RNAi介导的棉铃虫细胞色素P450酶系几种组分基因沉默对高效氯氰菊酯毒力的影响

为进一步明确细胞色素P450 CYP6B7、细胞色素b5(cytochrome b5,Cyt-b5)和细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)在棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)对拟除虫菊酯类药剂抗性中的作用,通过RNA干扰技术沉默了抗氰戊菊酯棉铃虫中3种组分的基因,并测定基因沉默后高效氯氰菊酯对棉铃虫的毒力变化.结果显示,经单个CYP6B7或CYP6 B7与CPR、Cyt-b5基因的双链RNA注射处理后12 ～ 48 h,棉铃虫幼虫死亡率在19.4％ ～ 92.5％之间,明显高于空白对照处理的10.47％ ～ 62.87％;高效氯氰菊酯对基因沉默后幼虫的LD50值随着时间的延长而逐渐下降,12～48 h的LD50值在0.97～2.97 μg/头之间,而空白对照处理为2.27 ～ 3.57μg/头.研究表明,细胞色素P450 CYP6B7,或CYP6B7与CPR、Cyt-b5基因的沉默,可提高高效氯氰菊酯对抗性棉铃虫的毒力,进一步证明了CYP6B7、CPR和Cyt-b5在棉铃虫对菊酯类药剂抗性中起着重要作用.     

棉铃虫小分子热激蛋白sHSP22.0基因的克隆及表达谱分析

棉铃虫Helicoverpa armigera是一种重要的农业害虫,本文旨在研究小分子热激蛋白在其生长发育过程、抵御高温及Cry1Ac杀虫蛋白中的功能。利用PCR结合RACE技术克隆了棉铃虫sHSP22.0(small heat shock protein 22.0)基因,通过生物信息学软件分析了棉铃虫sHSP22.0基因序列,利用实时荧光定量qRT-PCR分析了该基因在棉铃虫不同生长发育阶段和组织中的表达模式;并分析了该基因受高温及Cry1Ac全长蛋白的诱导效应。获得了棉铃虫sHSP22.0(GenBank登录号: XP_021196802.1) 761 bp cDNA片段,其开放阅读框576 bp,编码191个氨基酸,具有小分子热激蛋白典型的α-晶体结构域(α-crystallin domain,ACD)。sHSP22.0在棉铃虫4龄和5龄期特异性表达,尤其在5龄幼虫的表皮、中肠和后肠内特异性表达。该小分子热激蛋白受温度和Cry1Ac全长蛋白的诱导后显著高表达。sHSP22.0不仅在暴食期及肠道内特异性表达,而且响应Cry1Ac全长蛋白的诱导,表明它在棉铃虫消化吸收及抵御外源物的活动中可能起到重要的作用。     

甘蓝夜蛾CYP9A90基因的克隆及溴氰菊酯对其诱导表达

P450 CYP9A家族基因与昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性相关。为证实溴氰菊酯对甘蓝夜蛾CYP9A基因的诱导效果,本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆获得甘蓝夜蛾CYP9A基因,real-time PCR检测该基因在甘蓝夜蛾不同组织中的表达差异及溴氰菊酯处理甘蓝夜蛾5龄幼虫不同时间后该基因相对表达量变化,研究结果可为甘蓝夜蛾对溴氰菊酯的抗性治理提供依据。结果表明:克隆得到甘蓝夜蛾CYP9A基因cDNA全长序列,该序列包含1 828bp,包括1个125bp的5′非编码区,1个104bp的3′非编码区和1个1 599bp的开放阅读框,编码532个氨基酸,分子量约为61.1kDa,等电点为8.84,GenBank登录号为KR676343,被国际P450命名委员会命名为CYP9A90。Real-time PCR分析结果表明,该基因在甘蓝夜蛾5龄幼虫6个组织中表达情况不同,其中在脂肪体中表达量最高。低剂量溴氰菊酯作用后不同时间点CYP9A90mRNA总体呈现诱导表达趋势。     

