牛病毒性腹泻病毒与宿主细胞的相互作用研究

自1946年Olafson等首次在美国纽约州发现牛病毒性腹泻病毒(BVDV)以来,该病毒在世界各地广泛流行和传播,尤其对一些畜牧业发达国家的奶业和牛肉业造成了巨大损失.了解牛病毒性腹泻病的致病机理,研制出更加安全可靠有效的疫苗,对控制该病的发生和蔓延尤为重要.对BVDV的病原学、生物学特性以及对宿主细胞的相互作用等进行了阐述,以期为BVDV的预防及治疗奠定基础.     

山羊体细胞重编程过程中慢病毒对细胞的毒性作用

[目的]检测慢病毒对普通山羊、克隆奶山羊和转基因克隆奶山羊的作用.[方法]采用慢病毒作为载体感染普通山羊、克隆奶山羊(♂12001)和转基因克隆奶山羊(♀12003)体细胞,通过细胞生长曲线,检测慢病毒对3种山羊细胞的毒性作用.[结果]感染后的3种体细胞在感染前3 d,细胞大量凋亡,4~7 d筛选出的细胞大量增殖.未经慢病毒感染的3种细胞接种2 d后数量开始明显增加,第25天进入对数生长期,第57天进入平台期,呈现典型的"潜伏期-对数生长期-停滞期"生长模式.[结论]慢病毒对细胞有毒性作用,会引起细胞大量凋亡.     

牛SREBP1基因shRNA序列的筛选及其腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】筛选可靶向干扰牛的SREBP1基因的有效shRNA,构建相应腺病毒载体并包装重组腺病毒,为在细胞水平上研究SREBP1基因的功能和作用机制提供基础。【方法】以秦川牛SREBP1基因为研究对象,首先靶向其编码区（coding sequence,CDS）序列设计并合成6条干扰和1条阴性对照shRNA,并构建表达载体pENTR-U6-shRNA。然后与载体psiCHECK-Ⅱ-SREBP1共转染293A细胞,筛选有效的pENTR-U6-shRNA。其次将筛选的pENTR-U6-shRNA和阴性对照pENTR-U6-NC分别与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST体外重组,得到腺病毒重组载体,并在293A细胞包装扩繁得到高滴度腺病毒,GFP标记法测定病毒滴度。最后将病毒侵染牛前体脂肪细胞,实时荧光定量法（qRT-PCR）检测干扰效率。【结果】筛选出靶向牛SREBP1基因干扰效率为87.4%的shRNA-1053。构建了pAd-1053和阴性对照pAd-NC重组腺病毒载体并包装得到Ad-1053和Ad-NC高滴度病毒,测定得到的病毒滴度分别为7×108 GFU•mL-1和9×108 GFU•mL-1。Ad-1053和Ad-NC分别侵染牛前体脂肪细胞,qRT-PCR检测结果显示Ad-1053可显著降低SREBP1基因的mRNA 水平（干扰率＞85%）,而Ad-NC对SREBP1基因表达无明显影响。【结论】成功筛选得到靶向干扰牛SREBP1基因的有效shRNA,并包装扩繁获得相应的高滴度重组病毒。     

秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】旨在通过构建秦川牛FABP4基因的重组腺病毒载体,为在细胞水平研究FABP4基因的功能和作用机制做准备。【方法】根据GenBank收录的牛FABP4基因mRNA序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV上并用PmeⅠ线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的E. coli BJ5183感受态细胞进行同源重组,得到重组质粒pAd-FABP4,并用PacⅠ酶切鉴定。将经过PacⅠ线性化的pAd-FABP4转染HEK 293A细胞进行病毒包装和扩增,TCID50法测定病毒滴度。【结果】经测序鉴定本次克隆的FABP4 序列与GenBank收录的一致。 酶切鉴定、绿色荧光观察、PCR及测序检测均证明,重组腺病毒载体构建成功并获得重组腺病毒AD-FABP4,病毒滴度为1.58×109 PFU•mL-1。【结论】成功构建了秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体并获得高滴度的重组腺病毒。     

