香蕉枯萎病菌4号生理小种β1-微管蛋白基因的功能分析

本研究克隆并鉴定香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)β1-微管蛋白(β1-tub)基因,采用Split-marker同源重组技术获得Foc4的β1-tub基因敲除突变体,通过测定突变体菌株的生长速度、产孢量、致病力及对多菌灵敏感性,研究β1-tub基因在香蕉枯萎病菌的生长发育及对多菌灵抗药性中的作用。结果表明：与Foc4野生型菌株相比,敲除突变体生长缓慢、菌丝畸形及产孢量增加,对巴西蕉苗的致病力明显减弱,但对多菌灵的抗性水平无明显变化。由此推测β1-tub基因可能在Foc4的生长发育、产孢及致病力等方面具有重要的作用。     

香蕉枯萎病菌4号生理小种smy1基因的功能分析

Smy1是一种参与调控真菌生长的驱动蛋白。本研究克隆了香蕉枯萎病菌4号生理小种（Foc 4）驱动蛋白基因smy1,并采用同源重组技术获得smy1敲除的野生型Foc 4的smy1敲除突变体。通过测定突变体菌丝形态、生长速度、产生孢子量、对香蕉苗的致病力及对氰烯菌酯的敏感性,用于研究smy1在香蕉枯萎病菌的生长发育及对氰烯菌酯抗药性中的作用。结果表明,与野生型Foc 4相比,smy1敲除突变体生长缓慢、菌丝畸形、产孢量增加,对巴西蕉苗的致病力减弱,但对氰烯菌酯的抗性水平变化不大。由此推断smy1基因可能在Foc 4的生长发育、产孢以及致病力等方面具有重要作用。     

香蕉枯萎病菌内源报告基因比卡菌素聚酮合酶编码基因Bik1的鉴定及应用

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重.本研究克隆鉴定Foc4比卡菌素聚酮合酶编码基因(bikaverin PKS-encoding gene,Bik1)Foc...     

香蕉枯萎病菌2个生理小种MAPK基因的克隆及序列分析

为了解香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)1号生理小种(race 1)和4号生理小种(race4)丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因focMK1,focMK4的序列差异,根据番茄枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)的MAPK基因相关序列设计引物,利用PCR和RT-PCR技术,分别克隆了香蕉枯萎病菌2个生理小种的基因序列和开放阅读框。结果表明,所获得的2个MAPK基因均含有3个内含子和4个外显子,2个基因序列只有一个碱基差异,编码氨基酸355个,氨基酸组成无差异;根据生物信息学软件预测编码蛋白没有信号肽,具有2个功能位点,分子量和pI分别为41ku和6.47。该基因编码的蛋白具有高度保守性,与大多数植物致病菌的同源性都在90%以上,不同病原镰刀菌间的同源性接近100%。     

香蕉枯萎病菌菌株致病力分化及其原因研究

以田间表现出枯萎病症状的香蕉和粉蕉组织中分离获得的13株尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为试验材料,分别测定了不同菌株对香蕉(巴西蕉)和粉蕉(广粉一号)的致病力以及在不同培养液中产生的细胞壁降解酶的活性和毒素含量。结果表明:不同菌株对香蕉和粉蕉的致病力存在明显差异;相关性分析显示,不同菌株产细胞降解酶活性与相应菌株侵染引起的寄主病情指数无相关性,产镰刀菌酸的含量与寄主病情指数呈极显著正相关(r=0.9326)。认为香蕉枯萎病菌菌株间产镰刀菌酸能力的不同是导致其致病力出现分化的主要原因之一。     

