球孢白僵菌HsbA蛋白的原核表达及免疫定位

【目的】明确虫生真菌球孢白僵菌（Beauveria bassiana）疏水表面结合蛋白HsbA（hydrophobic surface binding protein A）的致病过程。【方法】对HsbA进行克隆、亚克隆和原核表达,根据纯化后的蛋白制备多克隆抗体并进行抗原性分析,利用免疫电镜对HsbA蛋白进行定位观察。【结果】原核表达系统成功诱导了白僵菌的HsbA融合蛋白,制备多克隆抗体经Western杂交分析表明,该多抗能特异性识别目的蛋白。免疫电镜结果显示,HsbA蛋白在孢子和菌丝中呈随机分布。正常生长状态下,菌丝中的HsbA蛋白数量要明显多于孢子中被标记的数目,此外,孢子在侵染状态和正常生长状态下的HsbA蛋白数量也有显著差异,侵染状态下孢子的HsbA蛋白表达量更高,但菌丝在这2种状态下均呈现高表达。感染虫体中HsbA蛋白被标记的部位集中在体壁。【结论】原核表达实现了HsbA蛋白的高效表达,且制备的多克隆抗体具有较好的免疫原性。此外,免疫定位表明HsbA蛋白与菌丝的生长有关,并在白僵菌致病过程中参与了吸附作用,其作用部位位于昆虫体壁。     

家蚕感染球孢白僵菌后4种抗菌肽基因的表达分析

【目的】阐明家蚕(Bombyxmori)抗菌肽对球孢白僵菌感染的应答模式,为揭示家蚕及鳞翅目昆虫抗真菌机制提供参考依据。【方法】利用实时荧光定量PCR检测家蚕被球孢白僵菌感染后抗菌肽基因cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme的表达情况,比较4种抗菌肽在家蚕脂肪体、血淋巴、马氏管和中肠中不同时间点的表达差异。【结果】经球孢白僵菌诱导后,cecropinA基因在家蚕脂肪体中的最高上调表达倍数为10.2倍,在血淋巴中的最高上调表达倍数为13.2倍,在马氏管中感染初期显著上调表达(P<0.05,下同),在中肠中感染后期显著上调表达;gloverin2基因在家蚕脂肪体中出现2次上调表达过程,最高上调表达倍数为15.7倍,在血淋巴中感染前期呈上调表达,在马氏管中略呈下调表达,中肠中的gloverin2基因在接种后16~48 h呈显著上调表达,最高上调表达倍数为6.7倍;lebocin1/2基因在家蚕脂肪体和血淋巴中的最高上调表达倍数分别为19.4和22.4倍,在马氏管中仅在接种后16 h呈显著上调表达,在中肠中则是接种后24~48 h呈显著上调表达;lysozyme基因在家蚕脂肪体中显著上调表达,在血淋巴和马氏管中感染初期也呈显著上调表达,但在中肠中的表达无明显规律。【结论】cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme基因在球孢白僵菌侵染家蚕的过程中均不同程度地被诱导上调表达,尤其在家蚕脂肪体和血淋巴中较明显,由此推测这4种抗菌肽在抵御球孢白僵菌的侵染过程中发挥重要作用。     

球孢白僵菌不同分生孢子特异性表达蛋白分析与筛选

对球孢白僵菌(Beauveria bassiana(Bais.)Vuill)D1-5菌株的3种分生孢子气生孢子、芽生孢子和深层孢子进行电镜观察,并利用双向凝胶电泳技术对3种孢子的特异性表达蛋白进行分析与筛选。结果显示,电镜下气生分生孢子呈球形,外周有棒状结构包裹,具有明显的疏水特性;芽生孢子为圆柱形,大小不均一,表面光滑;深层孢子球形透明,大小均一,表面粗糙,3种分生孢子孢子壁厚度差异不明显。经双向凝胶电泳对3种分生孢子进行特异性表达蛋白分离后,使用PDquest软件对结果进行分析,深层分生孢子与芽生分生孢子蛋白表达图谱相比较,有20个蛋白质表达量发生2倍以上改变,其中8个蛋白质表达量上调,12个蛋白质表达量下调;气生分生孢子与芽生分生孢子蛋白表达图谱相比较,有57个蛋白质表达量发生2倍以上改变,其中43个蛋白质表达量上调,14个蛋白质表达量下调;深层分生孢子与气生分生孢子蛋白表达图谱相比较,有66个蛋白质表达量发生2倍以上改变,其中8个蛋白质表达量上调,58个蛋白质表达量下调。     

