扩增T-DNA插入位点侧翼序列的方法及其应用进展

T-DNA作为转化载体在植物分子生物学研究中得到广泛的应用。T-DNA插入位点侧翼序列的扩增方法有许多,常用的主要有热不对称交错PCR法（TAIL—PCR）、反向PCR法（I—PCR）和质粒挽救法（plasmid rescue）。笔者综述了这些方法的原理、优缺点和应用,为以T-DNA建立突变库研究植物功能基因组学提供新的途径。     

高效、新T-DNA侧翼序列分离技术——Actail-PCR

 【目的】建立一种有效分离T-DNA插入突变体侧翼基因组序列的方法。【方法】分离侧翼的目标基因组序列是利用T-DNA标签法研究植物功能基因组学的一个关键步骤,笔者发展稳定高效的Actail-PCR分离技术。该技术一侧引物来自于T-DNA载体,另一侧引物为一个复性控制引物。复性控制引物在3'端为一个14 bp的随机简并引物,在5'端非目标尾部序列接上一个通用引物,中间由5个多聚脱氧次黄嘌呤核苷（poly（dI））连接。【结果】Actail-PCR技术将随机简并引物重新编辑成复性控制引物,在40℃的低严谨条件下,3'端的随机简并引物可以与T-DNA插入突变体的侧翼目标区段随机的结合,扩增得到目标片段,随后利用5'端的通用引物与T-DNA载体上的巢式引物依次组合,在65℃（10个循环后逐步降温至58℃）的高严谨条件下逐步扩增特异片段,同时抑制非特异性扩增,可以显著提高目标片段的扩增效率,减少假阳性。【结论】相对传统的TAIL-PCR,Actail-PCR技术可以更高效地分离T-DNA插入突变体的侧翼基因组序列。     

水稻抗白叶枯病T-DNA插入突变体侧翼序列的分离和分析

采用PCR-walking方法对水稻抗白叶枯病突变体G48的侧翼序列进行分析。通过特异性嵌套引物扩增和序列比对分析获得了该突变体T-DNA左、右边界侧翼序列,确定T-DNA插入水稻日本晴第三染色体clone OSJNBa0076E06(AC132215.1)位点上,左、右边界插入位点分别位于该克隆的第93 750、93 824碱基处。PCR-walking方法为T-DNA的侧翼序列分析提供了一种简单、高效的方法。     

棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体表型特征和侧翼序列分析

【目的】为鉴定棉花黄萎病菌随机插入突变体的表型特征,构建黄萎病菌遗传转化和功能基因研究的技术平台。【方法】采用农杆菌介导的T-DNA插入和高效TAIL-PCR方法。【结果】获得了2628个棉花黄萎病菌VD991的T-DNA随机插入的突变体和15个突变体插入位点的侧翼序列。部分突变体的表型特征和插入位点侧翼序列分析表明,①突变体的菌落形态分为菌丝型、菌核型和中间型3类,菌核型约占7.3%;②在摇瓶培养条件下,突变体产孢高峰在接种后第5—6天,菌核型突变体的产孢能力普遍高于菌丝型;③棉花黄萎病菌VD991可以产生胞外蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶。筛选获得蛋白酶分泌缺失的突变体3个,淀粉酶分泌缺失的突变体1个,果胶酶分泌降低的突变体6个;④菌核型突变体的致病力普遍高于野生型。获得了6个致病力减弱的突变体;⑤突变体侧翼序列与同种的大丽轮枝菌菌株VDLs.17基因组的序列一致性在95%—100%之间,与不同种的黑白轮枝菌VaMs.102序列的一致性为87%—94%。【结论】农杆菌介导的T-DNA随机插入可用于棉花黄萎病菌突变体的构建,突变体微菌核的产生与其产孢能力、致病性存在相关关系。美国大丽轮枝菌菌株VDLs.17基因组可用作黄萎病菌VD991功能基因研究的参考序列。     

稻瘟菌若干T-DNA插入突变体初步分析

为揭示稻瘟菌致病分子机制,创建了该菌T-DNA插入突变体库．部分突变体经表型分析,获得3个生长发育及致病性同时发生变异,5个生长发育正常但致病性变异及2个生长发育变异但致病性正常的突变体；以TAIL-PCR方法获得了这些突变体T-DNA插入位点及其边界序列,并用生物信息方法对被T-DNA标签的基因进行了分析,为进一步研究这些基因的功能提供了重要信息．     