棉铃虫V-ATP酶亚基A基因克隆及表达谱分析

为探索棉铃虫Helicoverpa armigera液泡型ATP酶(vacuolar-type proton ATPase,V-ATP酶)亚基A对棉铃虫生长发育的影响及其在Bt杀虫机制中的作用,采用PCR结合RACE技术克隆了棉铃虫V-ATP酶亚基A基因序列,通过实时荧光定量PCR技术测定了其在棉铃虫不同发育历期和幼虫肠道不同组织中的表达量;并比较了4龄幼虫取食含Cry1Ac蛋白饲料后中肠中该基因表达量的变化。结果显示,棉铃虫V-ATP酶亚基A基因全长2 578 bp(Gen Bank登录号KP090287),开放阅读框1 863 bp,编码621个氨基酸。V-ATP酶亚基A高度保守,不同物种间氨基酸序列同源性大于90%。V-ATP酶亚基A在棉铃虫整个生育期都有表达,在4龄幼虫体内表达量最高,是卵期的3.00倍;在幼虫肠道不同组织中,中肠中表达量最高,是后肠中的2.65倍。4龄棉铃虫幼虫取食含Cry1Ac蛋白的人工饲料后,中肠V-ATP酶亚基A的表达受到抑制,表达量为对照的0.39~0.81倍。表明V-ATP酶亚基A基因可能参与棉铃虫的生长发育和代谢过程,并可能与抵御Cry1Ac的毒杀作用有一定关系。     

棉铃虫载脂蛋白受体基因克隆及转录分析

载脂蛋白受体(lipophorin receptor, LpR)在昆虫体内脂质转运中发挥重要作用。为了明确棉铃虫载脂蛋白受体基因在其卵巢发育及饥饿胁迫中的功能, 本研究克隆了棉铃虫 HaLpR 基因的cDNA序列(GenBank登录号KU355886.1), 全长3 117 bp, 开放阅读框为2 643 bp, 编码880个氨基酸; 其氨基酸序列包含典型的低密度脂蛋白受体结构域, 与其他鳞翅目昆虫的LpR相似度>80%。荧光定量PCR检测结果显示, HaLpR 在雌蛾的卵巢和脂肪体组织中相对转录水平最高; 在雌蛾卵子发生期均有转录, 在雌蛾羽化后3 d表达量达到最高峰; 饥饿处理会抑制 HaLpR 在雌蛾卵巢和脂肪体中的转录。研究结果有助于解析HaLpR参与棉铃虫卵巢发育过程中的脂质转运以及应对饥饿胁迫的作用。     

小菜蛾鱼尼丁受体基因克隆及序列分析

利用RT-PCR和RACE技术克隆了小菜蛾(Plutella xylostella)鱼尼丁受体(Px-RyR)基因,其核苷酸序列全长15 748bp,5′非编码区267bp,3′端非编码区109bp,开放阅读区全长为15 372bp(GenBank登录号:JF927788),编码5 123个氨基酸残基。估测其蛋白分子量为579.39ku,等电点为5.45。该基因编码氨基酸序列和其他鳞翅目昆虫RyR氨基酸序列比对相似性较高(92%),与哺乳动物3种亚型RyRs的相似性为45%～47%。此外,二级结构预测,其C-末端存在6个跨膜区域;且Px-RyR中存在一个出现4次重复,长度为89～95个氨基酸的RyR结构域,平均相似性为33%。     

棉铃虫para同源基因III-IV接头DNA片段序列分析

利用反转录 PCR技术 ,用一对特异性寡核苷酸引物 ,分离获得棉铃虫 para同源基因 III- IV接头约30 0 bp DNA片段 ,发现在 Bao D- R和 Bao D- S品系间存在 4个核苷酸差异 ,但在推导的氨基酸组成上没有差别。对比分析表明 ,分离获得的棉铃虫 III- IV接头氨基酸组成与烟芽夜蛾 hscp片段同一区域有 98.1%的氨基酸相同 ,与德国蜚蠊 CSMA的氨基酸有 93.5%相同 ,与果蝇 para基因有 88.9%的氨基酸相同     

小菜蛾GluCl受体α亚基cDNA基因克隆和序列分析

利用RT-PCR和RACE技术对小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]4龄幼虫谷氨酸门控的氯离子通道(GluCl)受体cDNA全长进行了克隆和序列分析。通过设计简并性上、下游引物扩增出小菜蛾GluCl受体α亚基基因192bp的cDNA片段,根据得到的片段序列设计3′和5′特异性引物采用RACE技术进行3′和5′末端的克隆,获得了小菜蛾GluCl受体的cDNA的完整序列,GenBank登录号为GQ221939。该基因全长2144bp,其开放阅读框(ORF)1344bp,编码447个氨基酸。相似性分析表明:它与果蝇和赤拟谷盗的相似性均为73%,与埃及伊蚊的相似性为75%,与东亚飞蝗的相似性为79%;氨基酸分析后显示它具有GluClα亚基的典型特征,表明克隆的cDNA序列是小菜蛾GluClα亚基基因的序列。     

