略阳乌鸡酪氨酸酶基因(TYR)遗传变异分析

试验通过PCR-SSCP技术检测略阳乌鸡酪氨酸酶基因(TYR)部分启动子区、全部外显子和部分内含子的遗传多样性,并对不同基因型进行了测序和比对分析。结果表明,略阳鸡群体在TYR位点具有较为丰富的遗传变异,在所检测的启动子区有2个单核苷酸多态(SNP)位点;外显子1有2个SNP位点,外显子2、3、4没有检测到变异位点,外显子5存在5个SNP位点;检测的部分内含子2中发现2个SNP位点。mRNA上的7个变异位点有3个发生在编码区,但都是同义突变,没有造成氨基酸变异。表明略阳乌鸡和普通鸡的酪氨酸酶没有氨基酸序列差异,TYR基因在鸡的遗传上是高度保守的。启动子区和内含子区的遗传变异是否与酪氨酸酶的转录剪接和表达量有关,进而影响乌鸡黑色素的沉积还有待进一步研究。     

新疆小麦籽粒过氧化物酶(POD)活性检测及其基因等位变异检测

【目的】 研究新疆小麦品种(系)过氧化物酶活性高低并分析相关基因变异类型和分布,为新疆小麦育种和品质的遗传改良奠定基础。【方法】 分别利用TaPod-A1和TaPod-D1基因位点的显性互补功能标记TaPod-3A1/TaPod-3A2和TaPod-7D1/TaPod-7D6对113份新疆小麦品种(系)进行分子标记检测,结合新疆小麦材料POD活性的测定结果,分析POD活性相关基因不同等位变异对小麦籽粒POD活性的影响,验证TaPod-A1和TaPod-D1基因位点功能标记有效性的同时,对新疆小麦材料POD相关基因的等位变异分布频率进行分析。【结果】 新疆小麦品种(系)中,在TaPod-A1位点,具有TaPod-A1b基因型的小麦品种(系)POD活性(2 595.3 U/(g·min))极显著(P<0.01)高于具有TaPod-A1a基因型的材料(2 346.0 U/(g·min)),2种基因型的分布频率分别为36.3%和63.7%;在TaPod-D1位点,具有TaPod-D1b基因型的小麦品种(系)POD活性(2 503.9 U/(g·min))显著(P<0.05)高于具有TaPod-D1a基因型的材料(2 376.9 U/(g·min)),2种基因型的分布频率分别为46.9%和53.1%。在113份新疆小麦材料中,共检测到TaPod-A1a/TaPod-D1a、TaPod-A1a/TaPod-D1b、TaPod-A1b/TaPod-D1a和TaPod-A1b/TaPod-D1b 4种变异组合类型,在新疆小麦中的分布频率分别为31.9%、31.9%、21.2%和15.0%。TaPod-A1b/TaPod-D1b(2 706.2 U/(g·min))类型的POD活性显著(P<0.05)高于TaPod-A1a/TaPod-D1a(2 283.6 U/(g·min))。【结论】 新疆小麦品种(系)以TaPod-A1a(低POD活性)和TaPod-D1a(低POD活性)等位变异类型为主;TaPod-A1和TaPod-D1的功能标记均能较好的区分小麦籽粒POD活性的高低,将2个位点特异性标记结合起来使用,有效地筛选出高POD活性的材料,提高新疆小麦品种(系)优异等位变异的频率,促进新疆小麦品质的遗传改良。     

