响海南地区番木瓜产业健康发展的主要病毒病;畸形花叶病毒病发生率很低,仅检出2例番木瓜畸形花叶病毒病样品。以PRSV病毒基因组P1和Hc-Pro作为靶标基因进行分子克隆、测序,结果表明海南地区PRSV病毒可明显分为2个株系：HN-PRSV-1株系和HN-PRSV-2株系。此外,基于CP基因的系统进化树分析结果表明在海南新发现的PLDMV病毒可能源于台湾和日本。本研究可为开展番木瓜花叶病的防控和创制抗花叶病毒番木瓜新种质提供数据参考。     

甘薯种质资源圃病毒病发生情况调查

甘薯病毒病田间常见症状有四类：（１）叶片斑点斑驳型;（２）叶片畸形;（３）叶片枯斑坏死型;（４）叶片变色型。病害发生严重度年度间有差异,受环境因子影响较大。主要病毒种类为ＳＰＦＭＶ和ＳＰＣＦＶ。     

广西柑橘碎叶病和叶斑病调查及其病原的遗传多样性分析

调查了广西南宁、崇左、柳州、桂林、玉林、河池、贺州及防城港等主要柑橘种植区的柑橘碎叶病和叶斑病的发生情况,并对其病原柑橘碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus, CTLV）、苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus, ASGV）和柑橘叶斑病毒（Citrus leaf blotch virus, CLBV）进行了RT-PCR检测、病毒序列测定和遗传多样性分析。结果发现,在所有疑似柑橘病毒病样品中,CTLV检出率为7.3%,CLBV检出率为5.5%,ASGV检出率为3.0%。其中在南宁、桂林和玉林3个主要柑橘种植区采集的疑似柑橘病毒病样品的3种病毒病检出率合计分别为21.2%、28.6%和7.6%,且存在多种病毒复合侵染的现象。将克隆到的上述3个病毒分离物的病毒片段,分别与已报道的相应病毒的代表性分离物的病毒片段进行系统进化分析,结果表明,ASGV和CTLV的中国分离物在进化关系上均呈寄主相关性,ASGV的日本分离物则与地理位置相关性更强,而韩国和印度的分离物未表现出明显的寄主相关性和地理位置相关性。柑橘和苹果的ASGV和CTLV分离物均表现与地理位置相关,而梨的ASGV和CTLV分离物却与地理位置和寄主均不相关;CLBV分离物则呈明显的寄主相关性。本研究首次报道了广西柑橘碎叶病和柑橘叶斑病的发生情况及其病原的遗传多样性与系统进化关系,为柑橘病毒病的诊断和防治提供参考依据。     

52个甘蔗品种在广西受病毒侵染情况

为明确国家糖料体系甘蔗集成示范及区试品种在广西被病毒侵染情况,2017年从广西北海、南宁、崇左、百色、来宾、柳城、桂林等地集成示范及区试的52个甘蔗品种上采集带有甘蔗花叶病、甘蔗黄叶病和甘蔗杆状病毒病显著病症或不显病症叶片样品,采用特异引物通过RT-PCR和PCR方法进行5种病毒检测（甘蔗黄叶病毒、甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒和甘蔗杆状病毒）。结果表明,SCYLV的平均检出率为25.00%;SCSMV的平均检出率为7.97%;SrMV的平均检出率为7.69%;SCMV的平均检出率最低,为7.42%;SCBV的平均检出率最高,为68.41%,远远高于其他病毒。7个地方的甘蔗受病毒混合侵染现象普遍存在,北海的病毒混合侵染率甚至高于单一病毒侵染率。52个甘蔗品种在广西受5种病毒的总侵染率为79.67%,对甘蔗的生产安全存在着严重的潜在威胁,建议推广种植甘蔗脱毒种苗来缓解甘蔗病毒病害的危害。     

槟榔酚类物质生理活性研究进展

槟榔(Areca catechu L.)属棕榈科热带珍贵药用植物,主要产于我国的海南、云南等省以及印度、马来西亚等国家。槟榔果实为咀嚼嗜好品,又可药用,在我国被列为四大南药之首。虽然槟榔在国内外已经引起人们的关注,但对槟榔的功能性研究还存在很多缺憾。为了进一步寻找槟榔中的生理活性成分,对槟榔中酚类物质的研究加以综述,以期让基础科研人员、公共卫生工作者以及广大槟榔嗜好者对槟榔在人类健康中的作用有更深入的了解。     

槟榔生物量预测模型建立与应用

以海南本地种槟榔植株为材料,测量槟榔叶长（leaf length, LL）、叶宽（leaf width, LW）、叶片数（leaf number, LN）、花苞数（bud number, BN）、节数（node number, NN）、茎粗（stem diameter, SD）、株高（plant height, PH）、茎高（stem height, SH）和节间长度（internode length, IL）等可简单测量的特征指标,通过建立估测模型预测槟榔植株单片叶片干物质量（leaf dry weight, LDW）、茎杆干物质量（stem dry weight, SDW）及地上部分干物质量（aboveground dry weight, ADW）。结果表明：通过模型拟合和择优得到槟榔茎杆干物质量的估测模型为：SDW=0.2518 SD₀+ 0.0423 PH-23.8883,槟榔茎杆干物质积累量主要受株高（PH）、0 m茎粗（SD₀）的综合影响,决定系数R²=0.7157,样本株数为36株,另外18株进行外部验证,相关系数r=0.9165;槟榔单片叶片干物质量的估测模为：LDW=3.9726 LL+2.8402 LW-297.6869,槟榔单片叶干物质积累量主要受叶长（LL）、叶宽（LW）的综合影响,决定系数R²=0.6054,样本叶片数量为177片,另外88片进行外部验证,相关系数r=0.7528;槟榔地上部分干物质量的估测模型为：ADW=0.3283 SD₀ + 0.0415 PH -23.7333,槟榔地上部分干物质积累量主要受0 m茎粗（SD₀）、株高（PH）的综合影响,决定系数R²=0.6932,样本株数为36株,另外18株进行外部验证,相关系数r=0.9028。通过大量数据的观测分析,建立的槟榔生物量预测经验模型,可以将其作为最优生物量预测模型用于槟榔地上部分生物量的估算,具有一定应用价值。     

