假单胞菌WX14群体感应淬灭酶基因的克隆及其功能研究

本研究采用报告菌平板法及β-半乳糖苷酶活性测定并筛选到10株具有较强降解酰基高丝氨酸内酯（AHLs）能力的细菌,其中菌株WX14降解AHLs能力较强,且菌体和菌体外泌物均具有降解活性。利用PCR法从菌株WX14中克隆到hacA和hacB两个群体感应淬灭酶基因,基因全长分别为2286和2370 bp,氨基酸序列比对分析结果表明,HacA属于阿库来菌素A酰化酶蛋白家族,HacB属于青霉素G酰化酶蛋白家族。这两个基因编码产物均为N末端亲核（N-terminal nucleophile,Ntn）水解酶家族成员。将hacA和hacB导入到软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum后,可减弱该细菌在马铃薯块和白菜上的致病性,因此这2种AHLs降解酶对依赖于群体感应的软腐病有一定防病作用。经16S rDNA序列同源性分析鉴定,3株为假节杆菌Pseudarthrobacter spp.、1株节杆菌Paenarthrobacter sp.、4株假单胞菌Pseudomonas和2株芽胞杆菌Bacillus spp.。     

群体感应淬灭——防治植物细菌病害的新策略

群体感应（quorum sensing,QS）是细菌的一种调控机制,指细菌通过感应特定信号分子的浓度来感知周围环境中自身或其它细菌的数量,并调整相关基因的表达以适应环境的变化。多种植物病原细菌利用QS系统调控致病因子的表达,因此,QS系统可以作为细菌病害防治的新靶点。对细菌QS调控机制的干扰和破坏称为群体感应淬灭（quorum quenching）。本文介绍了QS与植物病原细菌致病性的关系,以及近年来群体感应淬灭研究的新进展。     

水稻病原菌Burkholderia plantarii群体感应和群体淬灭研究进展

植物伯克霍尔德菌Burkholderia plantarii是引起水稻秧苗细菌性立枯病的重要病原菌之一,其侵染性、繁殖力及适应性均很强,严重威胁中国水稻生产。文章围绕B.plantarii的发生、危害及致病机理,着重论述了细菌群体感应系统(quorum sensing,QS)的生理功能及其在B.plantarii致病力调控方面的最新研究进展,并进一步从根际微生物互作角度,综述了种间信号分子对病原菌群体淬灭(quorum quenching)的作用机制,同时结合种间信号分子的独特性,展望了其在新型微生物杀菌剂研发中的重要性和应用潜力。     

酰基高丝氨酸内酯酶SS10的酶学特性及其抗软腐病功能的初探

 N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)作为细菌群体感应中的信号分子参与调节植物病原细菌致病因子的表达。N-酰基高丝氨酸内酯酶(简称AHL内酯酶)通过水解AHL生成酰基高丝氨酸, 使AHL失去活性, 阻断病原菌的群体感应机制, 使病原菌失去致病力。利用谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析柱和凝血酶处理获得纯化的重组AHL内酯酶SS10, 分子量约为28 kD, 其反应的最适pH值为8.0, 在30℃以下稳定性很高。动力学和底物特异性分析表明:AHL内酯酶SS10对所检测的8种AHL具有很强的催化活性, 表明该酶的底物谱可能较宽, 并且具有催化裂解酰基高丝氨酸内酯键的特异性。纯化的AHL内酯酶SS10可以显著降低胡萝卜软腐欧文氏菌胞外果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶的产生量。致病性测定表明, 该重组蛋白对胡萝卜软腐病菌具有较强的抗病活性。     