两种转Bt基因棉杀虫蛋白Cry1Ac表达量的检测

用EnvirologixCry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因的棉花品系 (NUCOTN33B、NUCOTN99B) 以及常规对照品系 (苏棉 12) 不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量。结果表明, 两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势, 花铃期 (NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为 4 43和 2 93μg·g-1 ) 和吐絮期 (3 87和 2 86μg·g-1 ) 的含量分别降至苗期第 6叶 (7 64和 8 38μg·g-1 )的 58%、35%和 51%、34%; 相同时期的主茎嫩叶和侧枝嫩叶中Cry1Ac的含量均显著高于蕾及蕾的苞叶, 前两者均为后两者的两倍以上。     

球孢白僵菌分子生物学研究进展

目前,球孢白僵菌已被广泛应用于农林害虫的生物防治,但球孢白僵菌及其制剂存在击倒害虫时间长、受环境影响较大和防效不稳定等弊端.分别从球孢白僵菌入侵害虫过程中相关酶类(蛋白酶、几丁质酶)基因的克隆与功能分析、转基因菌株构建、抗逆分子生物学等方面对球孢白僵菌的分子生物学最新研究进展进行了阐述,并对其未来发展进行了展望.     

两种转Bt基因棉杀虫蛋白Cry1Ac表达量的检测

用Envirologix Cry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因的棉花品系(NUCOTN33B、NUCOTN99B)以及常规对照品系(苏棉12)不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量.结果表明,两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势,花铃期(NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为4.43和2.93 μg&#183;g-1)和吐絮期(3.87和2.86 μg&#183;g-1)的含量分别降至苗期第6叶(7.64和8.38 μg&#183;g-1)的58%、35%和51%、34%;相同时期的主茎嫩叶和侧枝嫩叶中Cry1Ac的含量均显著高于蕾及蕾的苞叶,前两者均为后两者的两倍以上.     

几丁质诱导球孢白僵菌产酶及杀虫作用研究

利用胶态几丁质诱导培养基液体发酵球孢白僵菌Bz4菌株,通过比色法测定发酵液中寡糖、几丁质酶的变化情况,并应用浸渍法测定其产生的孢子悬液对粘虫的致死能力,明确白僵菌Bz4菌株的应用价值。结果表明:球孢白僵菌Bz4菌株在供试的不同胶态几丁质浓度液体培养基中,均以培养5d时产生的氨基寡糖量最高,而培养6d时几丁质酶活力最大。利用几丁质培养基中制得的孢子悬液对粘虫幼虫具有较强的致死作用,致死中浓度约为1.04×10~5个·mL~(-1),其致死中时间为6~7d。     

茶卷叶蛾寄生真菌球孢白僵菌几丁质酶基因的克隆与序列分析

球孢白僵菌是最重要的虫生真菌之一,在农林害虫生防中发挥着重要的作用。本研究从茶卷叶蛾球孢白僵菌JYBb201-11菌株中克隆了几丁质酶Bbchit1基因(GenBank登录号:HQ435871)。根据GenBank上昆虫病原真菌几丁质酶基因序列同源性设计引物,分别进行DNA-PCR和总RNA-RT-PCR反应,对得到的目的片段,回收纯化后通过PMD18-T载体转化到大肠杆菌DH5α中,获得几丁质酶基因序列的重组质粒PMD18-chit,并测序。结果表明,DNA-PCR和总RNA-RT-PCR获得的基因序列完全一样,都是一个完整ORF序列,含1 047bp核酸序列,编码348个氨基酸,信号肽长度为22个氨基酸,成熟蛋白理论分子量约为36.78kD,理论等电点为5.95。该蛋白序列中包含2个保守区域,即底物结合区域(SIGG)和几丁质的活性位点(DGIDIDIE),该蛋白可归为几丁质酶18族V类。氨基酸序列同源性分析表明,球孢白僵菌JYBb201-11菌株几丁质酶与球孢白僵菌Bb0062菌株(AAN41259)和NCIM1216菌株(ACF32998)几丁质酶chit1氨基酸序列同源性都达99.43%;与球孢白僵菌MTCC 2028菌株(ACZ28129)几丁质酶chit1氨基酸序列同源性达98.28%。     

苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因定位研究进展

苏云金芽孢杆菌是目前应用最广泛的杀虫微生物,其活性成分主要是杀虫晶体蛋白、营养期杀虫蛋白和几丁质酶等,本文对编码这些蛋白的基因的定位作一综述,有助于进一步研究基因结构、功能、表达和调控.     