草鱼MKLN1基因可变剪接和微卫星序列的多态性

MKLN1基因编码的muskelin蛋白主要通过其羧基端的kelch重复结构域与其它蛋白形成复合物行使功能。通过分析草鱼鳃组织的基因转录谱,发现其中的MKLN1基因存在(CT)15的微卫星序列,通过检测3个不同的草鱼种群,又发现(CT)9、(CT)10、(CT)11和(CT)13 4种多态性序列。通过克隆该段MKLN1基因组序列并与斑马鱼和红鳍东方鲀的MKLN1基因组序列比较,发现克隆得到的草鱼基因序列是由一个内含子和两个外显子组成,共编码144个氨基酸。通过进一步调查不同组织该基因的转录本,发现存在内含子剪接和内含子未被剪接的两个转录本。由于内含子序列未被剪接的转录本在内含子中存在TGA终止密码子,导致MKLN1基因翻译提前终止,翻译产物为失去部分kelch结构域的muskelin蛋白。相对于内含子正常剪接的转录本,没有被剪接内含子的转录本在各种组织中的表达量要明显低得多。简而言之,本研究发现了草鱼MKLN1转录本中的微卫星序列是来自未被剪切的内含子,而未被剪切的内含子导致该转录本编码部分kelch结构域缺失的muskelin蛋白。研究亮点:目前对于可直接锚定功能基因的I型微卫星标记研究很少。本文首次发现M...     

生菜LsPHYB可变剪接体的克隆与高温诱导表达模式

【目的】光敏色素B（phytochrome,PHYB）是光和温度的受体。通过克隆光敏色素B基因（PHYB）可变剪接体并分析其在高温诱导下的表达模式,探究LsPHYB可变剪接体在生菜响应环境高温中的生物学功能,为培育耐热性生菜提供理论依据。【方法】采用生物信息学方法在生菜的基因组数据库搜索获得LsPHYB的cDNA序列的相关信息;对克隆得到的3个可变剪接体LsPHYB1、LsPHYB2和LsPHYB3进行多序列比对、可变剪接方式分析及系统进化树分析;通过在线软件预测PHYB1、PHYB2和PHYB3蛋白分子量、等电点和亲水性、疏水性等蛋白质理化性质,并通过生物信息学软件预测三者的二级结构、三级结构和保守结构域;采用荧光定量PCR（qRT-PCR）检测PHYB1、PHYB2和PHYB3在高温处理后的表达特征。【结果】克隆获得的生菜LsPHYB的3个可变剪接体LsPHYB1、LsPHYB2和LsPHYB3的CDS长度分别为3 509、3 877和2 690 bp,编码氨基酸长度分别为1 094、960和853 aa。其中LsPHYB1发生可变3′端位点和外显子跳跃类型可变剪接,LsPHYB2发生选择性保留polyA尾和内含子保留型可变剪接,LsPHYB3发生外显子跳跃类型可变剪接。保守结构域分析表明PHYB2的N端缺少PAS和PHY功能域;PHYB3的N端缺少PAS和PHY功能域,C端缺少HisKA功能域;系统进化树分析表明,3个可变剪接体聚为一支。qRT-PCR分析表明在高温处理第1天,LsPHYB3的表达量最高;在高温处理第5—9天,LsPHYB2的表达量高于LsPHYB1和LsPHYB3;在高温处理第11天,LsPHYB1的表达量高于LsPHYB2和LsPHYB3,处理11 d内三者表达量达到峰值的时间不同。【结论】高温下生菜LsPHYB的转录本存在3个可变剪接体LsPHYB1、LsPHYB2和LsPHYB3。LsPHYB3在高温处理前期高表达,LsPHYB2、LsPHYB1分别在高温处理中期、后期高表达,推测生菜3个LsPHYB可变剪接体在抗高温胁迫中发挥不同的作用。     

玉米蛋白磷酸酶2C基因ZmPP2C26两个可变剪接体的功能分析

【目的】探讨蛋白磷酸酶2C在植物生长发育和逆境抗性中的作用。【方法】利用逆转录PCR扩增玉米蛋白磷酸酶2C基因ZmPP2C26的两个可变剪接体,用生物信息学工具预测其推导蛋白的特性后,转化野生型拟南芥,并进行功能验证和亚细胞定位。【结果】在较短剪接体中切除的213nt第一内含子,在较长剪接体中被保留。第一个内含子的剪接位点为5′-CC..CG-3′,与植物中通常的组成型剪接位点5′-GT..AG-3′不同。保留内含子及其侧翼序列的G/C含量较高,相当于其他内含子及其侧翼序列的2倍。两个剪接体在野生型拟南芥中的异源表达均可增加其对干旱胁迫的敏感性。两个剪接体推导蛋白的预测三维结构均与PP2C相似,较长剪接体保留内含子编码的71个冗余氨基酸序列保持随机螺旋状态,预测为叶绿体定位信号肽。绿色荧光蛋白标记法定位表明,较长剪接体定位于细胞核、细胞膜和细胞器,而较短剪接体定位于细胞核和细胞膜。【结论】ZmPP2C26基因转录后加工过程中发生内含子保留型可变剪接。第一个内含子的保留没有改变其编码蛋白的PP2C功能,但有可能使其作用由细胞核和细胞膜延伸至叶绿体。     