2-十三烷酮诱导棉铃虫(Helicoverpa armigera）细胞色素P450 CYP6B6时空表达规律的研究

植物次生物质2-十三烷酮能够诱导棉铃虫细胞色素P450 [WTBX]CYP6B[WTBZ]6基因的过量表达,以6龄棉铃虫（[WTBX]Helicoverpa armigera[WTBZ]）幼虫为对象,研究2-十三烷酮对棉铃虫细胞色素P450 CYP6B6的诱导作用,并对其表达规律进行了初探。分别采用实时荧光定量PCR（qRT PCR）和免疫组化的方法,分析棉铃虫在终浓度为10 mg·g-1 的2-十三烷酮胁迫下,不同时间及不同组织部位[WTBX]CYP6B[WTBZ]6 基因在mRNA水平和蛋白水平上的表达变化规律。qRT PCR结果显示：用添加了2-十三烷酮的人工饲料饲喂棉铃虫不同时间后,在头壳中[WTBX]CYP6B[WTBZ]6 mRNA的表达量一直低于对照组,到48 h时与对照组具有显著差异（[WTBX]t4=15.32,P[WTBZ]=0.000 1）;在脂肪体中随着时间的推移,表达量呈升高趋势,在36 h 已过量表达（[WTBX]t4=7.627,P[WTBZ]=0.001 6）;在24 h时体壁和中肠组织的表达量分别较对照组提高了2.06倍和7.16倍,之后表达量均呈现先降低后升高的趋势,且在48 h时达到最大。免疫组化结果显示：在棉铃虫幼虫组织中发现CYP6B6蛋白在体壁、脂肪体、中肠中均有表达,相比之下在体壁中表达量较高。该研究为深入了解棉铃虫P450 CYP6B6的表达调控机制及其参与杀虫剂抗性的研究奠定了基础。     

紫茎泽兰CYP75基因cDNA片段的克隆与鉴定

根据菊科植物P450基因CYP75 B5(GenEMBL AF313489)和C YP75 B6(GenEMBL AF313488)核酸序列同源区设计引物,用RT-PCR方法从紫茎泽兰植株中获得一大小为378bp的细胞色素P450基因片段。经克隆、测序及氨基酸序列同源性比较,发现由该片段推导出的氨基酸序列与C YP75 B5和C YP75 B6的氨基酸序列分别具有79.5%和85.6%的同源性,与C YP76 B1、C YP81 B1 v1、C YP81 E1 v2同源性分别为40.8%、35.2%、35.0%,与C YP73 A家族的同源性在28.9%～31.4%;所绘制的系谱树与同源性分析结果一致。因此,初步确定该序列为C YP75家族中某一成员的结构基因片段。     

苜蓿实夜蛾几丁质脱乙酰基酶基因

几丁质脱乙酰基酶（CDA）在昆虫几丁质代谢中具有重要作用。本研究以苜蓿实夜蛾5龄幼虫虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到该虫CDA基因的cDNA序列。该序列含有1 984个碱基,包括1个1 626个碱基的开放阅读框,编码一个含541个氨基酸的蛋白,分子量约为61.86 ku。克隆基因推导的氨基酸序列具有几丁质脱乙酰基酶典型的3个功能区,分别是几丁质结合区（47～103）,催化区（199～355）,低密度脂蛋白受体区（124～158）。序列比对表明,克隆的苜蓿实夜蛾CDA与其他昆虫的CDA在核苷酸和氨基酸水平上的一致性存在较大差异。苜蓿实夜蛾CDA的氨基酸序列与棉铃虫CDA（GQ411189）一致性达到98%,而与另外3种昆虫粉纹夜蛾CDA（AY966402）、蓓带夜蛾CDA（EU660852）和棉铃虫CDA（GQ411190＼GQ411191＼EF600051）氨基酸序列间的一致性只有36%~38%,属于两类CDA类群中的一类。基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号GU188855。     

Analysis of two acetylcholinesterase genes in Bombyx mori

Two acetylcholinesterases (AChE, EC 3.1.1.7) cDNAs were identified and cloned from silkworm, Bombyx mori. One of those, BmAChE-o cDNA, is comprised of 3197 nucleotides which encode 638 amino acids, having an amino acid sequence homology of 72% with Drosophila melanogaster Ace-orthologous AChE (AO-AChE). In some species, another AChE group based on the sequence, Drosophila Ace-paralogous AChE (AP-AChE) has been recognized in relation to organophosphate- or carbamate-resistance, but there have been few reports of AP-AChE among lepidopteran species. However, we isolated the AP-AChE from lepidopteran silkworm, and cloned full ORF as BmAChE-p, which cDNA consisted of 2465 nucleotides that encode 683 amino acids. The homologies with other AP-AChEs were over 60% when compared. Although silkworm is not a target of pesticides, the genomic information obtained in this study will contribute to insecticide-resistance study on lepidopteran pest species.     