群体感应信号物质对吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007在杨树内定殖的影响

为了明确杨树溃疡病生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007的群体感应系统是否与其内生定殖相关,本文通过群体感应指示菌紫色杆菌CV026和液相色谱串联四级杆飞行时间质谱技术(HPLC-Q-TOF-MS)确定其群体感应信号物质种类,并利用结晶紫染色、菌体回收、GFP标记等技术,研究其群体感应信号物质对该菌株生物膜及在杨树苗内的定殖能力的影响。结果表明,菌株JK-SH007产生的群体感应信号物质为含8个碳原子酰基侧链的辛酰基-L-高丝氨酸内酯(C8-HSL)。群体感应信号物质C8-HSL的添加对该菌株生物膜及在杨树苗内的定殖能力有影响,并且呈现低浓度促进,较高浓度抑制的规律。C8-HSL的添加与菌株JK-SH007生物膜的OD值和菌体量具有显著相关性,相关系数分别为0.923和0.756。当添加1.0%C8-HSL终浓度达到5×10^-8 g/L时,菌株JK-SH007生物膜的形成量达到峰值。荧光显微镜镜检发现,当添加100μL C8-HSL时,杨树组培苗根和茎中GFP荧光标记的菌株JK-SH007的定殖数量明显较CK多。菌株JK-SH007的群体感应与其在杨树内的内生定殖能力密切相关,群体感应信号物质C8-HSL具有增强菌株JK-SH007内生定殖的能力,同时也表明该物质有利于该菌株生防效果的发挥。     

旋覆花中1-氧-乙酰大花旋覆花内酯的分离分析及抑菌活性测定

为了明确菊科植物旋覆花中主要抑菌活性物质,对旋覆花花序粗提物氯仿萃取组分进行分离,得到化合物1-氧-乙酰大花旋覆花内酯(ABL),运用高效液相色谱法测定花序粗提物中化合物ABL的含量,并测定化合物ABL对黄瓜白粉病菌、黄瓜霜霉病菌、黄瓜灰霉病菌、番茄早疫病菌和致病疫霉等5种植物病原菌的抑菌活性。结果表明,化合物ABL对照品,经紫外光谱、红外光谱、核磁共振等确定结构,纯度为99.5%,符合中药化学对照品含量测定要求。运用高效液相色谱法测定旋覆花花序粗提物中ABL的含量为2.45%,进而计算得到旋覆花花序中ABL的含量约为0.25%。化合物ABL对5种植物病原真菌具有不同的抑菌活性,其中对致病疫霉休止孢萌发抑制作用最强,在浓度为0.1mg/mL时,抑制率可达100%。     

哈密瓜细菌性果斑病菌群体感应系统的检测

本文利用群体感应信号报告菌Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4),在LB报告平板上对燕麦食酸菌西瓜亚种的19个菌株进行了初步检测,发现18个菌株有群体感应信号产生.用琼脂条法对菌株Pslb-94进一步检测,证实菌株Pslb-94存在群体感应系统.提取了该菌株信号物质,反相薄层层析(TLC)检测证明该菌株能产生群体感应信号分子.     

群体感应系统对甜瓜果斑病菌MH21致病力的影响

 以N-乙酰高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactone, AHL）为信号分子的群体感应（quorum-sensing, QS）系统是很多病原细菌的重要致病性调控因子。本文自甜瓜果斑病菌——西瓜食酸菌（Acidovorax citrulli）菌株MH21中克隆到AHL信号合成基因luxI_MH21,并构建了其缺失突变体MΔluxI_MH21及转化有AHL信号降解酶编码基因aiiA和aidH的工程菌株MAiiA和MAidH。信号检测结果显示MΔluxI_MH21、MAiiA和MAidH菌株均无AHL信号产生,同时细菌的游动能力及在基本培养基中的生长速率均显著下降,但对细菌生物膜形成和在非寄主植物烟草上诱导过敏性坏死反应的能力没有影响。盆栽条件下,经低浓度（10⁴ CFU/mL）MΔluxI_MH21、MAiiA和MAidH菌株处理的甜瓜种子萌发后幼苗死亡率显著低于野生型MH21和luxI_MH21基因互补菌株MΔluxI_MH21HB的处理;而高浓度细菌（10⁸ CFU/mL）处理种子后,除MAidH菌株处理引起的死苗率明显低于野生型MH21处理,其他菌株与MH21没有显著差异。子叶注射试验也得到相似的结果,以低浓度细菌（10⁴ CFU/mL）注射甜瓜子叶后发现MΔluxI_MH21、 MAiiA和MAidH菌株甜瓜子叶中的繁殖速率及对子叶的致病力与野生型MH21相比均显著下降;而高浓度细菌（10⁸ CFU/mL）处理子叶时,MΔluxI_MH21和MAiiA菌株与野生菌MH21相比致病力无显著差异,仅有MAidH菌株的致病力明显下降。说明QS系统影响菌株MH21在低细菌浓度下对甜瓜幼苗的致病力,这种作用可能与影响细菌生长有关。     