稻瘟菌T-DNA插入突变体的培养基筛选试验

采用3种培养基进行稻瘟菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr,无性世代为Pyricularia oryzae（Cooke）Saccard。]菌落生长及产孢条件的分析。结果表明,在相同条件下,3种培养基中以PDA琼脂培养基最适宜于稻瘟菌突变体的生长,在产孢培养条件观察中也发现,PDA琼脂培养基中的突变体产孢效果最好。     

稻曲病菌突变体B-726生物学性状分析及其T-DNA插入位点侧翼序列的克隆

【目的】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B-726的生物学性状,分析其T-DNA插入位点的侧翼序列,克隆因外源基因插入被破坏正常表达的基因,为明确该基因在稻曲病菌致病过程中的作用奠定基础,并为稻曲病防治新途径的制定提供理论依据。【方法】通过测定突变菌株B-726生长速率、产孢能力及致病力检测,分析其生物学性状;Southern杂交分析B-726外源基因插入的拷贝数;利用HiTail-PCR 获得T-DNA插入位点的侧翼序列;运用RACE-PCR技术,克隆与插入位点毗邻的基因全长;用半定量RT-PCR分析该基因表达情况。【结果】突变菌株B-726与野生菌株P1相比致病力极显著下降,产孢能力、生长速率显著下降。Southern杂交结果显示T-DNA在菌株B-726中以单拷贝形式插入。经过序列分析发现,T-DNA插入在1个命名为Uvt-726上游344 bp处,半定量PCR结果表明,Uvt-726在B-726表达量较P1显著下降。【结论】克隆了1个可能与稻曲病菌致病力相关的基因,推断该基因在稻曲病菌致病过程中起着重要的作用。     

稻曲病菌T-DNA插入突变体5062的插入位点分析

【目的】研究稻曲病菌致病力增强的ATMT突变菌株5062,为稻曲病菌致病机制解析、致病相关基因克隆提供方法基础。【方法】测定和观察5062的菌落直径、菌落形态、产孢能力等生物学特性,进一步利用TAIL-PCR和RACE技术克隆5062基因组的T-DNA侧翼基因,并比对分析基因的信息,最后利用RT-PCR检测突变基因的表达量。【结果】与野生型菌株相比,突变菌株5062田间接种表现为致病力增强,在MM和水琼脂培养基上生长速率减慢,产生大量分生孢子,而在PSA和TB3培养基上,其菌落形态、色素等方面与野生型无明显差异。TAIL-PCR扩增得到的紧邻T-DNA两侧的侧翼序列在野生型中不相邻。TAIL-PCR结合RACE技术克隆了5062基因组的T-DNA侧翼基因,RT-PCR表明T-DNA插入位点右侧1个基因在突变体中上调表达。【结论】突变菌株5062的致病力增强,在营养贫乏条件下产孢能力增强,其表型的变化可能是染色体重排和T-DNA插入共同影响的结果。     

转抗草甘膦基因烟草T-DNA侧翼序列的扩增与分析

[目的]研究抗草甘磷基因在烟草中的插入位点、T—DNA结构等整合情况。[方法]利用现有的3个转抗草甘膦基因的烟草材料,通过PCR Walking的方法扩增出携带抗草甘膦基因的T-DNA侧翼序列,并用DNAMAN、BLAST等生物信息学方法进行分析。[结果]对获得的PCR条带进行分析,结果表明这些侧翼序列均含载体骨架序列且结构各不相同。T-DNA和载体骨架序列都存在重组现象。[结论]研究在转基因植株中检测到了载体的骨架结构,说明转基因的同时有可能会造成非目的基因的转移,即转基因植物存在一定的风险,应对转基因植物转化载体和基因工程技术路线进一步改良。     

柱花草炭疽菌突变体库致病缺陷转化子筛选 及T-DNA插入位点侧翼序列分析

比较了接种病原菌侵染柱花草的几种方法的效果,选定出最佳的初筛和复筛方法,进而对1 230 个转化 子进行筛选,得到致病力缺陷菌23 株,其中致病力减弱的菌株18 株,致病力完全丧失的5 株。利用TAIL-PCR 扩增 致病力丧失突变子t-2430 的T-DNA 插入位点侧翼序列,得到大小为476 bp 的一段序列,BLAST 比对已测序炭疽菌 基因组,发现401nt 和数据库的Contig464的部分序列完全一致,进一步对该段序列的功能进行预测,表明T-DNA 插入 在一预测基因的启动子区域,并且这个预测基因与稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae）的天冬氨酸转氨酶(XP_003719674.1）同 源性为79%。     