猪Mx1基因5’内含子1及外显子2单核苷酸多态性分析

通过构建DNA池和测序的方法,分析了蓝塘猪和长白猪Mx1基因5’外显子1和内含子2共计1 514 bp(2 218～3 731)单核苷酸多态性.结果表明:在1 514 bp的序列上共发现了8处单核苷酸突变,1处为颠换,7处为转换,依次是:2 593G＞A、2 740T＞C、2 792C＞T、2 855C＞T、2 962C＞A、3 004C＞T、3 669T＞C、3 690A＞G.生物信息学预测发现猪Mx1基因内含子2上也存在多个转录因子结合位点,其中2 740T＞C和3004C＞T分别位于潜在的转录因子LEF1和AP1的结合位点,但是没有位于结合位点的核心序列.     

中华蜜蜂泛素基因及其全长转录本的发掘及分析

旨在利用三代Nanopore测序技术发掘中华蜜蜂（Apis cerana cerana）泛素（ubiquitin）基因及其全长转录本。基于前期获得的中华蜜蜂工蜂4～6日龄幼虫肠道的全长转录组数据,使用BLAST工具将全长转录本的序列比对到KEGG和Nr数据库以鉴定泛素基因及其全长转录本。采用Astalavista软件分析泛素基因的可变剪接（alternative splicing,AS）事件,并通过RT-PCR加以验证。通过TAPIS pipeline软件分析泛素基因的可变多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation,APA）位点。共鉴定到48个中华蜜蜂泛素基因和435条泛素基因相关全长转录本。共发掘到48个泛素基因的74次AS事件,包括31次内含子保留事件,19次可变3′端剪接事件,16次可变5′端剪接事件及8次外显子互斥事件。RT-PCR结果证实了3种AS事件类型的真实性。共预测到38个泛素基因含有1个及以上的APA位点,并且在APA位点的上游鉴定到多个motif,一致性序列为：KCWYTDYTMWSYGMW SCARAWCCAGAATGAYCCWYWGGHWVMWGWDRTRGC。研究结果丰富了中华蜜蜂泛素基因及其全长转录本信息,为持续深入开展相关功能研究提供参考和依据。     

大白菜WRKY转录因子的全基因组鉴定与分析

WRKY转录因子是一类重要的调控分子,在高等植物中以基因家族的形式存在。试验以大白菜基因组数据为材料,利用生物信息学手段对WRKY转录因子进行了全基因组鉴定与分析。结果表明,大白菜至少有134个WRKY转录因子,蛋白序列长度为143～1 082;基因组DNA全长880～9 099 bp,具1～15个内含子。染色体定位结果表明,10条染色体上均有WRKY转录因子基因的分布,A3染色体上最多（26）,A10染色体分布最少（4）。大白菜WRKY转录因子可分为3大类,Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类的数量分别为27,83和24,它们处于进化树的不同分支。除保守的WRKYGQK和常见变异序列WRKYGKK外,新发现WRKDGQK,WRKNGQK和WMKYGQK等3种WRKY结构域类型。     