两种纯化苏云金杆菌HD-73毒素蛋白方法的比较研究

以苏云金杆菌HD 73伴胞晶体为活性蛋白,经胰蛋白酶酶解后分别用阴离子交换柱分离纯化法和等电点纯化法进行纯化,纯化后得到的样品进行SDS-PAGE分析,结果表明,两种分离纯化都获得67kDa的毒素蛋白,但是离子交换柱纯化法样品消耗量大,得率低;而等电点沉淀法样品消耗少,得率高。     

Yield, Leaf Senescence, and Cry1Ac Expression in Response to Removal of Early Fruiting Branches in Transgenic Bt Cotton

Two-year field experiments were conducted at Linqing, Yellow River valley of China, to study the plant response to the removal of early fruiting branches in transgenic Bt （Bacillus thuringiensis） cotton （Gossypium hirsutum L.） from 2003 to 2004. Plants were undamaged and treated by removing two basal fruiting branches （FB） at squaring to form the control and the removal treatment, respectively. The plant height, leaf area （LA）, dry weight of fruiting forms （DWFF）, the number of fruiting nodes （NFN）, photosynthetic （Pn） rate, and levels of leaf chlorophyll （Chl）, N, P, K, and Cry lAc protein in main- stem leaves were measured at a 10- or 20-d interval after FB removal, and the sink/source ratio as indicated by NFN/LA and DWFF/LA was determined. FB removal significantly increased the plant height, LA, and plant biomass in both years. Lint yields were increased 7.5 and 5.2% by removal compared with their controls in 2003 and 2004, respectively. Significant increases in boll size （5.7 and 5.1%） were also observed in removal than in control for both years. Either NFN/LA or DWFF/LA was significantly reduced by removal before 40 d after removal; however, both NFN/LA and DWFF/LA were significantly enhanced by FB removal at 80 d after removal compared to the untreated control. There was no significant difference in fiber quality in the first two harvests between removal and control, but fiber strength and micronarie in the third harvest were significantly improved by FB removal. In terms of leaf Chl, Pn rate, levels of total N, P, and K in late season, leaf senescence was considerably delayed by FB removal. Levels of CrylAc protein in the fully expanded young leaves were considerably higher in FB-excised plants than in control, indicating FB removal enhanced CrylAc expression. It is suggested that the yield and quality improvement with FB removal may be attributed to the increased NFN/LA or DWFF/LA in late season and delayed leaf senescence, respectively. FB removal can be a potential p     

转Vip3Aa基因的球孢白僵菌工程菌的构建及其对马尾松毛虫毒力的增效作用

根据苏云金杆菌营养期杀虫蛋白基因Vip3Aa序列设计全基因扩增引物,并在引物两端添加合适的酶切位点进行PCR扩增,纯化的PCR产物和载体pbarGPE1分别经Xho I和EcoR I双酶切、连接,构建真菌表达载体pbarGPE1-vip3Aa。将构建好的质粒经Sca I酶切线性化后,利用芽生孢子转化法转入昆虫病原真菌球孢白僵菌Bb13菌株内,得到白僵菌工程菌株Bb13V。RT-PCR结果证明Vip3Aa在工程菌株中已得到成功转录。在室内恒温25℃条件下,用喂食、喷雾以及两者相结合的方法,分别测定1×105、1×106、1×107、1×108和2×108孢子.mL-1 5个不同孢子浓度下原始菌株和工程菌株对二龄马尾松毛虫的毒力。结果表明,在前4种不同浓度的处理条件下,采取3种不同的处理方式,工程菌株均比喷雾处理的原始菌株致死率提高30%以上;喷雾处理的毒力提高33.6~62.1倍;喂食处理的致死率均高于喷雾处理。在1×108孢子.mL-1浓度下,喂食处理的致死率显著高于喷雾处理,致死中时缩短6.89 d。因此,Vip3Aa基因在转入白僵菌后得到了表达,从而赋予白僵菌可观的胃毒作用,使得工程菌对松毛虫的毒力明显增强。     