一株玉米弯孢叶斑病菌生长缓慢型突变株获得及T-DNA右翼序列分析

本试验采用农杆菌介导的遗传转化方法获得了1个菌落生长缓慢型的突变体,通过抗性基因(hph)的扩增及分子杂交验证了T-DNA以单拷贝的方式插入基因组中.对突变体的一些生物学性状与野生型CX-3比较,结果发现突变体的菌落生长速度是野生型CX-3的42%,其产孢量为野生弄CX-3的18%,但是对离体玉米叶片的致病力与野生型C...     

转基因油菜W-4 T-DNA旁侧序列分析与事件特异性检测

W-4是通过农杆菌介导法将fad2基因的反向重复序列表达框转入甘蓝型油菜Westar后获得的转基因高油酸油菜品系.为建立W-4的转基因事件特异性PCR检测技术,应用温度不对称PCR（TAIL-PCR）扩增获得转基因油菜W-4的T-DNA插入位点的左、右旁侧序列.其中右边界旁侧序列长度为290 bp,其碱基组成G＋C含量为31.27％、A＋T含量为68.73％;左边界旁侧序列长度为365 bp,其碱基组成G＋C含量为32.6％、A＋T含量为67.4％,表明该T-DNA整合在富含AT区.序列比对结果发现,该转基因事件中,T-DNA左边界序列完全整合到油菜基因组中,仅有1个碱基由G转换成了A.而右边界则缺失了包括RBborder在内的62个碱基.结果表明：转基因高油酸油菜T-DNA的整合是一次无载体序列的整合.依据左、右边界旁侧序列和转基因载体的T-DNA左右边界序列设计了2对特异性引物TLF/TLR和TRF/TRR,能从W-4基因组DNA中扩增出大小分别为485和405 bp的预期产物,而在其他转基因油菜、非转基因油菜的基因组DNA和空白对照中均无特异性扩增产物,据此建立了W-4的转基因事件特异性PCR检测技术.应用该检测技术可以从含有0.1％ W-4基因组DNA的混合样品中扩增出特异产物,检测灵敏度达0.1％.可对W-4的转基因事件进行特异性检测.     

优化反向PCR法分离转基因油菜外源T-DNA侧翼序列的研究(英文)

[目的]优化反向PCR(IPCR)条件分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。[方法]以单拷贝的转基因油菜FS4为研究材料,用SDS法和改良CTAB法(包括低温操作、增加酚氯仿的抽提次数以及延长低温沉淀时间等)提取转基因油菜总DNA,并进行酶切、纯化、自连接,再使用普通聚合酶与热启动高保真的ExTaqHS聚合酶进行两轮巢式PCR扩增,进行序列对比。油菜数据库比对搜索采用BBSRCBrassicaDB上WU-BLAST2.0工具,拟南芥数据库比对分析采用TAIR数据库中WU-BLAST2.0工具。为验证FS4转基因中T-DNA插入位点的真实性,根据序列比对分析结果在T-DNA插入位点的左右两端分别设计引物FS4-L与FS4-R。分别采用3对引物pS2/FS4-L、pA2/FS4-R、FS4-L/FS4-R同时对T1代转基因FS4杂合体和非转基因对照植株的基因组进行PCR验证。[结果]两轮巢式PCR扩增得到1个大小为4.0kb的片段,其序列与油菜数据库中BH652424和BZ044084两序列同源性分别高达97.8%和63.4%。根据序列比对结果设计特异引物对进行PCR验证的结果,也证明了FS4转基因油菜中T-DNA的确插入在该位点。[结论]优化后的IPCR条件能成功分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。     

优化反向PCR法分离转基因油菜外源T-DNA侧翼序列的研究

[目的]优化反向PCR（IPCR）条件分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。[方法]以单拷贝的转基因油菜FS4为研究材料,用改良CTAB法提取转基因油菜总DNA,并进行酶切、纯化、自连接,再通过两轮巢式PCR扩增,进行序列对比。[结果]两轮巢式PCR扩增得到1个大小为4.0kb的片段,其序列与油菜数据库中BH652424和BZ044084两序列同源性分别高达97.8%和63.4%。根据序列比对结果设计特异引物对进行PCR验证的结果,也证明了FS4转基因油菜中T-DNA的确插入在该位点。[结论]优化后的IPCR条件能成功分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。