猪α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测

【目的】利用基因工程技术寻求能够高效、稳定表达猪α干扰素,且表达产物易于纯化的表达系统。【方法】以含猪α干扰素(IFN-α)基因的重组质粒pGEM-T-IFN-α为模板,PCR扩增猪α干扰素基因。将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-IFN-α,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。【结果】SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为45 ku的GST-IFN-α,Westernblot证实GST-IFN-α能与猪IFN-α单克隆抗体发生特异性反应。重组猪α干扰素经谷胱苷肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在Vero细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为2.24×103U/mg。【结论】建立的表达系统能够表达重组猪α干扰素,表达的重组猪α干扰素具有一定的生物活性。     

猪γ干扰素的表达及抗病毒活性研究

利用RT-PCR技术从有丝分裂原刀豆素(ConA)诱导的长白猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增出猪γ干扰素的成熟肽基因(mPolFN-γ),并将其亚克隆到原核表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-mPoIFN-γ.经PCR、酶切及测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAG...     

山羊α-干扰素基因克隆、原核表达及其抗病毒活性研究

为研究雷州山羊α-干扰素基因的遗传变异及重组α-干扰素的抗病毒活性,采用RT-PCR扩增雷州山羊α-干扰素基因,分析其核苷酸序列;采用PCR方法扩增山羊α-干扰素基因成熟肽编码序列,构建原核表达载体pET- mIFN-α,并在大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达;采用SDS-PAGE和Western-blot检测重组蛋白rG-mIFN-α;通过细胞病变抑制法测定其抗小反刍兽疫病毒（PPRV）和山羊痘病毒（GPV）活性。结果表明,雷州山羊α-干扰素全基因由570个核苷酸组成,编码189个氨基酸;与GenBank 上发表的山羊、林麝、弯角大羚羊、黄牛、瘤牛、绵羊、猪、人和鼠的核苷酸序列同源性分别为99.8%、95.6%、96.8%、94.7%、94.7%、96.8%、81.6%、77.8%和70.0%;氨基酸序列同源性分别为100%、92.6%、94.7%、92.1%、93.2%、93.7%、67.9% 、61.6%和55.3%,提示反刍动物α-干扰素基因的核苷酸和氨基酸序列高度保守;rG-IFNα主要以包涵体形式存在,分子质量约32 ku;重组山羊α-干扰素能显著抑制PPRV和GPV感染引起的细胞病变,其抗PPRV和GPV效价分别为1.6×10⁴ U/mg和1.35×10⁴ U/mg。     

重组鸭α-干扰素的抗病毒活性

本研究参考大肠杆菌密码子的偏好性,对GenBank中已经发表的鸭α-干扰素基因序列进行优化,人工合成后与原核表达载体pET30a-ELP连接,构建原核表达质粒pET30a-DuIFNα-ELP。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,IPTG诱导表达重组蛋白DuIFNα-ELP。根据类弹性蛋白多肽(ELP)具有温度敏感的可逆相变特性,通过重复可逆相变循环(ITC)纯化重组蛋白质;纯化的蛋白质主要以包涵体的形式存在,通过变性、复性处理后,采用细胞病变抑制法分别在MDCK/VSV和DEF/VSV中检测重组蛋白质的抗病毒活性。结果表明,合成的重组鸭α-干扰素基因能成功表达,重组蛋白DuIFNα-ELP分子质量约80 000,纯化后的重组蛋白质纯度约90%。通过抗病毒试验检测重组DuIFNα-ELP在MDCK/VSV系统中的抗病毒活性为1.0×10~6 U/ml,比活性为1.25×10~6 U/mg;在DEF/VSV系统中的抗病毒活性为1.0×10~7 U/ml,比活性为1.25×10~7 U/mg,比MDCK/VSV系统中活性高10个单位,验证了干扰素的抗病毒活性与受体细胞的应答可能存在一定关系。这一研究结果为鸭α-干扰素防治禽类病毒性疾病的探索奠定了基础。     

猪γ干扰素的基因克隆、改造、表达及活性测定

提取经ConA诱导培养的猪外周血白细胞总RNA ,RT -PCR扩增出猪IFN -γ基因并克隆到pGEM -T -easy载体 ,测序结果表明扩增片段是含有信号肽的猪IFN -γ的完整基因。设计 1对引物亚克隆猪IFN -γ成熟蛋白基因并对其5′端前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。经测序鉴定后插入原核表达载体pRLC ,并实现在大肠杆菌中的高效表达。表达产物以包涵体形式存在 ,经 7mol·L-1盐酸胍的变性液溶解及 0 5mol·L-1盐酸胍复性液复性处理 ,表达产物进行脱盐、凝胶层析纯化。细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪IFN -γ具有较高的干扰素活性 ,约为 4 5× 10 6U·mg-1。     