南阳牛肌肉发育过程中IGF基因家族的表达变化研究

 IGF基因家族对肌肉发育起重要的调控作用,而目前对牛肌肉发育过程中IGF基因家族的表达变化研究还不充分。本研究利用荧光实时定量PCR技术分析了南阳牛3月龄到24月龄期间背最长肌组织中IGF,IGF受体和IGF结合蛋白基因的表达变化规律,发现IGF1,IGF2,IGF1R,IGF2R,IGFBP1和IGFBP3的表达量均呈现出明显的下降趋势,其中18月龄和24月龄时的表达量与3月龄时相比显著低（P<0.05）;IGFALS也呈现出下降的趋势,但表达量在各个时期没有显著的差异（P>005）;IGFBP2,IGFBP4和IGFBP6在6月龄时表达量上升,在12月龄和18月龄时表达量降低,在24月龄时表达量再次上升,但各个时期表达量均无显著差异（P>005）;IGFBP5表现出先升高而后降低的趋势,6月龄比24月龄时表达量显著高（P<005）,其他各月龄之间差异不显著。本研究对IGF基因家族在南阳牛肌肉发育过程中的表达变化进行了系统的研究,为进一步深入分析IGF系统在牛肌肉发育过程中的作用提供了有力的理论基础。     

贴壁和悬浮状态293T细胞慢病毒包装效果的比较研究

为提高慢病毒包装效率,比较了贴壁和悬浮293T细胞的磷酸钙法慢病毒的包装效果.结果表明,利用悬浮细胞获得的病毒滴度较贴壁细胞高近3.5倍,同时这种方法具有很好的重复性,且悬浮细胞可直接用于病毒包装,节省了24 h的细胞培养时间.     

猪流行性腹泻病毒感染Vero细胞的细胞病理学研究

对感染猪流行性腹泻病毒(PEDV)的Vero细胞进行透射电镜观察发现:在病毒感染初期(6h),尽管细胞结构完整,部分细胞线粒体、粗面内质网扩张,胞浆出现空泡;随着感染时间的增长(12h),病毒粒子逐渐增多,细胞质内出现较多空泡状结构,病毒粒子先后出现在胞浆及细胞核内部;感染24h后,病毒粒子数目显著增多,空泡化明显,出现细胞核分解,细胞融合更加明显;感染最后阶段(48h),空泡化严重,核质固缩,细胞间大量融合,病毒粒子出芽排出。以上结果,为揭示猪流行性腹泻病毒的感染与致病机制积累了数据。     

牛瘤胃不同生理状态慢电位与峰电位随机波的概率分析

本研究运用生理学、概率论及数量统计的方法对牛瘤胃不同生理状态胃电活动中的慢电位与峰电位随机波的概率分布情况进行了分析。给出了随机波相应的均值、方差、概率密度图及概率分布函数图。同时还对牛瘤胃慢电位与峰电位随机波间的概率分布差异情况进行了分析和比较。     

SARS病毒E基因的克隆与重组腺病毒rAdE-E的构建

为了进一步研究SARS病毒E蛋白的功能以及在SARS致病机理中的作用,我们通过touch-down PCR程序,从SARS病毒WHU株（GenBank accession number AY394850.1）cDNA文库中扩增了E基因,并通过基因工程技术及腺病毒系统构建了重组腺病毒rAdE-E.DNA测序、酶切鉴定及荧光检测（GFP表达）结果均表明：重组腺病毒rAdE-E构建成功.     

