小麦条锈菌效应蛋白基因 PSTG_23616的时空表达特征分析

明确条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici,Pst)效应蛋白基因PSTG_23616的时空表达特征,旨在解析该基因在病菌生长发育及致病过程中的作用。利用RT-PCR和PCR克隆获得PSTG-23616的cDNA和基因组DNA全长;借助生物信息学软件分析PSTG-23616蛋白序列特征并构建系统进化树;通过酵母分泌系统、农杆菌介导的瞬时表达系统、实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)、亚细胞定位技术初步明确该基因的功能。结果表明,PSTG_23616基因组全长937bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)全长699bp。生物信息学软件预测结果显示,PSTG-23616信号肽为位于N端的1~22个氨基酸;酵母分泌系统分析表明,PSTG-23616的信号肽具有分泌功能,为典型的分泌蛋白;注射含有PSTG_23616的重组农杆菌菌液,可抑制由BAX引起的细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)反应;qRT-PCR结果表明,PSTG_23616在小麦条锈菌初侵染过程中一直上调表达,24h表达量达到顶峰;亚细胞定位分析表明,PSTG_23616在整个细胞均有分布。推测,该效应蛋白参与条锈菌侵染结构的分化,同时在条锈菌与小麦互作过程中发挥毒性功能。     

可可毛色二孢全基因组分泌蛋白的预测及分析

【目的】可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）是一种世界性分布的重要植物病原真菌,可引起严重的葡萄溃疡病（Botryosphaeria dieback）,影响果木品质并造成巨大的经济损失。本研究预测并分析可可毛色二孢基因组范围内的分泌蛋白,并明确其基本特征,为该病菌分泌蛋白致病机理的研究打下基础。【方法】依据已公布的可可毛色二孢全基因组序列,利用信号肽预测软件SignalP v5.0、跨膜结构分析软件TMHMM v2.0、细胞器定位分析软件ProtComp v9.0、GPI锚定预测软件big-PI Fungal Predictor和亚细胞器定位分析软件TargetP v2.0生物信息学软件对该菌中的典型分泌蛋白进行筛选。对分泌蛋白N端信号肽的长度、氨基酸使用频率及其切割位点进行统计分析。依据蛋白序列的同源性,应用BLASTP程序对分泌组蛋白进行功能注释分析,预测其生物学功能。采用蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统,对所选分泌蛋白的信号肽进行活性检测。利用qRT-PCR方法检测所选分泌蛋白基因在可可毛色二孢侵染葡萄中的表达情况。【结果】在可可毛色二孢全基因组编码蛋白中共筛选获得552个潜在的具有典型信号肽的分泌蛋白,占全基因组预测蛋白总数的4.3%,其编码蛋白长度集中于101—400 aa。信号肽统计分析表明,其信号肽长度以18—20 aa的序列最为集中,信号肽长度为20 aa的蛋白数量最多。信号肽中使用频率最高的氨基酸为丙氨酸;非极性、疏水的氨基酸使用频率最高,占氨基酸总数的60.2%。其信号肽的-3至-1位置上的氨基酸相对保守,切割位点属于A-X-A类型,可被Sp I型信号肽酶识别并切割。336个分泌蛋白具有功能注释,其功能较多集中于细胞壁降解有关的酶类以及致病相关蛋白,并且这些蛋白在分子量、等电点、脂肪族氨基酸指数等方面均存在差异。通过蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统证实,挑选的9个分泌蛋白信号肽均具有分泌活性。qRT-PCR检测结果表明,所选分泌蛋白基因在该病菌侵染初期的表达发生变化。【结论】利用生物信息学分析技术从可可毛色二孢全基因组中共预测获得552个经典分泌蛋白。其信号肽氨基酸长度分布广泛,氨基酸组成中非极性、疏水的氨基酸使用频率最高。功能注释主要集中在细胞壁组分降解相关的酶类、致病侵染相关的坏死诱导相关蛋白以及几丁质结合蛋白等。     

