水牛FADS2基因的电子克隆及序列分析

试验旨在利用电子克隆法对水牛Δ6脂肪酸脱氢酶（Δ6-fatty acid desaturases,FADS2）基因进行克隆和生物信息学分析,为探究FADS2基因对水牛泌乳性能的作用机制奠定基础。以奶牛FADS2基因序列（GenBank登录号：NM_001083444.1）为探针设计引物,利用电子克隆法克隆水牛FADS2基因,并通过RT-PCR验证,对FADS2基因的序列特征进行生物信息学分析。测序结果表明,水牛FADS2基因序列全长为36 600 bp,由12个外显子和11个内含子组成,包含一个长1 335 bp的开放阅读框,可编码444个氨基酸。序列同源性分析显示,水牛FADS2基因编码序列与牦牛、黄牛、人、猪、家兔、虎鲸和褐家鼠序列的同源性分别为98.88%、98.88%、89.66%、90.79%、90.85%、92.35%和87.11%。蛋白质预测分析表明,水牛FADS2蛋白分子质量为52.51 ku,理论等电点（pI）为8.75,呈弱碱性,属于亲水性蛋白,无信号肽。系统进化树分析结果表明,FADS2基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性,其中水牛与牦牛、黄牛亲缘关系较近,与褐家鼠亲缘关系较远。水牛FADS2基因的成功克隆为今后阐明水牛泌乳性能的作用机制奠定了基础。     

蒙古绵羊Bcl-2基因cDNA的克隆及序列分析

为扩增蒙古绵羊bcl-2基因全序列,根据Gen Bank上已公布的牛的序列,设计了3条引物。从蒙古绵羊脾中提取总RNA,采用RT-PCR,技术扩增出bcl-2的c DNA,并重组到p Blueselect T载体,经限制性内切酶谱分析和DNA序列测定,证实所克隆的c DNA为bcl-2,因为该c DNA包含由687个碱基组成的开放读码框(ORF),该ORF编码229个氨基酸。经比对,与牛的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为95.5%和93.4%。     

山羊ACSS2基因的克隆、序列分析及组织表达研究

本研究旨在对山羊乙酰辅酶A合成酶2（acetyl-CoA synthetase 2,ACSS2）基因进行克隆和生物信息学分析,并检测其在山羊不同泌乳时期乳腺组织中的表达量变化。以山羊乳腺组织RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增并克隆山羊ACSS2基因完整CDS区序列,对测序结果进行生物信息学分析,并对ACSS2基因在山羊不同泌乳时期乳腺组织中的表达量进行分析。结果显示,山羊ACSS2基因CDS区序列长2 106 bp,编码701个氨基酸;山羊ACSS2基因与牛、马、人、犬、猪、小鼠和鸡的同源性分别为97.8%、92.0%、91.3%、91.3%、91.1%、88.1%和73.3%。蛋白理化性质分析结果表明,ACSS2蛋白分子质量为78.72 ku,理论等电点为6.03,属于酸性蛋白;跨膜结构和信号肽分析表明,ACSS2蛋白不含跨膜结构和信号肽;结构域分析表明,该蛋白含有1个乙酰辅酶A合成酶N端结构域。亚细胞定位分析结果表明,该蛋白主要分布在内质网（44.4%）、线粒体（33.3%）、细胞质（11.1%）和细胞核（11.1%）中。蛋白质结构预测发现ACSS2蛋白含有α-螺旋（29.10%）、延伸链（21.54%）、β-转角（9.84%）及无规则卷曲（39.52%）。实时荧光定量PCR分析结果表明,ACSS2基因在不同泌乳时期均有表达,其中在泌乳中期表达量最高,在干奶期表达量最低。本试验结果为进一步研究山羊ACSS2基因在脂质代谢过程中的功能及转录调控机制提供了参考。     

蒙古绵羊Bcl-2基因3’端 cDNA的克隆及序列分析

为扩增蒙古绵羊Bcl-2基因3’端,根据GenBank上已公布的牛的序列,设计了2条引物。从蒙古绵羊脾中提取总RNA ,采用RT-PCR 技术扩增出Bcl-2的cDNA ,并重组到PMD18-T 载体,经限制性内切酶谱分析和DNA 序列测定, 证实所克隆的cDNA 为Bcl-2,因为该cDNA 包含由261个碱基组成的开放读码框(ORF) ,该ORF 编码83个氨基酸。经比对,与牛的核苷酸序列的同源性为95.8%。     