猪α干扰素原核表达载体的构建及表达

以重组克隆质粒pGEM-T-IFN-αZ为模板,PCR扩增杂种猪α干扰素,将其插入原核表达载体pET-43.1a-c( )中,构建了猪α干扰素原核表达载体pET-IFN-α,实现了猪α干扰素在大肠杆菌BL21中的表达.SDS-PAGE电泳、Western-blotting检测均出现了特异性的条带.SDS-PAGE电泳分析表明,表达的融合蛋白以可溶性形式存在.经薄层扫描分析,表达产物约占菌体总蛋白的29.8%.     

猪干扰素-γ基因的表达、纯化及活性分析

依照猪IFN-γ基因序列设计引物,将该基因克隆至原核表达载体pET-30a,构建pET-30a-pIFN-γ重组表达载体,转化入寄主菌BL21(DE3),经PCR、双酶切、测序鉴定正确后,用IPTG进行诱导表达,可溶性的表达产物分别经镍柱和Sephadex-G100纯化;包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化,然后进行SDS-PAGE、Western-blot分析,并用细胞病变抑制法进行重组猪IFN-γ活性测定.结果表明:试验得到了高纯度的重组pIFN-γ,且纯化的重组猪IFN-γ蛋白具有较高的干扰病毒复制的活性,对PRV的活性为2.0×103U.mg-1,而对标准O型口蹄疫病毒的活性为2.56×105U.mg-1.     

猪α-干扰素的原核表达

重组质粒pMDIFN-α中的猪α-干扰素基因经双酶切,亚克隆到原核表达载体pET-．28a,构建了重组表达质粒pETIFN-α,经过SDS-PAGE蛋白质电泳,测得表达蛋白的相对分子质量约为26500．表达蛋白的Western-blotting分析显示：改进后的半干胶转印免疫印迹法灵敏度高、特异性强、重复性好;获得的重组融合蛋白具有良好的反应原性．     

重组猪α干扰素理化性状及其体外抗病毒活性研究

[目的]研究重组猪α干扰素（rPoIFN-α）半成品理化性状并对其体外抗病毒活性进行测试与鉴定。[方法]用HEp-2/VSV体系对3批rPoIFN-α蛋白进行抗病毒活性检测,以重组人IFN-α为参比品,测定干扰素效价;用0.25%胰蛋白酶HCl以及鼠抗猪α干扰素单克隆抗体作用已知效价的rPoIFN-α半成品,并检测各批次抗病毒活性,对rPoIFN-α理化性状进行评价;在猪肾细胞株（PK-15）上检测rPoIFN-α对猪细小病毒（PPV）和猪伪狂犬病毒（PRV）的致细胞病变抑制效应,观察rPoIFN-α的体外抗病毒活性。[结果]HEp-2/VSV体系滴定rPoIFN-α半成品效价可达1.5×105IU/ml,比活性达1.1×106IU/mg;rPoIFN-α经0.25%胰蛋白酶37℃作用1h,效价残留率低于1%,经HCl（pH=2.0）处理72h效价残留率高达95%以上,经56℃处理30min效价残留率高于47%,经鼠抗猪α干扰素单克隆抗体37℃作用1h后效价残留率约为1%;体外抗病毒试验表明,用50和500IU/mlrPoIFN-α可分别抑制PRV和PPV对PK-15细胞株致细胞病变效应。[结论]rPoIFN-α具有IFN-α的基本理化性状,其在体外可分别抑制PRV、PPV对PK-15细胞株致细胞病变效应,但剂量有差别。     

天府肉鹅IFN-α成熟肽基因的原核表达及抗病毒活性

参照已克隆的天府肉鹅IFN-α完整ORF基因序列设计引物,克隆成熟肽基因,与载体pET32a连接,构建原核表达载体,并在表达菌Rosetta中表达,SDS-PAGE分析鉴定,通过Ni-IMAC亲和层析纯化和稀释透析复性后,采用微量细胞病变抑制法分析测定IFN的抗病毒活性.结果显示,IFN-α成熟肽基因全长486 bp,...     