草莓果生刺盘孢菌候选效应子的生物信息学及功能分析

效应子是由病原物分泌的一些能改变寄主植物细胞结构和功能的蛋白质及小分子物质。研究利用生物信息学手段并结合转录组分析,通过蛋白家族和跨膜结构域预测、信号肽分析和亚细胞定位分析等方法,预测草莓果生刺盘孢菌的候选效应子。结果表明:本研究选取的3个候选基因均为果生刺盘孢菌的分泌蛋白,并且均在果生刺盘孢菌的侵染阶段表达。农杆菌介导的烟草瞬时表达系统分析结果表明:3个候选效应子均可抑制由Bax诱导的细胞凋亡。综上所述,3个候选基因是草莓果生刺盘孢菌效应子,推测其在果生刺盘孢菌侵染草莓过程中通过抑制细胞过敏性反应发挥作用。     

甜橙硫氧还蛋白基因CsTRXh1克隆与表达分析

【目的】通过甜橙硫氧还蛋白基因CsTRXh1克隆与表达分析,以期为解析甜橙硫氧还蛋白基因的功能及胁迫应答机制提供参考依据。【方法】基于甜橙基因组数据使用同源克隆法克隆甜橙硫氧还蛋白基因,利用生物信息学分析CsTRXh1蛋白与其他物种同源蛋白的相似性、系统进化和理化性质,使用qRT-PCR方法分析CsTRXh1基因在健康甜橙树和感染黄龙病甜橙树叶片中的表达模式,通过瞬时转化烟草叶片分析CsTRXh1蛋白在植物细胞中的亚细胞定位。【结果】获得1个甜橙硫氧还蛋白基因CsTRXh1,GenBank登录号为ON125405。蛋白质序列比对分析表明,CsTRXh1与其他植物来源的硫氧还蛋白具有较高的序列相似度,包含保守结构域Thioredoxin。聚类分析表明,CsTRXh1为h型硫氧还蛋白。表达分析结果表明,CsTRXh1基因在感染黄龙病甜橙叶片中上调表达。亚细胞定位分析表明,CsTRXh1定位于细胞质和细胞膜。【结论】CsTRXh1基因受黄龙病菌侵染诱导表达,推测CsTRXh1在黄龙病菌侵染柑橘过程中参与生理生化调控功能。     

小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1的克隆与功能分析

【目的】研究小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1的功能,确定其在小麦条锈菌侵染过程中的作用,为揭示小麦与病原菌互作的分子机理奠定理论基础。【方法】利用RACE技术扩增PsPL1基因全长,通过qRT-PCR对PsPL1的表达特征进行分析,并在酵母系统中验证其编码蛋白信号肽的分泌功能,最后通过HIGS技术沉默PsPL1基因,确定其在条锈菌侵染小麦过程中的作用。【结果】克隆得到PsPL1基因全长,其ORF长471bp,编码157个氨基酸;经预测PsPL1蛋白包含一个果胶酶保守结构域,N端含有一段由21个氨基酸组成的信号肽序列;经酵母系统验证,确定PsPL1蛋白信号肽具有分泌功能;qRT-PCR分析发现,PsPL1在条锈菌侵染早期表达上调;利用HIGS技术沉默PsPL1基因后,条锈菌的产孢量没有发生明显变化。【结论】成功克隆了小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1,明确了其分泌特性及表达特征。     

小麦病程相关蛋白1基因的亚细胞定位及信号肽鉴定

前期研究克隆获得了一个叶锈菌诱导的小麦病程相关蛋白1基因TaLr35PR1,明确了其基因结构和表达特征。本研究首先预测TaLr35PR1的信号肽和亚细胞定位情况,进而通过试验予以佐证。将信号肽编码的核酸序列克隆、连接到酵母信号肽诱捕载体pSUC2T7M13ORI上,并转化到酵母蔗糖酶缺陷菌株YTK12中,明确了TaLr35PR1基因的信号肽具有分泌功能。同时,利用酶切连接的方法成功构建亚细胞定位重组体pCamA-TaLr35PR1-GFP,利用基因枪轰击技术瞬时转化洋葱表皮细胞。结果表明,pCamA-TaLr35PR1-GFP融合蛋白主要在细胞外表达,与亚细胞定位预测的结果一致。这些研究结果丰富了小麦病程相关蛋白1基因的研究内容,为进一步探索该类基因的生物学功能及其作用机制提供了研究基础。     