豆状带绦虫Tp-TSP2基因的克隆及生物信息学分析

对Tp-TSP2基因进行克隆和生物信息学分析,采用RT-PCR方法,成功从豆状带绦虫六钩蚴中扩增得到Tp-TSP2基因。Tp-TSP2基因编码区长621 bp,编码206个氨基酸,分子质量理论预测值为23.04 ku,等电点为7.33,预测有2个主要的B细胞抗原表位,存在4个跨膜区,与多房棘球绦虫TSP2氨基酸相似度为92.23%。在Gen Bank注册,登录号为AFJ24967.1。Tp-TSP2基因的成功克隆和分析为揭示豆状带绦虫TSP2基因的功能提供了基础资料。     

柞蚕溶菌酶基因的克隆和序列分析

采用cDNA末端扩增(RACE)方法及简并引物克隆了柞蚕溶菌酶(Antheraea pernyilysozyme)基因(Gen-Bank登录号:DQ353869)。该基因cDNA序列全长675 bp,由3个外显子和2个内含子组成,其开放读码框(ORF)长420 bp,编码140个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白的1-20位氨基酸为信号肽序列,21-140位氨基酸为柞蚕溶菌酶成熟蛋白(分子质量14 kD,等电点8.46)。柞蚕溶菌酶氨基酸序列中含有c型溶菌酶分子所特有的活性中心Glu32、Asp50以及8个半胱氨酸残基,与鳞翅目昆虫溶菌酶的氨基酸序列同源性较高,属非钙结合型c型溶菌酶。柞蚕溶菌酶的模拟三级结构与印度柞蚕(Antheraea mylitta)溶菌酶的三级结构十分相似。     

牛ACAS2基因的电子克隆与序列分析

本研究以牛的乙酰辅酶A合成酶2(ACAS2)基因为研究对象,利用生物信息学方法和同源序列克隆技术,对牛的ACAS2基因进行了电子克隆和序列分析,并对推导出的ACAS2蛋白结构与性质进行了初步分析。实验结果:牛ACAS2基因的cDNA序列长2 726 bp,包括了2106 bp的开放阅读框序列(ORF),54 bp的5?非翻译区序列(5?UTR)和566 bp的3?非翻译区序列(3′UTR),由702个氨基酸组成。该基因cDNA核苷酸编码区序列与人,猕猴,小鼠,黑猩猩,家犬ACAS2基因的相似性分别为91%,90%,87%,89%,90%,90%,推导的氨基酸序列与人,猕猴,小鼠,黑猩猩,家犬的相似性分别为94%,94%,92%,94%,87%。以ACAS2基因cDNA编码区序列构建的分子进化树研究结果表明,牛的ACAS2基因在人,猕猴,小鼠,黑猩猩,家犬等物种中,与家犬的亲缘关系特别近。牛的ACAS2蛋白的三级结构包含7个跨膜结构—Cutoff模体,三个比较大的分别位于169~199位氨基酸,170-191位氨基酸和326-345位氨基酸处。     

家鸭GHSR基因部分编码序列的克隆及变异检测

作者旨在克隆鸭GHSR基因mRNA部分编码区序列,并筛查克隆序列中的变异位点。采用RT-PCR法从巢湖鸭下丘脑组织中分离家鸭GHSR基因mRNA中编码区核酸序列,并选用30个个体cDNA,通过构建cDNA池对克隆编码区的序列变异测序检测。结果表明,克隆鸭GHSR基因mRNA部分编码区核酸序列长635 bp(GenBank登录号:EU005225),编码211个氨基酸,与鸡GHSR基因同源核酸相似性达到94%,氨基酸相似性为97%;cDNA池测序检测揭示克隆区段存在3个碱基变异位点,均为同义突变,未使编码氨基酸发生改变。克隆鸭GHSR基因mRNA编码区核酸、氨基酸序列与鸡同源序列的相似性,以及克隆核酸序列的变异检测结果表明,鸭GHSR基因在序列和功能上具有很高的保守性。     