Cry1Ab13杀虫基因的PCR诱变及功能验证

【目的】通过易错PCR技术克隆一种新的Cry1Ab13基因,以利用Cry类Bt基因提高作物抗虫性,丰富基因资源。【方法】利用易错PCR技术对苏云金芽孢杆菌Cry1Ab13基因进行随机诱变,构建突变体文库,筛选获得突变株Cry1Ab13-1,将该基因构建原核重组表达载体后转化到大肠杆菌中进行异源表达,并利用表达的目的蛋白进行抗虫鉴定。【结果】序列分析表明,突变株Cry1Ab13-1基因序列全长2 036bp,与原始碱基序列的一致性为97.79%,有2个碱基发生突变,导致该基因编码的氨基酸序列中有2个氨基酸改变,分别是第130位由脯氨酸变成丝氨酸,第383位由丝氨酸变成苏氨酸;改变后的氨基酸序列与原始氨基酸序列一致性为96.97%。在线分析表明,该基因与已知过敏源的序列同源性低于35%,不存在致敏性。SDS-PAGE电泳分析表明,表达蛋白分子质量大小为79.5ku,与预期结果相符。抗虫鉴定表明,处理72h时表达的目的蛋白对小菜蛾(Plutella xyllostella)幼虫的致死率达87.88%,明显高于未突变基因对照组的幼虫死亡率;对亚洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)幼虫的致死率达81.11%,而且存活的亚洲玉米螟幼虫的生长发育受到明显抑制。【结论】成功克隆了Cry1Ab13-1抗虫基因,且该基因对小菜蛾幼虫和亚洲玉米螟幼虫均具有高效的杀虫活性。     

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)NO6的分离、鉴定与除草活性

旨在研究土壤真菌NO6发酵液中对杂草野燕麦具有抑制作用的次生代谢产物。从坎布拉土壤中分离纯化微生物菌株,利用培养皿分析法测定其次级代谢产物除草活性,利用菌落形态和ITS序列对除草活性最高的菌株进行鉴定,进而利用正相硅胶柱色谱、TLC和半制备HPLC方法对其代谢产物中的除草活性物质进行分离纯化。结果表明,共分离获得9株微生物菌株,其中菌株NO6对野燕麦的除草活性最高,将其鉴定为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。发酵液经乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析和半制备HPLC分离纯化得到保留时间为66.868min的除草活性物质3。     

重庆地区3株球孢白僵菌的分离鉴定

我国是农业和林业大国,农林害虫的危害造成了严重的经济损失,同时化学防治也导致了环境污染等诸多问题.因此,开发基于虫生真菌的生物农药意义重大.为了丰富虫生真菌菌种资源,以野外感染白僵菌的蝽蟓及室内感染的家蚕僵虫样品为实验材料,采用多种培养基,分离获得了3株虫生真菌菌株,分别为来自蝽蟓的NB-1,PW-1菌株和来自家蚕的JCY菌株,形态学观察结果表明,各菌株的培养特征与白僵菌属菌株较为一致;分子生物学鉴定表明,各菌株rDNA ITS序列与GenBank中白僵菌属球孢白僵菌多个菌株同源性高达99%,因此将菌株NB-1,PW-1和JCY均鉴定为球孢白僵菌(Beauveria bassiana);生物学特性观察发现不同菌株间分生孢子产生量存在显著差异,分离自蝽蟓僵虫的球孢白僵菌PW-1,NB-1分生孢子产量分别为(7.55±0.15)×10~7个/mL,(6.30±0.40)×10~7个/mL,均高于家蚕分离株JCY,其产孢量仅为(3.02±0.22)×10~7个/mL.结论为后续研发针对包括草地贪夜蛾在内的农林害虫生物杀虫剂奠定了菌种基础.     

球孢白僵菌Bb070817菌株对番石榴实蝇的室内毒力

为研究球孢白僵菌(Beauveria bassiana) Bb070817菌株对番石榴实蝇Bactrocera correcta ( Bezzi )的毒力效果,采用喷雾法和浸渍法以不同密度球孢白僵菌(Beauveria bassiana) Bb070817菌株的分生孢子液处理番石榴实蝇Bactrocera correcta ( Bezzi )的成虫、幼虫和蛹,并分别测定对成虫、幼虫和蛹的室内毒力。结果表明,成虫的累积校正死亡率最高,为 86.12%,其致死中时间（LT₅₀）为 4.66 d,致死中密度（LCT₅₀）为2.948 5×10⁵ mL^-1。幼虫的累积校正死亡率为 88.42%,其LT₅₀为4.47 d, LCT₅₀为2.769 5×10⁵ mL^-1。蛹的累积校正死亡率是 83.91%,其LT₅₀为5.16 d,LCT₅₀ 为3.155 7×10⁵ mL^-1,说明该菌株对番石榴实蝇具有较强的毒力。     

球孢白僵菌与8种杀虫剂的相容性及其对烟粉虱的室内联合毒力

研究8种杀虫剂与球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的相容性及混配后对烟粉虱若虫的毒力.以杀虫剂的田间推荐浓度为初始浓度,采用血球计数法和十字交叉法分别测定其对球孢白僵菌孢子萌发、产孢量和菌丝生长的影响;通过浸渍法测定杀虫剂与球孢白僵菌的室内毒力.结果表明,8种杀虫剂对孢子萌发,菌丝生长及产孢量均有抑制作...     