稻瘟病菌分泌复合物的生物信息学分析及MoSec15定位研究

利用稻瘟病菌分泌途径相关的调控因子分泌复合物进行生物信息学分析及相关基因定位初探．经同源比对获得稻瘟病菌中分泌复合物8个亚基的同源蛋白,通过在线工具分析蛋白结构域、构建系统进化树、预测亚细胞定位;利用公共数据库获得其在稻瘟病菌不同组织和发育阶段的表达情况;此外,亚细胞定位分析表明,稻瘟病菌分泌复合物亚基MoSec15可能定位于菌丝体的内膜结构中．     

全基因组预测哈茨木霉T6776的分泌蛋白

为探明哈茨木霉T6776的分泌蛋白及其作用于植物病原菌的功能,在前期研究的基础上,采用SignalP、ProtComp和TMHMM等生物在线预测程序,对该菌11 498条蛋白序列进行N-端信号肽、亚细胞定位和跨膜结构等预测。结果表明:哈茨木霉T6776含分泌蛋白503个,分泌蛋白的信号肽长度、氨基酸长度均与植物病原菌不同;哈茨木霉T6776分泌蛋白信号肽切割位点属A-X-A型,为SPI型信号肽识别位点。     

小麦条锈菌效应蛋白Hasp83在条锈菌致病性中的功能分析

【背景】条锈病是小麦上的重大病害,由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f. sp. tritici,Pst）侵染引起。条锈菌是活体营养型寄生真菌,在侵染过程中形成吸器,通过吸器从寄主植物汲取营养。同时,吸器分泌效应蛋白调控寄主免疫,促进侵染过程。【目的】明确条锈菌效应蛋白的功能及其作用机理,为揭示条锈菌的致病机制打下基础。【方法】比较分析条锈菌夏孢子、芽管和吸器转录组,获得在吸器诱导表达的分泌蛋白基因Hasp83,在本氏烟叶片细胞中瞬时表达观察是否能抑制由BAX引起的细胞坏死;利用qRT-PCR分析该基因在条锈菌侵染小麦不同阶段的表达水平。借助荧光假单胞菌Ⅲ型分泌系统和寄主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）分析Hasp83在条锈菌侵染过程中的功能。利用酵母双杂交系统筛选小麦中与Hasp83互作的蛋白,免疫共沉淀技术进一步在烟草细胞中共表达验证Hasp83及其候选靶标蛋白的互作。【结果】Hasp83开放阅读框全长522 bp,编码173个氨基酸,蛋白N端1—29位氨基酸为信号肽,无保守结构域,在本氏烟叶片细胞中...     

番茄抗性相关基因SlHin1的克隆、表达与抗病毒功能

【目的】克隆番茄抗性相关基因Sl Hin1(harpin-induced gene 1),分析其生物信息学特征、组织表达和亚细胞定位情况,研究其在抗烟草花叶病毒侵染、移动中的作用,为番茄抗性育种提供理论依据。【方法】通过RT-PCR及基因克隆方法,从番茄总RNA中克隆得到基因SlHin1;应用生物信息学方法分析其DNA序列及其编码的蛋白序列特性,使用MEGA6.0对SlHIN1氨基酸序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;将该基因片段通过Sal Ⅰ和Bam HI双酶切连接至荧光表达载体pCV-m GFP-C1,采用GFP标记的方法进行亚细胞定位检测,分析编码蛋白表达位置;利用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析该基因在番茄不同组织的表达量水平;将该基因片段通过Nco Ⅰ和Bam HI通过双酶切连接至植物表达载体pFGC5941,用土壤农杆菌EHA105瞬时过表达该基因并接种标记有绿色荧光的烟草花叶病毒侵染性克隆,以检测植株对病毒的抗性变化,间接ELISA法检测病毒的含量,探究该基因的抗病毒功能。Western blot验证SlHIN1蛋白在本氏烟内的表达情况。【结果】利用RT-PCR方法从番茄材料(Solanum lycopersicon cv.Ailsa Craig)的叶片组织中克隆得到全长为675 bp的番茄抗性相关基因Sl Hin1,将序列分别提交至Gen Bank,得到序列号KU195820。序列比对及生物信息学分析表明,其基因预测编码225个氨基酸,分子量为26.1 k D,理论等电点为9.35,结构上具有LEA-14保守结构域,不具有跨膜区段,并且位于番茄基因组10号染色体上(Solyc10g081980);多序列比对及进化树分析表明,该基因编码的蛋白与茄科植物HIN1氨基酸同源性80.0%以上而与水稻、高粱单子叶植物的亲缘关系较远;亚细胞定位显示定位在细胞膜上与PSORT Prediction预测的亚细胞定位最高概率一致;qRT-PCR结果分析表明该基因具有组织特异性,表达量在根、叶、茎间依次降低;在本氏烟中瞬时过表达SlHIN1并在表达部位接种标记有绿色荧光的烟草花叶病毒侵染性克隆,处理组本氏烟在接种病毒4 d后没有任何荧光出现,而对照组出现绿色荧光。随着接种时间推移,接种7 d后处理组叶片上零星荧光有略微的扩大,而对照组的绿色荧光已经扩散至心叶。间接ELISA检测病毒含量较对照组少,处理组的病毒扩散受到抑制。Western blot分析结果表明,显色后的硝酸纤维素膜上约在26 k D处有一特异条带,而空载体的对照无相应条带,说明SlHIN1蛋白在注射部位成功表达。【结论】Hin1在供试科植物中均存在,其中SlHin1定位在细胞膜,过表达该基因可抑制病毒扩散,推测其可能参与茄科植物对烟草花叶病毒的抗性反应,使植株获得抗性。     