中华蜜蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因全长转录本鉴定及分析

【目的】系统鉴定和分析中华蜜蜂(Apis cerana cerana)吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本,为深入开展相关基因和剪接体的功能研究奠定基础。【方法】基于前期已获得的高质量中华蜜蜂纳米孔长读段测序数据,通过Blast工具将全长转录本比对Nr数据库筛选出吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本。利用gffcompare软件将全长转录本与东方蜜蜂(Apis cerana)参考基因组上注释的转录本进行比较,鉴定未注释的新基因和新转录本。利用TAPIS pipeline预测和分析吞噬与包囊作用相关基因的可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)位点,并通过TBtools软件鉴定APA位点上游的基序(motif)。使用Astalavista软件鉴定可变剪接(alternative splicing,AS)事件,并通过IGV浏览器进行结构可视化。通过RT-PCR验证AS事件的真实性。【结果】共鉴定到中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关的基因66个和全长转录本395条,发掘出东方蜜蜂参考基因组未注释的2个新基因和303条新转录本。对参考基因组已注释的34个基因进行了结构优化,分别延伸了18个基因的5′端和12个基因的3′端,同时延长了4个基因的5′端和3′端。共鉴定到含有1个及以上APA位点的吞噬与包囊作用相关基因47个,其中多于5个APA位点的基因最多,为32个。在APA位点上游鉴定到多个基序,一致性序列为：GRBGCNKSDAACAAYTRBGCBMRNGGBYAYTAYWCNVWNGG。共鉴定到吞噬与包囊作用相关基因的AS事件296次,其中包括131次可变3′端剪接(alternative 3′splice site,A3SS)、85次内含子保留(intron retention,IR)、70次可变5′端剪接(alternative 5′splice site,A5SS)和10次外显子跳跃(exon skipping, ES)。RT-PCR结果显示,扩增的目的片段大小符合预期,证实了随机选择的2次AS事件的真实性。【结论】系统鉴定了中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本以及AS事件和APA位点,优化了东方蜜蜂参考基因组注释的吞噬与包囊作用相关基因的结构。     

Virus-specific splicing inhibitor in extracts from cells infected with HIV-1

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), in contrast with most other retroviruses, encodes trans-regulatory proteins for virus gene expression. It is shown in this study, by means of an in vitro splicing system, that nuclear extracts obtained from cells infected with HIV-1 contain a factor (or factors) that specifically inhibits splicing of a synthetic SP6/HIV pre-messenger RNA (pre-mRNA)-containing donor and acceptor splice sites in the coding region for the envelope protein. It is also shown that the SP6/HIV pre-mRNA is not capable of assembly in a ribonucleoprotein complex, spliceosome, in extracts from infected cells. These findings raise the possibility that specific inhibition of pre-mRNA splicing in the envelope protein coding region by HIV-1 trans-regulatory factors might be one control mechanism for efficient production of structural viral proteins and virion assembly.     

人类1号染色体可变剪接与普通剪接基因同义密码子的使用分析I.同义密码子偏爱使用分析

人类1号染色体可变剪接(选择性剪接)基因344非冗余蛋白质编码序列(188183密码子)和普通剪接(非可变剪接)基因的386蛋白质编码序列(223116密码子)被用于研究人类密码子使用偏爱模式.全部密码子使用数据分析表明,人类可变剪接基因密码子的偏爱水平显著高于普通剪接基因.在人类1号染色体基因中,密码子第三位置的G C含量有很大的异质性(0.24～0.95),并且可变剪接基因密码子第三位置平均G C含量(64.66%)大于普通剪接基因(59.97%).Nc值对GC3s图显示密码子偏爱使用除了受核苷酸组成制约外,其它的因子可能也影响密码子的使用变化.此外,可变剪接基因中以G 或C结尾的密码子比普通剪接基因出现的频率高.密码子使用的差异可能是由可变剪接基因pre-mRNA特有的结构特征和多种剪接模式决定的.     