猪γ干扰素基因的克隆表达及其抗原性的初步研究

在人类文明发展中,人与自然的关系经历了人类对自然的顺从、依附到人类对自然的主宰。工业文明时期,人与自然的关系是对立的,人类把自然看成是掠夺的对象,致使生态危机日益严重。生态文明蕴含着人与自然和谐统一的关系。它承认自然具有内在价值,它以生态科技作为物质基础,实行生态化的生产方式和消费方式。     

猪γ干扰素基因的克隆表达及其抗原性的初步研究

为研究猪γ干扰素(poIFN-γ)的生物学活性及其在机体免疫应答中的作用机理,克隆并表达了猪IFN-γ基因。首先应用RT-PCR方法通过一对自行设计的引物从猪脾脏淋巴细胞中扩增了猪γ干扰素基因片段,分别将其定向插入原核表达载体pGEX-4T-1和pET-32 a中,经测序表明与已报道的核苷酸序列同源性为100%。接着将重组质粒pGEX-poIFN-γ和pET-poIFN-γ分别转化大肠杆菌BL21株,经IPTG诱导,得到高效表达。所表达的融合蛋白均以不溶性的包涵体形式存在,分子量分别为43.0和35.0 ku,与理论推算值相符。为研究IFN-γ在表达中结构的变化,采用上述2种融合蛋白分别作为免疫抗原和检测抗原。结果用GST-poIFN-γ免疫小鼠所诱导的抗体可与poIFN-γ产生特异性结合,表明不同原核质粒表达的猪IFN-γ仍保持其特有的结构。     

猪干扰素α在昆虫细胞中分泌表达及其抗病毒活性检测

 【目的】为获得重组猪干扰素α。【方法】本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪干扰素α基因插入供体质粒pFastBacⅠ多克隆位点,置于pH启动子控制下,昆虫可识别的蜂素信号肽（honeybee melittin signal peptide,HBM）取代猪干扰素α原有信号肽以实现分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。【结果】重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blot证明重组蛋白在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞（PK-15）上抑制水泡性口炎病毒（VSV）致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性,结果表明：昆虫细胞上清的抗病毒效价达到1.07×105 U?ml-1,昆虫细胞裂解液的抗病毒效价为3.15×104 U?ml-1。【结论】应用蜂素信号肽实现猪干扰素α在昆虫细胞上分泌表达,为临床上防治猪病毒性疫病奠定了基础。     

重组猪α干扰素理化性状及其体外抗病毒活性研究(摘要)(英文)

[目的]研究重组猪α干扰素(rPoIFN-α)半成品理化性状并对其体外抗病毒活性进行测试与鉴定。[方法]用HEp-2/VSV体系对3批rPoIFN-α蛋白进行抗病毒活性检测,以重组人IFN-α为参比品,测定干扰素效价;用0.25%胰蛋白酶HCl以及鼠抗猪α干扰素单克隆抗体作用已知效价的rPOIFN-α半成品,并检测各批次抗病毒活性,对rPoIFN-α理化性状进行评价;在猪肾细胞株(PK-15)上检测rPoIFN-α对猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病毒(PRV)的致细胞病变抑制效应,观察rPoIFN-α的体外抗病毒活性。[结果]HEp-2/VSV体系滴定rPoIFN-α半成品效价可达1.5×105IU/ml,比活性达1.1×106IU/mg;rPoIFN-α经0.25%胰蛋白酶37℃作用1h,效价残留率低于1%,经HCl(pH=2.0)处理72h效价残留率高达95%以上,经56℃处理30min效价残留率高于47%,经鼠抗猪α干扰素单克隆抗体37℃作用1h后效价残留率约为1%;体外抗病毒试验表明,用50和500IU/mlr PoIFN-α可分别抑制PRV和PPV对PK-15细胞株致细胞病变效应。[结论]rPoIFN-α具有IFN-α的基本理化性状,其在体外可分别抑制PRV、PPV对PK-15细胞株致细胞病变效应,但剂量有差别。     

交替氧化酶的原核表达、纯化及活性研究

利用原核表达系统BL21和FN102表达交替氧化酶,用镍-NTA(Ni-NTA)琼脂糖凝胶层析柱纯化交替氧化酶可溶蛋白,利用SDS-PAGE检测纯化蛋白电泳纯度,用分光光度法测蛋白活性.结果表明:FN102表达的交替氧化酶量高于BL21;在BL21表达系统中的蛋白电泳纯度＜10％,而在FN102中表达的纯化蛋白电泳纯度达到90％～95％;BL21中表达交替氧化酶纯化蛋白活性为165.1 nmol/(min· mg),FN102中表达的交替氧化酶纯化蛋白活性为64.0 nmol/(min·mg).     