美国白蛾几丁质脱乙酰酶1(HcCDA1)的克隆表达与酶活测定

利用RACE-PCR方法,扩增得到编码美国白蛾Hyphantria cunea Drury几丁质脱乙酰酶基因HcCDA1.将该基因分别在大肠杆菌BL21和毕赤酵母细胞Pichia pastoris GS 115表达.经诱导表达后,Western blot分析表明HcCDA1在大肠杆菌中成功表达61.8 kD的蛋白,符合预期大小;在毕赤酵母GS115中成功表达80 kD蛋白.酶活性试验显示酵母细胞中表达的重组蛋白酶活力为1.685 U/mL.本研究利用毕赤酵母成功表达具有酶活力的重组HcCDA1蛋白,为进一步明确该蛋白的生理功能提供条件.     

水稻白叶枯病菌群体感应系统对T3SS基因表达的调控作用分析

 为了阐明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)利用DSF信号群体感应(QS)系统对毒性表达进行调控的机理,本研究对编码QS的rpf基因进行了分子鉴定, 分析了Δrpf基因突变体在水稻叶组织中的种群量变化, 利用RT-qPCR方法定量测定了编码T3SS的hrp基因转录本以及rpf基因自身表达。结果表明,rpfF、rpfC和rpfG基因与几种主要植物病原黄单胞菌同源序列高度保守;RpfF是烯脂酰辅酶A水合酶家族成员之一,RpfC含有组氨酸磷酸激酶结构域(HisKA)和磷酸受体结构域(REC),RpfG含有REC和HD-GYP结构域;Δrpf突变体在水稻叶组织中的种群量及其扩展能力均明显下降; hrp基因转录显著地受到QS调控;rpf基因表达与Xoo种群密度密切相关。因此,Xoo QS系统显著地调控了hrp基因的表达,在QS与T3SS表达之间存在一个信号通路。     

Pseudomonassp.1-7中甲基对硫磷水解酶基因的克隆及酶学性质研究

为了研究和分离有机磷降解酶及其编码基因,从农药厂污水处理池的活性污泥中分离出一株可以高效降解甲基对硫磷的细菌 1-7, 经16S rDNA鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.。通过构建基因组文库的方法克隆了 1-7 的甲基对硫磷水解酶基因 ophc3, 该基因全长为975 bp,编码324个氨基酸,其中前24个氨基酸残基可能为信号肽序列。将其在大肠杆菌中表达,并对重组甲基对硫磷水解酶(OPHC3)进行纯化和酶学性质的研究结果表明,其酶促反应最适pH值为8.0,在pH 6.0~10.0的范围内放置30 min酶的相对活性均在70%以上;最适反应温度为45 ℃,但该酶不耐高温,60 ℃下保温10 min,相对活性降至46.77%。     