猪Lbx2基因的克隆、序列分析及表达

试验利用PCR扩增猪Lbx2基因组序列,通过克隆测序寻找基因中的突变位点,采用半定量RT-PCR分析猪不同组织中Lbx2基因的表达情况。结果显示,Lbx2基因在肝脏、肾脏和脾脏中微弱表达,在肌肉组织中不表达;通过比较不同物种氨基酸序列,结果发现猪Lbx2与牛、猩猩、犬进化关系较近;此外,在猪Lbx2基因组中发现5处突变位点,其中1个缺失突变(缺失11 bp)位于基因启动子区,另外4个单核苷酸突变分别位于第1外显子和内含子中。该试验结果为下一步Lbx2基因的功能研究奠定了基础。     

蒙古绵羊Bcl-2基因5′端cDNA的克隆及序列分析

为扩增蒙古绵羊bcl-2基因5′端,根据Gen Bank上已公布的牛的序列,设计了2条引物。从蒙古绵羊脾中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出bcl-2的c DNA,并重组到p Blueselect T载体,经限制性内切酶谱分析和DNA序列测定,测出5′RACE产物434个核苷酸序列,该序列包括C端144个氨基酸编码序列、翻译起始密码子ATG。     

辽宁绒山羊BMP-2基因的克隆及序列比较分析

根据GenBank上绵羊的BMP-2基因序列设计特异性引物,以辽宁绒山羊基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应,成功克隆了常年长绒型和季节长绒型辽宁绒山羊BMP-2部分基因片段,丰富了绒山羊BMP-2基因序列。经与绵羊、牛、鼠、猪和人的BMP-2基因进行的比对结果表明,季节与常年长绒型辽宁绒山羊的BMP-2基因同源片段的同源性达到99．7％,二者与绵羊同源性为98．2％和98．4％;与牛同源性为98．2％和97．9％;与鼠同源性为86．3％和86％;与人同源性为88．1％和88．1％。结果表明,辽宁绒山羊BMP-2基因部分核苷酸序列与其他哺乳动物同源性很高,与绵羊、牛的同源性高达97％以上,这与它们的种属关系相近一致。与人、鼠的同源性也在86％以上,说明BMP-2基因在不同物种之间具有较高的保守性。     

奶牛白细胞介素2基因的克隆及序列分析

根据GenBank发表的奶牛白细胞介素2(IL-2)基因序列,设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增奶牛IL-2基因,琼脂糖电泳显示扩增出的片段约为477bp。回收片段,克隆入pMD18-T载体,经菌落PCR、酶切及重组质粒PCR鉴定,测序结果显示,克隆的奶牛IL-2基因与GenBank发表的奶牛IL-2基因序列同源性为98.7%。该序列与水牛和山羊的IL-2基因序列同源性最大,在95%以上;氨基酸和抗原性比较分析显示,奶牛的IL-2与山羊及水牛的IL-2在这两方面有较高的同源性。     

猪ADAR2基因全长cDNA克隆、序列特征及表达模式分析

旨在克隆猪作用于RNA的腺苷脱氨酶2基因(ADAR2)全长cDNA序列,同时对该基因在猪不同组织中的表达规律进行探索.利用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)对大白猪ADAR2基因mRNA全长序列进行克隆,并进行生物信息学分析;用荧光定量PCR方法检测35日龄大白猪心、肝、肺、肾...     

猪博卡病毒VP2基因的克隆及生物信息学分析

为研究猪博卡病毒VP2蛋白的结构与功能,应用套式PCR技术对猪博卡病毒VP2基因进行分子克隆,并对其进行生物信息学分析。结果显示,获得了1 656bp的猪博卡病毒VP2基因(GenBank登录号为KF806730),此序列与其他PBoV分离株核苷酸序列同源性为82%⁸9%,进化树分析结果显示,KF806730与PBoV5在一个分支,说明两者之间具有较近的亲缘关系。经生物信息学分析,此序列编码551个氨基酸,相对分子质量为61 261.7,理论等电点(PI)为5.98,体外半衰期为30h(体外哺乳动物类网状细胞),不稳定系数为34.36,脂肪系数为54.88,平均亲水性为-0.766,最大疏水指数为1.733,最小疏水指数为-3.378;在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定程度的偏向性;无信号肽和跨膜区;综合多种方法分析预测其主要抗原表位可能位于第78-80aa、311-314aa、507-509aa区域;二级结构、三维结构预测显示VP2蛋白主要以无规则卷曲为主,存在多个螺旋和折叠区域。本试验成功获得猪博卡病毒VP2基因,为以后研究此基因的生物学功能和建立该病毒的诊断方法奠定了基础。     