猪γ干扰素基因真核重组表达质粒的构建及活性测定

以含有全长猪γ干扰素基因的质粒为模板,通过PCR方法扩增猪γ干扰素并引入酶切位点,酶切后与PCI真核表达载体连接在一起,测序后经比较,所扩增序列同Genebank报道的IFN-γ序列同源性为99·8%.将重组质粒转染PK细胞,检测所转染的pIFN-γ的抗病毒活性.试验结果表明,转染pIFN-γ试验组与正常细胞接毒对照组比较有显著差异,说明所构建的重组质粒转染后具有抗病毒作用.     

猪α干扰素的表达及在PAM细胞系中抗PRRSV活性检测

为研究猪α干扰素蛋白功能和了解猪α干扰素蛋白的抗病毒活性,扩增并测序了猪α干扰素基因(IFN-α),并克隆至原核表达载体pET-28a中,构建原核表达载体pET-IFN-α,将pET-IFN-α转化至BL21进行表达。Western-Blot结果表明,表达的蛋白具有很好的生物学活性。用细胞病变抑制法在PAM细胞系上进行抗病毒活性测定,结果表明,猪α干扰素有较为显著的抗PRRSV活性,其抗病毒活性效价约为1.13×106U/mg。     

鸡α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及其抗病毒活性测定

本试验将已构建的鸡α-干扰素重组酵母表达质粒pPIC-ChIFNα克隆至Pichia pastorisGS115基因组中,从阳性转化子中筛选出2株能高效表达鸡α-干扰素的重组酵母菌株,并对表达产物进行了纯化和抗病毒活性的测定。结果表明,Pichia pastoris表达的重组ChIFNα具有较高的抗病毒活性,其活性单位为570×104U/ml,结合蛋白定量计算其比活性为2 980×104U/mg。     

猪IFN-α8的原核表达及抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性研究

为确定猪干扰素α8(poIFN-α8)蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的抗病毒作用,合成poIFN-α8基因,克隆入pCSMH大肠杆菌表达载体,将重组表达载体转化DH5α感受态细胞,进行温度诱导表达后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳。将表达的目的蛋白利用Ni-琼脂糖凝胶纯化柱纯化后,采用Western blot试验检测重组poIFN-α8的反应原性,利用猪肺泡巨噬细胞（PAM）检测0.01、0.05、0.1、1 ng/mL的重组poIFN-α8蛋白对PRRSV的抗病毒活性,并检测重组poIFN-α8蛋白对下游干扰素刺激基因（ISG）Mx1、OAS1、ISG15的诱导激活作用。结果表明,成功构建了pCSMH-IFN-α8表达载体,实现了poIFN-α8在大肠杆菌中的包涵体表达,且重组poIFN-α8蛋白具有良好的反应原性;0.05 ng/mL的重组poIFN-α8蛋白可显著抑制PRRSV在PAM中的复制,poIFN-α8的抗病毒效果显著优于猪干扰素α2(poIFN-α2)、猪干扰素α5(poIFN-α5),且重组poIFN-α8能有效激活ISG的表达。综上,表达的重组poIF...     

犬α1干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒活性研究

亚克隆犬α1干扰素(CaIFN-α1)成熟蛋白编码基因并克隆到表达载体pPICZα-A,构建转移重组载体pPICZα-A-CaIFN-α。pPICZα-A-CaIFN-α经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了CaIFN-α1在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE检测结果表明表达产物相对分子质量约为2.7×104,比其推导结果(约1.9×104)大,推测可能是发生了糖基化。酵母分泌表达的CaIFN-α1具有较高的抗病毒活性,约为1.45×106U·mL-1,蛋白含量约为96mg·L-1,比活性为1.49×107U·mg-1。重组CaIFN-α1的生物学活性具有较强的种属特异性,在犬肾细胞(MDCK)上具有很高的抗病毒活性,在鸡胚成纤维细胞上活性较低,而在猫肾细胞(F81)和牛肾细胞(MDBK)上几乎没有抗病毒活性。进一步研究发现,重组犬α1干扰素对犬瘟热病毒和伪狂犬病毒在犬肾细胞中的增殖具有显著抑制作用。