小麦条锈菌cDNA文库构建和表达序列标签(ESTs)分析

 小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)是全世界范围内小麦生产上的重要病原真菌, 但是对小麦条锈菌的基因组和基因功能却了解甚少。为了促进小麦条锈菌基因组学的发展和大规模基因发现, 我们以噬菌体λTrip1Ex2为载体, 采用SMART技术构建了小麦条锈菌萌发夏孢子的cDNA文库。原始文库的滴度为1.1×10⁶pfu/mL, 平均插入片段长度为750 bp。从文库中随机挑取279个cDNA克隆测序, 分析发现这些ESTs的平均GC含量为45.08%。通过聚类分析, 279个ESTs拼接成31个contigs和80 singletons。BLASTx分析表明, 47%的ESTs与GenBank中报道的功能已知或未知蛋白具有相似性。tBLASTx分析表明12个uniseqs与EST数据库中的序列具有相似性, 其中9个是来自担子菌的cDNA文库。几个EST与已知的真菌致病相关基因具有高度相似性。RT-PCR分析了几个基因在小麦条锈菌侵染过程中的表达水平。这些结果为小麦条锈菌夏孢子萌发以及侵染寄主过程中的基因表达研究奠定了很好的分子生物学基础。     

芽孢杆菌B11拮抗蛋白性质及其对西瓜枯萎病菌的作用机理

芽孢杆菌(Bacillus sp.)B11分离自土壤,其拮抗蛋白粗提液在温度60、80℃各处理30 min后仍能保持抗菌活性,对紫外线、蛋白酶K、RNase处理稳定,对胃蛋白酶、胰蛋白酶、氯仿部分敏感,作用活性pH(pH4～10)范围较宽.B11拮抗蛋白对西瓜枯萎病菌具有较强的拮抗作用,其抑菌机制主要使病菌菌丝畸形,细胞质浓缩,孢子不萌发或萌发异常.     

Characterization of Puccinia graminis f. sp. tritici isolates derived from an unusual wheat stem rust outbreak in Germany in 2013

An unusual stem rust infestation occurred in German wheat fields in summer 2013. This study analysed 48 isolates derived from 17 Puccinia graminis f. sp. tritici (Pgt) samples and six races were identified: TKTTF, TKKTF, TKPTF, TKKTP, PKPTF and MMMTF. Infection type and genotypic data confirmed that none of these races belonged to the TTKS (Ug99) race group. German isolates of race TKTTF are phenotypically different to the ones responsible for the stem rust epidemic in Ethiopia in 2013–2014. Forty isolates were genotyped using a custom SNP array. Phylogenetic analysis showed that these 40 isolates represented two distinct lineages (clade IV and clade V). Thirty‐eight isolates clustered into clade IV, which previously was defined by Ethiopian isolates of race TKTTF. Race TKKTP is of special concern due to its combined virulence to stem rust resistance genes Sr24, SrTmp and Sr1RS^Amigo. The vulnerability to race TKKTP in US and international winter wheat was confirmed as 55% of North American and international cultivars and breeding lines resistant to race TTKSK (Ug99) became susceptible to TKKTP. Races identified in Germany in 2013 confirmed the presence of virulence to important resistance genes that are effective against race TTKSK. This information should be useful for breeders to select diverse and effective resistance genes in order to provide more durable stem rust resistance and reduce the use of fungicides.     

Characterization and taxonomic reassessment of the box blight pathogen Calonectria pseudonaviculata,introducing Calonectria henricotiae sp. nov.

Calonectria pseudonaviculata, the causal agent of the disease of Buxus spp. known as ‘box blight’, was first detected in the mid‐1990s in the UK and New Zealand. Since then, the geographic range of box blight has rapidly expanded to at least 21 countries throughout temperate regions of the world, causing significant losses in nurseries, gardens and wild boxwood populations. This study determined the genetic diversity in a collection of 234 Calonectria isolates from diseased Buxus plants, originating from 15 countries and four continents. Two genetic clades, G1 and G2, were identified within this sample using multilocus phylogenetic analysis. The application of genealogical concordance phylogenetic species recognition criteria using four independent nuclear loci determined that the Calonectria isolates in these two clades are separate phylogenetic species. The isolates in the G1 clade were upheld as C. pseudonaviculata sensu stricto. Based on phylogenetic distinctiveness and the lack of mating, a new species is proposed, Calonectria henricotiae sp. nov., for the Calonectria isolates in the G2 clade. A PCR‐RFLP assay and real‐time PCR assays were developed to easily and reproducibly differentiate these species. To assess the practical implications of the identification of the two species, their physiology, fungicide susceptibility and pathogenicity were compared. No differences in pathogenicity were observed. However, C. henricotiae isolates exhibited greater thermotolerance and reduced sensitivity to specific triazole as well as strobilurin fungicides. The identification of a second phylogenetic species causing box blight may have a substantial impact on the epidemiology and control of this destructive disease.     