牛LncRNA-133a对骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

【目的】 探讨长链非编码RNA LncRNA-133a对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化过程的影响。【方法】 利用测序样品3、6、9月龄胎牛及24月龄成年和牛骨骼肌肌肉组织,qRT-PCR法检测LncRNA-133a的组织时序表达谱。构建牛骨骼肌卫星细胞的体外成肌诱导分化模型,模拟牛骨骼肌的生长发育过程,qRT-PCR法检测LncRNA-133a和肌细胞分化标记因子MyoG、MHC的细胞时序表达谱。利用过表达LncRNA-133载体（pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a） 或LncRNA-133a抑制物（si-LncRNA 133a） 转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法检测转染效率以及各转染处理组LncRNA-133a、MyoD、MyoG及MHC基因mRNA的表达水平,Western blotting检测MHC 基因的蛋白表达水平;同时,通过EdU细胞增殖检测、免疫荧光蛋白染色技术检测牛骨骼肌卫星细胞增殖阶段的细胞增殖量和分化阶段的肌管融合程度。【结果】 组织表达谱分析发现LncRNA-133a在3月龄胎牛肌肉组织中表达量最高,6月龄胎牛肌肉组织中次之,9月龄胎牛及成年牛肌肉组织中表达量最低,时序表达呈下降趋势;利用成功构建的牛骨骼肌卫星细胞体外诱导分化模型,进行LncRNA-133a、MyoG、MHC的细胞时序表达谱分析,结果发现在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中（D0-D3）,肌分化标记因子MyoG、MHC的表达水平逐渐升高,LncRNA-133a的表达在分化阶段呈上升趋势,且分化48 h时（D2）表达量最高;成功构建的过表达LncRNA-133a或抑制LncRNA-133a的牛骨骼肌卫星细胞模型,在增殖期（D0）：与对照组相比,过表达LncRNA-133a处理组EdU增殖染色检测得到EdU阳性细胞数显著增加（P<0.01）,而LncRNA-133a抑制处理组EdU阳性细胞数显著减少（P<0.01）;在分化48 h时（D2）：与对照组相比,LncRNA-133a过表达处理组肌细胞分化标记因子MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平显著升高（P<0.05）,Western blotting检测MHC蛋白表达量显著增加（P<0.01）,且MHC蛋白的免疫荧光蛋白染色检测观察到融合肌管的体积占比更大;而LncRNA-133a抑制处理组MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平均降低,其中MyoG显著降低（P<0.05）, MHC蛋白表达量显著减少（P<0.01）,同时MHC蛋白融合肌管的体积占比也降低。【结论】 研究证实LncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的作用,为进一步挖掘LncRNA-133a调节牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控网络机制奠定了基础。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养

1材料与方法 1．1材料 1．1．1乳腺组织。从屠宰场选取健康的泌乳期奶牛,无菌手术切取乳腺实质组织,置于DMEM／F12完全培养液（含10％胎牛血清、100IU／ml青霉素和链霉素）中,尽快运回实验室。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养

[目的]探讨在生化培养箱中进行奶牛乳腺上皮细胞原代培养的可行性。[方法]采用组织块法,在体外进行乳腺上皮细胞的分离培养,探索其在生化培养箱中合适的培养条件。用倒置显微镜观察、细胞爬片吉姆萨染色和角蛋白免疫组织化学染色的方法对培养细胞进行形态学观察和鉴定。[结果]通过倒置显微镜观察发现,上皮细胞呈多角形,长满后呈上皮细胞特有铺路石样。细胞染色可见上皮细胞胞体较大,胞核深蓝色,圆形或椭圆形,核仁清晰可见,一般为2-4个。免疫组化鉴定结果显示,培养的细胞表达上皮细胞特异的角蛋白14和18。[结论]原代奶牛乳腺上皮细胞可以在生化培养箱中成功培养。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养(英文)

[Objective] To investigate the feasibility of the primary culture of bovine mammary epithelial cells in biochemical incubator. [Method] In vitro, bovine mammary epithelial cells were isolated and cultured by the tissue explant method in order to investigate the optimal culture conditions. The morphology observation and identification of the cultured cells were performed by inverted microscope observation, Giemsa staining and cytokeratin immunohistochemistry. [Result] Observed with inverted microscope, most of the bovine mammary epithelial cells were polygonal and displayed typical slabstone-like appearance. As it can be seen from cell staining results, the cell body was big and the nucleus was stained dark blue and was round or oval in shape, with clearly visible nucleoli, generally 2-4 nucleoli. The tissue-specific expression of cytokeratin 14 and cytokeratin 18 genes in mammary epithelial cells was identified by cytokeratin immunohistochemistry. [Conclusion] Primary bovine mammary epithelial cells were successfully cultured in biochemical incubator.     