球孢白僵菌与玫烟色棒束孢制剂对柑橘木虱的防治

【目的】研究2株高致病力菌株球孢白僵菌Beauveria bassiana和玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea菌株对柑橘木虱Diaphorina citri不同虫态的致病力及田间防控效果。【方法】球孢白僵菌和玫烟色棒束孢孢子稀释成1×104、1×105、1×106、1×107、1×108mL~(-1),室内喷施法研究其对木虱低龄、高龄若虫与成虫的侵染致死效果;在笼罩条件下研究其在半田间条件下对柑橘木虱成虫种群的控制作用。【结果】2种真菌制剂对柑橘木虱低龄若虫的致病力高于高龄若虫。7 d后球孢白僵菌和玫烟色棒束孢对柑橘木虱高龄若虫的LC50值分别为3.6×104和5.2×104mL~(-1),对低龄若虫的LC50值分别为3.5×104和4.2×104mL~(-1),而对柑橘木虱成虫的LC50值分别为1.4×105和1.6×105mL~(-1)。在半田间条件下,球孢白僵菌和玫烟色棒束孢对柑橘木虱成虫的LC50值分别为3.7×105和1.2×106mL~(-1)。同一孢子浓度对柑橘木虱的致死率室内效果优于半田间。2种真菌制剂对柑橘木虱成虫的致死时间与孢子浓度有关,LT50随着真菌孢子悬浮液浓度的增加而递减,球孢白僵菌孢子浓度为1×105~1×108mL~(-1)时,柑橘木虱成虫的LT50值为5.2~4.4 d;玫烟色棒束孢孢子浓度为1×106~1×108mL~(-1)时,柑橘木虱成虫的LT50值为5.3~4.9 d。【结论】球孢白僵菌和玫烟色棒束孢菌株对柑橘木虱有良好的生物防治效果,柑橘木虱各虫态的死亡率与病原真菌的孢子浓度正相关。     

球孢白僵菌与苦参碱混配对烟粉虱的毒力与田间防效

旨在探讨球孢白僵菌与8种杀虫剂的相容性以及球孢白僵菌与苦参碱混配对温室烟粉虱的防治效果。首先进行8种杀虫剂与球孢白僵菌的相容性试验,然后选择相容性较高的苦参碱与球孢白僵菌的LC_(50)浓度以9∶1、4∶1、1∶1、1∶4和1∶9体积比进行混配,以共毒系数对其毒力进行评价。结果表明:苦参碱与球孢白僵菌的相容性最好,尤其在10倍稀释度下,苦参碱对球孢白僵菌孢子萌发、菌丝生长及产孢抑制率分别为14.44%、10.17%和12.63%。苦参碱与球孢白僵菌体积比为4∶1时,共毒系数为293,增效作用最明显。综上所述,苦参碱与球孢白僵菌在LC_(50)浓度下以4∶1体积比混配具有极显著的增效作用。     

球孢白僵菌对亚洲玉米螟血细胞毒力和形态的影响

【目的】测定球孢白僵菌Beauveria bassiana对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis血细胞系SYSU-Of He-C的影响,为促进球孢白僵菌在防治亚洲玉米螟中的应用提供理论依据。【方法】采用MTT和CCK-8法测定球孢白僵菌对亚洲玉米螟血细胞系SYSU-Of He-C的毒力,通过光学显微镜与扫描电镜观察球孢白僵菌生长及其对SYSU-Of He-C细胞的影响。【结果】球孢白僵菌分生孢子处理SYSU-Of He-C细胞24 h后,MTT法的IC_(50)值为2.8×10~5mL~(-1),CCK-8法的IC_(50)值为1.4×10~5mL~(-1)。光学显微镜实时监测发现,在SYSU-Of He-C细胞对数期接种球孢白僵菌浓度为3.5×10~4mL~(-1)时,球孢白僵菌具有明显竞争力,未发现囊胞化与吞噬等细胞免疫现象;处理10 h后,球孢白僵菌分生孢子开始萌发长出菌丝,而SYSU-Of He-C细胞减少且开始变形;处理24 h,球孢白僵菌几乎长满整个视野;SYSU-OfHe-C细胞从近似圆形变长或者变为不规则形状,出现聚集、破碎、胞内空泡、瘤状突起,以及被白僵菌菌丝穿透等现象。【结论】球孢白僵菌可改变亚洲玉米螟血细胞系SYSU-Of He-C的细胞形态,但不能使其发生细胞免疫现象。