稻瘟病菌分泌蛋白组学研究

稻瘟病菌分泌蛋白在稻瘟病菌入侵水稻过程中发挥重要作用。收集稻瘟病菌(Guy11菌株)液体培养的上清液,富集蛋白,经过烷基、还原处理和酶解后,采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对酶解肽段进行分离及鉴定,利用信号肽预测工具SignalP和蛋白质亚细胞定位软件Protcomp对鉴定到的蛋白进行生物信息学预测验证。结果显示,共鉴定出30个稻瘟病菌的分泌蛋白,其中:24个蛋白具有N端信号肽,26个蛋白可分泌到胞外,3个蛋白定位在细胞膜上。对其功能进行分类,发现多数为酶类,参与水解及能量代谢。这些酶类和蛋白的发现与进一步研究,将为揭示稻瘟病菌侵染的机理提供帮助。     

基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法

细胞是生命活动的基本单位,各种蛋白质都按照其功能有序地分布在细胞的每个分区中。蛋白质的亚细胞定位是功能基因组学的重要内容。目前植物蛋白质的亚细胞定位方法中应用较普遍的是借助于报告基因表达产物来实现目标蛋白定位的融合报告基因定位法,其中绿色荧光蛋白应用最为广泛。综述了基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法,包括拟南芥原生质体瞬时表达、烟草叶片瞬时表达、洋葱表皮细胞瞬时表达等,同时对上述几种方法进行了比较分析。     

水稻抗白叶枯病相关基因的亚细胞定位

利用亚细胞定位技术对水稻抗白叶枯病相关基因的表达产物进行了分析,为基因功能分析提供了重要信息。通过前期基因芯片筛选、半定量/定量PCR的验证及基因功能注释,从高抗白叶枯病水稻品种Y73中筛选了18个潜在的与抗白叶枯病相关的基因,并在烟草叶片细胞中进行亚细胞定位分析。通过观察融合有绿色荧光标记(sGFP)的表达产物,初步了解这些基因在烟草细胞中的表达位置。经过激光共聚焦显微镜观察后发现: 其中4个基因的 sGFP 融合蛋白定位于细胞核上,可能发挥了转录因子的功能;4个基因的 sGFP 融合蛋白定位于细胞质膜上,推测可能与细胞质膜的稳定或控制蛋白转运相关;4个基因的 sGFP 融合蛋白同时定位于细胞核和细胞质膜上;另有6个基因的 sGFP 融合表达后没有观察到明显的定位信号。     