内含子的识别和选择性剪切

真核生物内含子的一个显著特征是在很多生物中其5'和3'剪切位点的基本序列都具有相对很高的保守性,内含子从mRNA前体转录产物中的去除和伴随的外显子的连接称作mRNA前体的剪切,它是构成真核基因表达和基因调控水平的一个重要方面。这个过程由许多具有有限序列和特殊空间结构的顺式作用元件控制,由被称为剪切体的核糖核蛋白复合体来执行。以内含子的识别和由于识别造成的选择性剪切进行了综述,试图去理解造成选择性剪切的分子机理。     

烟草PR3b转录后剪切元件NRSE1与GUS融合表达后的可变剪切

【目的】烟草（Nicotiana tabacum L.）碱性几丁质酶基因PR3b在低烟碱突变体（nic1和nic2）中存在转录后mRNA可变剪切现象,但其可变剪切的发生机制仍不清楚。将PR3b的可变剪切元件NRSE1（nicotine- synthesis related splicing element 1）与GUS融合表达,分析NRSE1元件的独立可变剪切特性,以揭示其作用机制。【方法】利用PCR扩增方法获得PR3b cDNA序列中的NRSE1元件片段,并利用基因重组技术构建了烟草PR3b可变剪切元件NRSE1与GUS的融合表达载体。将融合表达载体导入农杆菌LBA4404后,通过农杆菌介导的叶盘转化法培育了表达NRSE1与GUS融合子的低烟碱突变体nic1和nic2及野生型烟草转基因植株;通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出阳性植株后,利用RT-PCR分析NRSE1与GUS融合表达后在低烟碱突变体和野生型烟草中的可变剪切特性;对转基因植株的幼苗进行乙烯（ET）和茉莉酸（JA）处理,通过GUS染色方法分析ET和JA处理对转基因植株中GUS活性的影响,并通过RT-PCR方法分析ET和JA处理对转基因植株中NRSE1与GUS融合子的可变剪切特性影响,以及对转基因植株中NRSE1与GUS融合子表达水平的影响。【结果】通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出表达NRSE1元件与GUS融合子的低烟碱突变体和野生型烟草转基因植株;RT-PCR检测及测序分析证明,NRSE1元件与GUS融合表达后仍能在低烟碱突变体发生高水平的可变剪切,剪切修饰区段的序列变化与烟草中PR3b的mRNA可变剪切修饰一致;利用ET和JA处理转基因植株进行的GUS染色表明,ET和JA处理对转基因植株的GUS活性有不同程度的影响;但利用ET和JA处理转基因植株进行的RT-PCR分析表明,ET和JA处理不改变NRSE1元件原有的诱导剪切特性,也不影响转基因植株中NRSE1元件与GUS融合子的表达水平。【结论】PR3b的可变剪切元件NRSE1与GUS在烟草中融合表达后,仍能在低烟碱突变体nic1和nic2中发生高水平的可变剪切;NRSE1在烟草中的可变剪切不依赖PR3b的其他mRNA区段,是烟草PR3b发生可变剪切的独立元件;ET和JA处理对NRSE1元件与GUS融合表达植株的GUS活性具有一定影响,可能存在翻译水平的调控作用。     

Genome-wide survey of human alternative pre-mRNA splicing with exon junction microarrays

Alternative pre-messenger RNA (pre-mRNA) splicing plays important roles in development, physiology, and disease, and more than half of human genes are alternatively spliced. To understand the biological roles and regulation of alternative splicing across different tissues and stages of development, systematic methods are needed. Here, we demonstrate the use of microarrays to monitor splicing at every exon-exon junction in more than 10,000 multi-exon human genes in 52 tissues and cell lines. These genome-wide data provide experimental evidence and tissue distributions for thousands of known and novel alternative splicing events. Adding to previous studies, the results indicate that at least 74% of human multi-exon genes are alternatively spliced.     

Regulated splicing of the Drosophila P transposable element third intron in vitro: somatic repression

In eukaryotic cells alternative splicing of messenger RNA precursors (pre-mRNA's) is a means of regulating gene expression. Although a number of the components that participate in regulating some alternative splicing events have been identified by molecular genetic procedures, the elucidation of the biochemical mechanisms governing alternative splicing requires in vitro reaction systems. The tissue specificity of P element transposition in Drosophila depends on the germline restriction of pre-mRNA splicing of the P element third intron (IVS3). Drosophila P element IVS3 pre-mRNA substrates were spliced accurately in vitro in heterologous human cell extracts but not in Drosophila somatic cell splicing extracts. Components in Drosophila somatic cell extracts that specifically inhibited IVS3 splicing in vitro were detected by a complementation assay. Biochemical assays for Drosophila RNA binding proteins were then used to detect a 97-kilodalton protein that interacts specifically with 5' exon sequences previously implicated in the control of IVS3 splicing in vivo. Inhibition of IVS3 splicing in vitro could be correlated with binding of the 97-kD protein to 5' exon sequences, suggesting that one aspect of IVS3 tissue-specific splicing involves somatic repression by specific RNA-protein interactions.     