香蕉枯萎病菌pacC基因的克隆与序列分析

采用PCR和RT-PCR方法扩增尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f sp.cubense,FOC)1号和4号生理小种的pacC基因(FOC1-pacC,FOC4-pacC),对FOC1-pacC和FOC4-pacC相似序列进行搜索和比对,以及对基因编码蛋白进行结构预测,发现FOC1-pacC和FOC4-pacC开放阅读框分别为1 863、1 905 bp,编码634、620个氨基酸,2个小种之间基因序列和氨基酸序列差异明显,FOC1-pacC比FOC4-pacC缺少1个基因片段,FOC-pacC与其相似序列有显著差异,比对缺少2个基因片段;初入侵转录组表达分析说明,2生理小种pacC基因在小种侵染不同品种香蕉过程中表达有差异,FOC1-pacC基因只在粉蕉中检测到表达,而FOC4-pacC则在粉蕉和香蕉中都检测到表达,但在粉蕉中的表达量明显高于香蕉。     

香蕉枯萎病菌的致病性测定及其RAPD分析

以分离自海南、广东的18个香蕉枯萎菌菌株为试验材料,进行致病性测定及RAPD分析.结果表明,分离自粉蕉的12个菌株为1号生理小种,而分离自巴西蕉的6个菌株为4号生理小种;1号生理小种菌株侵染粉蕉的发病率与4号生理小种菌株侵染粉蕉、巴西蕉的发病率都是100%;采自海南三亚市荔枝沟镇的15号菌株为强致病性的菌株,与其它5个4号小种菌株相比,差异显著;RAPD分析能区分1号4号生理小种,菌株的地理来源,致病力;引物OPM-15能用来鉴定1号和4号生理小种.     

香蕉枯萎病菌4号生理小种cat1基因敲除与表型分析

前期蛋白质组学研究发现尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Foc4)中的过氧化氢酶1(cat1)基因受到巴西蕉诱导上调表达,为研究cat1基因在Foc4侵染香蕉过程中的作用,利用同源重组方法敲除Foc4的cat1基因,并对获得的敲除突变体开展表型分析和致病性测定。结果表明:cat1基因缺失对Foc4的菌丝、孢子形态、菌落生长、抗渗透压胁迫和细胞壁选择性压力等没有影响;但引起菌株抵抗外源氧胁迫、细胞壁穿透能力、纤维素利用能力减弱和对巴西蕉的致病性减弱。显示cat1基因的产物通过清除香蕉分泌的活性氧在Foc4对香蕉的致病过程中起作用,并参与病原菌对寄主纤维素成分的代谢。此结果为进一步深入研究香蕉枯萎病菌的致病机理奠定基础。     

香蕉枯萎病菌1号生理小种遗传转化体系的建立

利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法,建立香蕉枯萎病菌1号生理小种(Fusariumoxysporum f.sp cubense race 1)遗传转化体系,并对影响转化效率的因子进行优化,明确了高效转化的条件为:农杆菌OD600为0.15,AS诱导浓度为150μmol/L,诱导时间为7 h,Focr1-N2孢子浓度为1×106个/mL,潮霉素B筛选的浓度为150μg/mL,诱导培养基pH值为5.5,共培养温度为25℃,共培养时间为48 h为最佳条件。构建了包含1 200个突变体的突变体库,并对1 200个突变体进行了致病性测定,初步筛选出致病性丧失突变体20个,致病性显著减弱突变体18个,致病性严重增强突变体53个。     

海南省香蕉枯萎菌nit突变体的筛选及鉴定

将23个有致病力的香蕉枯萎病菌海南菌株及属于1,4号生理小种菌株Foc-18,Foc-38分别在含氯酸盐的KPS培养基上培养,23个菌株共产生142个抗氯酸盐突变体,诱发获得98个不能利用硝酸盐的营养缺陷突变体。将获得的nit突变株作营养体亲和性配对试验,可将23个菌株分为4个亲和群,其中VCG1包括11个菌株,且全为海南分离的1号生理小种,VCG2则由10个海南4号小种菌株组成,广东1号小种Foc-18,4号小种Foc-38分别属于VCG3,VCG4。     