烟草谷氧还蛋白NbGRX1的亚细胞定位及抗旱功能研究

[目的]本文旨在分析烟草NbGRX1基因的亚细胞定位及抗旱功能。[方法]在前期研究中,我们从烟草中克隆了1个谷氧还蛋白基因NbGRX1,并对其表达特性进行了研究。在此基础上,对NbGRX1蛋白的亚细胞定位及抗旱功能进行研究。利用病毒介导的基因沉默,在烟草中沉默了该基因,并调查NbGRX1基因沉默后烟草对干旱的响应。同时采用农杆菌介导法,将NbGRX1基因转化至拟南芥中,筛选单拷贝插入的纯合转基因拟南芥进行后续研究,对转基因拟南芥及对照进行干旱处理,并分析其表型。[结果]亚细胞定位研究表明,空载体中的GFP(绿色荧光蛋白)定位在细胞质和细胞核中,GFP:NbGRX1的融合蛋白均匀分布在细胞质和细胞核中,因此可以推测NbGRX1蛋白能定位在植物的细胞核和细胞质中。病毒介导的基因沉默研究表明,NbGRX1基因沉默烟草与对照相比对干旱胁迫更为敏感,更容易出现黄化和萎蔫的症状,叶片相对含水量下降;NbGRX1基因超量表达的株系干旱能力明显高于对照。[结论]烟草NbGRX1基因能够提高植物的抗旱性。     

烟草DXS基因的克隆及其亚细胞定位分析

[目的]从烟草cDNA中扩增出1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因(去除终止密码子TAA),并对其进行亚细胞定位分析。[方法]利用RT-PCR技术分离、克隆DXS,将烟草DXS基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因重组构建亚细胞定位表达载体,转入根癌农杆菌LBA4404后注射侵染本氏烟烟草幼苗进行瞬时表达;并利用激光共聚焦扫描显微镜观察转GFP植株的表达情况。[结果]显微镜观察发现,DXS和GFP融合蛋白仅在本氏烟叶肉细胞(尤其是保卫细胞)的叶绿体中产生绿色荧光,DXS基因在叶绿体中特异表达。[结论]DXS定位在叶绿体中,为接下来对DXS基因功能研究提供了理论依据。     

番木瓜eIF4E家族蛋白的亚细胞定位

真核翻译起始因子eIF4E是多种病毒侵染植物的必须因子。笔者通过扩增番木瓜eIF4E家族基因Cp-eIF4E和Cp-e IFiso4E,分别构建他们与绿色荧光蛋白(GFP)融合的植物表达载体,转化烟草叶片的原生质体后研究了番木瓜eIF4E家族蛋白的亚细胞定位情况。结果表明,Cp-eIF4E和Cp-e IFiso4E在细胞质和细胞核中均有表达。本研究为进一步探讨番木瓜eIF4E家族蛋白与病毒的互作机制以及解析其在病毒侵染中的功能奠定了理论基础。     

NaHCO3胁迫下吉尔吉斯白桦MADS基因家族生物信息学及表达分析

为了探索MADS基因家族的耐盐胁迫功能,从以吉尔吉斯白桦(Betula kirghisorum)23号为试验材料测得的转录组文库中筛选出28个吉尔吉斯白桦的MADS-box基因序列对其编码蛋白的基本理化性质、亚细胞定位、二级结构、跨膜结构和信号肽、基因结构、保守基序、蛋白系统进化等方面进行初步生物信息学分析,并在NaHCO_3胁迫下对其表达情况进行分析。结果显示,除蛋白BkMADS1和BkMADS20外,其余均为亲水性蛋白;在28个吉尔吉斯白桦MADS蛋白中有19个定位在细胞核中;蛋白BkMADS7和BkMADS12的二级结构组成以无规则卷曲为主,其余蛋白则以α-螺旋为主;所有蛋白均没有信号肽,即全为非分泌性蛋白。此外,进化分析结果表明,MADS盒为MADS-box转录因子高度保守的结构域,大多数吉尔吉斯白桦MADS蛋白为Ⅱ型。在0.6%NaHCO_3胁迫下,15个BkMADS基因上调表达,13个BkMADS个基因下调表达。     

烟草bZIP转录因子BZI－4的生物信息分析

[目的]探讨烟草在采收前的生理期和烘烤过程中的变黄阶段抗逆机制。[方法]利用生物信息学方法对烟草b ZIP转录因子BZI-4的理化特性、信号肽、跨膜、系统进化和亚细胞定位进行分析。[结果]烟草b ZIP转录因子BZI-4为碱性、水溶性、耐高温和非分泌型的游离蛋白,该蛋白为叶绿体中的转运肽,仅剪切修复后才具有活性,对环境适应能力强。[结论]通过烟草b ZIP转录因子BZI-4研究,为烟草抗逆境胁迫研究提供理论基础。     