水稻干尖线虫14-3-3(Ab-14-3-3-a)基因克隆与功能分析

水稻干尖线虫是水稻上重要的寄生线虫,严重危害水稻安全生产。14-3-3蛋白调控生物体的细胞代谢、生长发育和逆境适应等一系列生物过程。本研究通过c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)分离获得了一个水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)14-3-3基因,命名为Ab-14-3-3-a。Ab-14-3-3-a全长c DNA序列含有59 bp的5'非翻译区(UTR)、编码251个氨基酸756 bp的开放阅读框。Ab-14-3-3-a DNA序列包含4个外显子和3个内含子。Ab-14-3-3-a蛋白与其他植物寄生线虫14-3-3蛋白氨基酸序列高度相似,系统发育树显示与植物寄生线虫位于同一进化分支。原位杂交显示Ab-14-3-3-a特异定位于成虫的背食道腺细胞中,表明其在线虫取食和寄生过程中发挥潜在功能。qRT-PCR显示,Ab-14-3-3-a在水稻干尖线虫各个龄期均表达,其中在成虫表达水平最高,而在发育过程中幼虫表达水平最低。当线虫取食不同寄主时,Ab-14-3-3-a的表达水平具有差异性,线虫取食感病水稻早期,Ab-14-3-3-a表达水平上升1.5倍,而取食灰葡萄孢(Botrytis cinerea)时Ab-14-3-3-a表达可提高数百倍。利用体外RNA干扰技术将Ab-14-3-3-a的表达进行有效抑制,结果显著影响了线虫的产卵、成虫发育以及线虫种群数量。综上,Ab-14-3-3-a参与调控水稻干尖线虫的取食行为和发育进程。本研究相关结果有助于拓展植物寄生线虫14-3-3蛋白功能,为深入研究线虫与植物互作机制提供了理论依据。     

GA1-2菌株的分离鉴定及其对香蕉尖孢镰刀菌的抑菌效果

为了从土壤中分离筛选对香蕉尖孢镰刀菌具有良好拮抗作用的放线菌,采用平板稀释涂布法从四川省会理县干热河谷小麦根际土壤中进行放线菌分离,并采用平板对峙法和孢子萌发法进行筛选,通过形态特征、培养特征、生理生化特征以及16S r DNA序列分析对筛选菌株进行鉴定。结果表明,从四川省会理县干热河谷小麦根际土壤筛选获得一株对香蕉尖孢镰刀菌4号生理小种Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4(FOC4)菌丝和孢子萌发都有很强抑制作用的菌株GA1-2,对FOC4菌丝和孢子萌发抑制率分别为36.34%和94.81%。菌株GA1-2与薰衣草灰链轮丝菌Streptoverticillium lavenduligriseum的亲缘关系最近,相似率达99.85%,且其形态特征、培养特征、生理生化特征也与薰衣草灰链轮丝菌基本相符,因此将菌株GA1-2初步鉴定为薰衣草灰链轮丝菌。     

芽孢杆菌B11拮抗蛋白性质及其对西瓜枯萎病菌的作用机理

芽孢杆菌(Bacillus sp．)B11分离自土壤，其拮抗蛋白粗提液在温度60、80℃各处理30min后仍能保持抗菌活性，对紫外线、蛋白酶K、RNase处理稳定，对胃蛋白酶、胰蛋白酶、氯仿部分敏感，作用活性pH(pH4～10)范围较宽。B11拮抗蛋白对西瓜枯萎病菌具有较强的拮抗作用，其抑菌机制主要使病菌菌丝畸形，细胞质浓缩，孢子不萌发或萌发异常。