香蕉枯萎菌原生质体形成与再生条件

通过对菌丝菌龄、酶液浓度、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂的种类和浓度等因素的实验研究,得到了一种制备香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC)原生质体的有效方法,并在固体再生培养基上实现了原生质体的再生,再生率为22.5%。     

香蕉枯萎病菌4号生理小种致病性突变体△Focr4-1422生物学特性研究

为研究香蕉枯萎病菌4号生理小种致病性突变体相关致病基因的功能,研究了基因敲除子△Focr4-1422与野生型菌株193之间部分致病性相关的表型差异。结果表明,基因敲除子对巴西蕉的致病性减弱,荧光检测显示菌丝能够从根部扩散到根茎交界处的茎部。△Focr4-1422对细胞壁降解酶的抗性大大增强。基因敲除子△Focr4-1422和野生型193在相同的温度、pH值、光照条件和碳氮源培养基下的生长速率均没有达到极显著差异,两者的菌丝和孢子的致死温度也一致。     

3种碳源条件下香蕉枯萎病菌次生代谢物合成基因的表达谱分析

在前期获得的香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc）转录组数据基础上,本研究利用antiSMASH、PHI-base数据库对3种碳源条件下香蕉枯萎病1号小种（Foc 1）和4号小种（Foc 4）表达的次生代谢物合成基因进行了预测和表达谱分析。结果表明：3种碳源条件下,Foc共有486个候选的次生代谢物合成基因表达,并分类到32个次生代谢产物合成基因簇,其中13个基因可能与Foc的致病性相关。此外,Foc在3种碳源条件下次生代谢物合成基因的表达模式存在明显差异,特别是在寄主细胞壁条件下Foc差异表达的次生代谢物合成基因最多;而且Foc 4相较于Foc 1在侵染寄主细胞壁时有更多的次生代谢物合成基因特异表达或高表达。以上研究结果将为进一步明确次生代谢产物在Foc致病过程中的作用机理提供理论依据。     

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种红色荧光蛋白基因转化

采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化体系,成功地将红色荧光蛋白基因DsRed转入到尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种B2菌株中。在显微镜下观察连续转接6代的转化子,结果都可以观察到很强的红色荧光,表明DsRed基因在转化的B2菌株中能稳定遗传。通过PCR验证,也表明红色荧光蛋白基因DsRed已经转入到尖孢镰刀菌中。对香蕉的致病力测定结果表明,转化子与野生型菌株B2相比没有明显差异。     

香蕉枯萎病菌粗毒素的毒性及其模型

以香蕉组织培养苗为受试植物,蕉苗受毒素作用后的病情指数为指标,测定香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)粗毒素对蕉苗的毒性。结果表明,毒素处理72,96,120和144h引致香蕉苗受害程度(以病情指数表示)达90的剂量(TD90)的质量浓度分别为2057.20,1245.49,549.54,380.19μgmL,蕉苗的受害程度存在着随处理时间延长和处理剂量的增加而加重的趋势。根据毒素对蕉苗的毒性测定结果,建立了蕉苗受毒素作用的“时间-剂量-受害程度”模型。根据模型的分析结果认为,粗毒素引致蕉苗受害的有效时间为96~120h,有效剂量质量浓度为260.0~130.0μgmL。      

尖孢镰刀菌胡麻专化型(Fusarium oxysporum f . sp. lini) ISSR标记聚类分析

结合形态学特征和分子生物学方法对我国尖孢镰刀菌胡麻专化型菌株进行鉴定、聚类分析和遗传变异分析。结合传统分类方法和ITS序列分析,确定6省区96株菌株为尖孢镰刀菌。采用ISSR（简单重复序列区间）分子标记技术对这96株菌株进行分析,12条引物共扩增出800个条带,多态性条带数为797条,多态性为99.62%;在相似性系数为0.88处,96株供试菌株被分为5个类群。聚类结果表明,胡麻枯萎病菌种内存在明显的多态性,且ISSR类群与地理来源存在相关性。