槟榔不同发育时期果实转录组特征分析

槟榔（Areca catechu L.）果实是四大南药之一。槟榔果的研究主要集中在生理生化、生防菌、有效成分及药理、加工和利用等方面,对槟榔果的发育及其次生物质形成的分子机制尚不清楚。本研究对不同发育时期的槟榔果皮和果核进行转录组测序,鉴定槟榔果不同发育时期的关键基因,以探讨果实发育相关基因的表达特征及次生物质形成有关的基因调控。结果显示,槟榔果皮中检测到4491个差异基因,其中617个差异基因共参与了111条KEGG代谢通路,生物过程代谢类有82个通路,共257个差异基因被注释,参与次生代谢途径共有5个,共27个差异基因。槟榔果核中检测到5443个差异基因,其中898个差异基因共参与了118条通路,466个差异基因被注释在生物代谢类通路上,共涉及89条通路,参与次生代谢相关的基因有53个,参与次生代谢途径共7条。进一步分析表明：随着果实的发育,果皮中80%次级代谢通路差异相关基因呈下调表达趋势;而果核中71.4%次级代谢通路差异相关基因呈上调表达趋势。本研究结果在转录组水平揭示了槟榔果发育的生物学过程,发现了不同时期槟榔果皮和果核中次级代谢相关调控基因表达的变化规律,也为槟榔的遗传育种研究奠定了基础。     

土壤水分胁迫对槟榔幼苗叶片生理的影响

以海南长蒂种槟榔幼苗为材料,采用盆栽试验,通过控制土壤含水量,研究不同水分胁迫对槟榔幼苗叶片的生理生化指标的影响规律。结果表明:经土壤水分胁迫处理后,槟榔幼苗叶片的丙二醛(MDA)含量、脯氨酸(Pro)含量、可溶性糖(SS)含量及可溶性蛋白含量均呈现上升趋势;过氧化物酶(POD)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性呈先升高后下降趋势,过氧化氢酶(CAT)活性则显示先降低而后升高趋势。并且,随着水分胁迫强度的增加及持续时间的延长,槟榔幼苗叶片的各项指标变化幅度差异较大。综合分析,初步认为:土壤相对含水量75%左右较有利于槟榔幼苗的生长。     

海南槟榔黄化植原体分子检测及其系统发育关系研究

由植原体引起的槟榔黄化病是海南特色经济作物槟榔种植上的一种毁灭性病害。本研究通过PCR扩增测序、序列多重比对和系统发育分析,对海南部分代表性地区槟榔致死性病原植原体的序列信息与系统发育关系进行检测分析。结果表明：本研究检测的保亭、屯昌、万宁等海南部分代表性地区的槟榔黄化植原体的16S rDNA序列一致;BLAST分析表明各株系16S rDNA与16SrI组植原体同源性为100%。序列多重比对分析表明,本研究各槟榔黄化植原体株系与海南苦棟丛枝、长春花绿变、马松子变叶、辣椒黄化皱缩、蛇婆子丛枝、细圆藤丛枝和日本洋葱黄化、美国翠菊黄化等植原体同源性为100%;与已报道的海南万宁、印度、海南三亚的槟榔黄化植原体16S rDNA序列同源性分别为99.9%、99.9%、99.8%。系统发育分析表明,本研究槟榔黄化植原体与海南苦棟丛枝、长春花绿变、马松子变叶、辣椒黄化皱缩、蛇婆子丛枝、细圆藤丛枝等株系聚于一个分枝,支持率为100%。此外,在发病槟榔叶片、花穗、心叶等组织部位均可检测到植原体。研究结果表明,海南槟榔黄化植原体与海南苦棟丛枝、长春花绿变、马松子变叶、辣椒黄化皱缩、蛇婆子丛枝、细圆藤丛枝等植原体株系的同源性极高,槟榔黄化病很可能会以这些寄主植物作为病原传播载体进行传播扩散。     

槟榔壳多酚组分及抗氧化活性的测定

建立 测定槟榔壳中多种酚类物质的高效毛细管电泳方法,分析不同浓度和不同pH值硼酸缓冲液对10种标准品的分离效果,最后确定最佳缓冲液为0.1 mol/L,pH 9.0的硼酸缓冲液,紫外检测波长为280 nm,分离电压为20 kV。方法简便快速,能在20 min之内将10种酚类物质完全分离开,检测限为0.5～4.5 mg/L。此外,进一步测定了槟榔壳多酚的抗氧化活性,选用3个评价抗氧化能力的指标,即：对DPPH自由基的清除能力、对还原能力以及对ABTS自由基的清除能力。     

槟榔红色素的抗氧化活性

测定槟榔红色素(areca red pigment,AP)对 DPPH·和·OH的清除能力、对脂质体过氧化的抑制能力、对Fe2+的络合能力,并测定其还原能力.结果表明:槟榔色素对DPPH·、·OH的清除能力较强:对脂质体过氧化的抑制能力很强,抑制率高达79.84%;与VE、没食子酸(gallic acid,GA)、BHT相比,槟榔色素的还原力、对Fe2+的络合能力较弱.说明槟榔红色素是较好的抗氧化剂.