黄瓜绿斑驳病毒河北分离物基因组克隆及序列分析

为揭示河北省黄瓜绿斑驳病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)分类地位及系统进化情况,通过分子克隆测定了来自河北省西瓜产区分离获得的分离物CGMMV-chb的近全基因组序列,分析其基因组结构特征;并依据近全基因组核苷酸序列及外壳蛋白氨基酸序列进行了系统进化关系分析。结果表明,CGMMV-chb近全基因组大小为6 383 nts,Gen Bank登录号为KJ658958,含4个开放阅读框,编码4种蛋白;与Gen Bank库中的其它12个CGMMV分离物的核苷酸相似性为92%~100%,氨基酸相似性为98%~100%。CGMMV-chb与韩国分离物CGMMV-KW基因序列相似性最高,为98%~100%,与以色列分离物CGMMV isolate Ec基因序列相似性最低,为92%~99%;系统进化关系中CGMMV-chb与其它中国分离物、日韩分离物亲缘关系较近,处于同一亚组的不同分支中,与以色列分离物亲缘关系相对较远。     

悬铃木方翅网蝽非典型气味受体基因CcilOrco的克隆与序列分析

为进一步研究悬铃木方翅网蝽Corythucha ciliate嗅觉通讯分子机制和寻求新的悬铃木方翅网蝽防治技术,本研究克隆了悬铃木方翅网蝽的非典型气味受体基因CcilOrco,并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中已发表的半翅目昆虫非典型气味受体家族基因的氨基酸保守序列设计简并引物,采用RT-PCR方法扩增目的基因,将其克隆至pEASY-Blunt载体并测序。将克隆获得悬铃木方翅网蝽非典型气味受体Orco的cDNA序列命名为CcilOrco(GenBank登录号:MF564288),序列分析结果显示,CcilOrco开放阅读框长1 419bp,编码472个氨基酸。预测其分子量为53.25kD,等电点为6.22,序列中有7个跨膜区,N-端在细胞膜内,C-端在细胞膜外。通过在GenBank中进行序列的同源性比较,该基因与已公布的半翅目昆虫的非典型气味受体基因序列有较高的同源性。克隆所获得的基因属于非典型气味受体家族基因。qPCR结果显示CcilOrco主要在雌雄成虫触角中高表达。     

棉铃虫不同品系Gqα基因的比较及其原核表达与纯化

为了阐明Gqα的DNA序列情况,分别以cDNA和总DNA为模板,对Gqα进行PCR扩增,结果发现,Gqα在DNA水平上没有内含子。为了了解不同棉铃虫品系Gqα的变异情况,以实验室5个棉铃虫品系的中肠总DNA为模板,使用Pyrobest高保真酶对该基因进行扩增,测序后翻译成氨基酸序列发现,田间的耐药性品系只有2个氨基酸的变异,即:第163位的非极性A(丙氨酸)变成了极性T(苏氨酸);第353位的非极性V(缬氨酸)变成了碱性R(精氨酸);实验室内毒蛋白品系只有一个氨基酸的变异,第353位的V变成了R;其他2种实验室品系没有任何氨基酸的变异。个别氨基酸的变异可能与棉铃虫对Bt毒素产生抗性相关。将Gqα编码区克隆到表达载体pET21b中,表达出带有6个组氨酸标签的重组蛋白并对其进行了纯化,为进一步研究其功能奠定了基础。     

A plant-specific tau class glutathione S-transferase from Oryza sativa with very high activity against 1-chloro-2,4-dinitrobenzene and chloroacetanilide herbicides

A plant-specific tau class GST gene homolog was successfully cloned from an Oryza sativa cDNA library by PCR using oligonucleotide primers based on the OsGSTU4 (GenBank Accession No. AF309378) sequence. The cDNA was composed of a 720-bp open reading frame encoding 239 amino acids. The deduced amino acid sequence of this gene shared over 65% sequence identity with the sequences of the tau class TaGST28e45 and ZmGST42. Conversely, the OsGSTU4 sequence showed very low identity to the GST sequences of phi, theta and zeta classes. This gene was expressed in Escherichia coli with the pET vector system, and the gene product was purified to homogeneity using GSH-Sepharose affinity column chromatography. The expressed OsGSTU4 formed a homodimer with subunits of approximately 25.5 kDa. OsGSTU4 displayed very high activity toward 1-chloro-2,4-dinitrobenzene. The activity of the OsGSTU4 was significantly inhibited by S-hexylglutathione and hematin. Plant OsGSTU4 had a unique herbicide specificity and played an important role in the detoxification reaction against fluorodifen and chloroacetanilide herbicides.