西瓜果形基因图位克隆及分子标记开发

【目的】基于GBS（Genotyping-by-sequencing）高密度遗传图谱初步定位结果,通过图位克隆方法对西瓜果形基因进行精细定位,并开发功能性分子标记,有助于全面研究果形基因的功能及分子标记辅助选择育种。【方法】利用114份纯合西瓜品系全基因组重测序数据及其果形指数表型进行GWAS（genome-wide association study）分析,结合GBS高密度遗传图谱初步定位结果确定果形基因候选区段,以商业小型西瓜品种纯化所得品系K2（椭圆形、FSI=1.54±0.13）和L1（圆形、FSI=1.11±0.07）为材料构建F₂群体,通过开发分子标记对果形基因ClFSI进行精细定位,根据西瓜参考基因组‘97103’v1注释信息确定候选基因,并通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行验证。【结果】利用1 152份F₂群体,最终将ClFSI精细定位于3号染色体的FMFSI-1与FMFSI-2标记之间物理距离约63 kb区间内,共包含5个注释基因。其中Cla011257属于已报道与控制果实纵径和果形相关的SUN基因家族。经测序分析发现,西瓜椭圆形品系K2在该基因第3外显子上存在两个非同义突变位点Chr3：26846636 G-A和Chr3：26847041 G-A（‘97103’v1）,分别导致天冬酰胺（Asn）替换为天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）替换为赖氨酸（Lys）,并利用Chr3：26847041突变位点开发功能性分子标记FSICAPS-2。qRT-PCR分析表明,K2（椭圆形）与Charleston Gray（细长形）中候选基因表达量无显著性差异,但均显著高于L1（圆形）。【结论】本研究将控制西瓜果形的ClFSI精细定位于3号染色体63 kb区间内,推测Cla011257为最终目的基因,Chr3：26847041和Chr3：26846636突变位点是导致果形不同程度伸长的重要位点,并开发了可以同时鉴定Cla011257多种突变类型的功能标记FSICAPS-2。     

玉米大斑病菌SC35同源基因表达规律与互作分析

[目的]获得玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)SC35类剪接因子的基因,并分析该基因家族之间的相互作用及在病菌不同生长发育时期与侵染过程中的表达规律,为明确剪接因子SC35家族与真菌生长发育的关系打下基础.[方法]以拟南芥(Arabidopsis thaliana)SC35编码的氨基酸序列为探针序...     

RNA secondary structure repression of a muscle-specific exon in HeLa cell nuclear extracts

The chicken beta-tropomyosin pre-messenger RNA (pre-mRNA) is spliced in a tissue-specific manner to yield messenger RNA's (mRNA's) coding for different isoforms of this protein. Exons 6A and 6B are spliced in a mutually exclusive manner; exon 6B was included in skeletal muscle, whereas exon 6A was preferred in all other tissues. The distal portion of the intron upstream of exon 6B was shown to form stable double-stranded regions with part of the intron downstream of exon 6B and with sequences in exon 6B. This structure repressed splicing of exon 6B to exon 7 in a HeLa cell extract. Derepression of splicing occurred on disruption of this structure and repression followed when the structure was re-formed, even if the structure was formed between two different RNA molecules. Repression leads to inhibition of formation of spliceosomes. Disrupting either of the two double-stranded regions could lead to derepression, whereas re-forming the helices by suppressor mutations reestablished repression. These results support a simple model of tissue-specific splicing in this region of the pre-mRNA.