蒙古绵羊ghrelin cDNA的克隆及序列分析

根据GenBank中报道的绵羊ghrelin序列设计一对特异性引物，以蒙古绵羊真胃组织中提取的总RNA为模板，采用RT-PCR技术扩增出蒙古绵羊ghrelin的cDNA，并克隆到pTZ19载体中，经限制性内切酶谱和DNA序列测定，证实所克隆的蒙古绵羊ghrelin的cDNA为ghrelin的部分序列，因为用NCBI网站上的BLAST功能将测序结果同已发表绵羊ghrelin序列进行对比，205个碱基中仅有1个碱基的差异，该差异不影响翻译后多肽的序列。该段cDNA包含由168个碱基组成的开放读码框（ORF），该ORF编码56个氨基酸残基的前原蒙古绵羊ghrelin。对蒙古绵羊ghrelin的研究将有助于进一步揭示其生理和病理功能，对反刍动物多种疾病过程的认识及防治策略具有深远意义。     

传染性法氏囊病病毒A节段编码序列cDNA基因的克隆和序列分析

对反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）扩增克隆的传染性法氏囊病病毒超强毒Ｈａｒｂｉｎ毒株的Ａ节段编码序列ｃＤＮＡ基因进行了核苷酸序列分析。结果,克隆的Ａ节段基因共３１０１ｂｐ,包括两个完整的阅读框架ＯＲＦＡ１和ＯＲＦＡ２分别编码１０１２氨基酸的前体蛋白ＶＰ２４３和１４５氨基酸的ＶＰ５,两者有部分重叠。Ａ节段编码序列基因的克隆成功为分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

水牛SERPINE2基因的克隆、生物信息学及组织表达分析

本试验对水牛SERPINE2基因进行生物信息学分析,探索其在水牛不同组织器官中的表达规律,旨在为研究SERPINE2在水牛生殖过程中的具体调控机制提供理论支持。利用PCR技术克隆水牛SERPINE2基因CDS区的全长序列,在线生物信息学分析程序对SERPINE2进行分析,实时荧光定量PCR技术检测SERPINE2 mRNA在水牛不同组织的表达水平。结果表明：SERPINE2基因CDS区长度为1 191 bp,编码397个氨基酸,通过分析相似性结果,发现水牛和牛、绵羊、山羊的相似性为99.6%;系统进化树结果显示,遗传距离最近的是水牛和牛,绵羊次之。在组成SERPINE2蛋白的氨基酸中,缬氨酸含量较高,占氨基酸总数的9.6%。SERPINE2蛋白是一种不稳定的亲水蛋白,SERPINE2有一个信号肽,没有跨膜结构域。SERPINE2蛋白的二级结构中,α-螺旋结构的占比最高,为41.56%。多个器官检测出SERPINE2 mRNA的表达,其中在卵巢的表达量显著高于其他器官,说明SERPINE2基因可能与卵巢生长发育有重大联系。     

弓形虫细胞核因子3基因的克隆及序列分析

为预测弓形虫细胞核因子3(TgNF3)基因作为抗弓形虫疫苗候选抗原的可能性,本试验以弓形虫RH株的总RNA为模板,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增TgNF3基因并连接至pMD18-T载体。筛选阳性克隆后,测序鉴定。将测序结果正确的核苷酸序列翻译成氨基酸序列,运用生物信息学软件分析TgNF3蛋白的结构,预测抗原表位。结果显示,TgNF3基因长约950bp。TgNF3蛋白中包含1个跨膜结构域,9个α-螺旋区,4个β-折叠区,8个亲水区域和10个柔性区域,并预测含有9个线性B细胞抗原表位。结果表明,TgNF3蛋白可能具有良好的免疫原性,为研制以TgNF3为抗原的弓形虫亚单位疫苗及表位疫苗奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒A节段编码序列cDNA原克隆和序列分析

对反转录－聚合酶链反应扩增克隆的传染性法氏囊病病毒超强毒Ｈａｒｂｉｎ毒株的Ａ节段编码序列ｃＤＮＡ基因进行了核苷酸序列分析。结果,克隆的Ａ节段基因共３１０ｂｐ,包括两个完整的阅读框架ＯＲＦＡ１和ＯＲＦＡ２分别编码１０１２氨基酸的前体蛋白ＶＰ２－４－３和１４５氨基酸的ＶＰ５,两者有部分重叠。