过表达细叶百合LpNAC6基因增强烟草的耐盐性

目的NAC转录因子是一类具有多种生物功能的新型转录因子，在植物抗逆响应中发挥着重要作用。本文旨在克隆并研究细叶百合LpNAC6基因在逆境胁迫下的表达模式，探究其在烟草中响应盐胁迫的功能。方法本研究采用同源克隆技术克隆得到细叶百合LpNAC6基因，利用生物信息学软件对LpNAC6基因进行分析；通过基因枪法对LpNAC6蛋白进行亚细胞定位；利用实时荧光定量PCR的方法分析LpNAC6基因在不同非生物胁迫和不同组织中的表达模式；构建植物表达载体pBI121-LpNAC6-GFP转化烟草，通过对转基因烟草进行盐胁迫处理验证LpNAC6基因的功能。结果LpNAC6基因长909 bp，编码302个氨基酸，存在一个高度保守的NAM结构域，属于NAC基因家族。LpNAC6为不稳定亲水性蛋白，无信号肽和跨膜结构域，有5个糖基化位点和20个磷酸化位点，亚细胞定位在细胞核。LpNAC6基因与黄褐棉的NAC转录因子进化关系最近。细叶百合中LpNAC6基因对ABA、干旱、低温及盐胁迫均有响应。盐胁迫下，过表达LpNAC6基因的转基因烟草其SOD、POD、CAT的活性和叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白的含量均显著高于野生型。结论细叶百合LpNAC6基因能够响应ABA、干旱、低温、盐胁迫等非生物胁迫，其过表达能够提高转基因烟草在盐胁迫下的代谢活力和抗氧化酶活性，从而增强烟草耐盐性。      

棉花GbRvd的亚细胞定位及其超表达烟草抗病性分析

【目的】研究棉花NB-LRR家族基因GbRvd的亚细胞定位及超表达烟草的黄萎病抗性,为解析GbRvd介导的植物抗黄萎病机制提供依据。【方法】对真核表达载体pJCV52进行改造,在SpeⅠ酶切位点插入gfp,使其兼具亚细胞定位的功能,命名为GPJCV52。应用Gateway技术构建GbRvd的亚细胞定位和超表达载体,并分别转化农杆菌GV3101。利用生物信息学和农杆菌介导的烟草瞬时表达技术对GbRvd分别进行亚细胞定位预测与观察。采用农杆菌介导法转化烟草,并通过组织培养技术获得转基因植株。运用PCR对超表达GbRvd的烟草进行阳性植株筛选,且利用半定量RT-PCR对阳性转基因植株进行表达检测。制备棉花黄萎病菌孢子悬浮液,通过灌根法对T_3代转基因烟草株系进行接种,利用5级标准统计发病情况并计算病情指数。【结果】利用在线分析软件ProtComp预测GbRvd为一种胞外(分泌)蛋白;GbRvd的跨膜预测结果显示其包含3个跨膜域;在线分析软件Wo LF PSORT预测结果显示GbRvd在细胞膜、内质网及叶绿体的预测分值分别为7、3和1,表明GbRvd主要存在于植物细胞膜上。利用农杆菌介导的烟草瞬时表达技术进一步对GbRvd的亚细胞定位进行观察,结果显示在单独表达GFP蛋白的烟草细胞中,荧光信号在细胞核、细胞质和细胞膜均有分布;而GbRvd与GFP融合表达后的荧光信号主要分布于烟草表皮细胞质和细胞膜。综合生物信息学分析和亚细胞定位观察结果,表明细胞膜和细胞质是GbRvd的主要分布位置。利用农杆菌介导和组织培养获得了转基因烟草植株,通过对转基因烟草植株的PCR检测显示,阳性转基因烟草植株能够通过PCR扩增出与预期大小一致的目的条带,而野生型植株未出现相应条带;阳性转基因烟草植株半定量RT-PCR同样能够检测出与预期大小一致的目的条带,由此表明GbRvd成功整合于烟草基因组并能够进行正常转录。对3个T_3代超表达烟草株系的黄萎病抗性进行分析,结果显示超表达GbRvd的烟草植株病情指数显著低于野生型对照植株,表明过表达GbRvd可有效提高植株对黄萎病的抗性。【结论】GbRvd主要存在于植物细胞质和细胞膜,其超表达可显著提高烟草对黄萎病的抗性。