北京油鸡骨骼肌卫星细胞的分离、培养、鉴定及成肌诱导分化的研究

【目的】探讨体外培养条件下北京油鸡骨骼肌卫星细胞分离、培养及鉴定的方法,建立适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,为今后进一步研究北京油鸡骨骼肌卫星细胞提供技术平台。【方法】以15日龄的鸡胚胸肌为材料,采用联合酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法纯化细胞,使用Pax7、Desmin、Myod等骨骼肌卫星细胞的特异性标志对所得细胞进行免疫荧光鉴定,随后进行成肌诱导分化,并比较了3种培养体系对骨骼肌卫星细胞增殖的影响。【结果】细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,证实所培养的细胞为北京油鸡骨骼肌卫星细胞;成肌诱导后,细胞相互融合形成多核的肌管,成肌特异性标志MHC表达呈阳性;对不同扩增培养体系比较,结果表明,培养体系DMEM/F12+15%FBS+2.5ng·mL-1bFG最有利于北京油鸡骨骼肌卫星细胞的增殖。【结论】该试验成功地分离并鉴定了北京油鸡骨骼肌卫星细胞,建立了适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,同时成功地进行了成肌诱导分化,为今后研究北京油鸡骨骼肌生长和发育的机理提供了技术平台。     

牛乳腺干细胞的分离和生物学特征

为获得牛乳腺干细胞并对其生物学特征进行研究,通过悬浮培养,从体外培养的乳腺上皮细胞分离得到乳腺干细胞球,并通过RT-PCR、Western-blot、免疫组化染色和流式细胞分析对其表面抗原标记特征和分化特征进行研究。结果表明,牛乳腺干细胞表达CD29和CD49f,可以分化为腺上皮细胞和肌上皮细胞。该分离方法增加了获得牛乳腺干细胞的途径,特异性标记物CD29和CD49f可用于其生物学特征研究。     

PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

【目的】探究蛋白酶体β5亚基(proteasome subunit beta type-5, PSMB5)对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究蛋白酶体亚基PSMB5在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。【方法】利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,模拟牛骨骼肌生长发育过程,首先检测牛骨骼肌卫星细胞分化前后PSMB5的表达变化,采用qRT-PCR法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后基因表达水平的差异,采用Western blotting法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后蛋白表达水平的差异。然后设计合成PSMB5的小干扰RNAsi-RNA-PSMB5 (si-PSMB5),构建PSMB5过表达质粒载体pcDNA3.1-PSMB5(pcDNA-PSMB5),采用(Lipofectamine)3000转染试剂将si-PSMB5和pcDNA-PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法及Western blotting法检测转染效果。最后采用EdU染色的方法检测干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星增殖的影响;进一步对牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分...     

wnt/β-catenin 信号通路对动物卫星细胞向不同肌纤维类型分化的作用

动物出生后骨骼肌在生长发育和再生过程中,卫星细胞发挥着十分重要的作用,其分化及形成肌纤维的类型与肉品质密切相关,wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路是调节此过程的重要信号通路。近几年,wnt/β-catenin信号通路在骨骼肌生长和再生过程中的作用及机制研究受到人们的重视,已积累了一些相关研究成果。本综述系统阐述了wnt/β-catenin信号通路在卫星细胞自我更新、分化以及肌纤维类型形成中的作用。     

肉仔鸡卫星细胞氧化应激时MAPK信号通路

 【目的】在地塞米松(DEX)诱导骨骼肌卫星细胞氧化应激的体外条件下,筛选丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号系统中起关键作用的信号通路。【方法】 将体外培养的肉仔鸡胸肌骨骼肌卫星细胞(SCs)分别进行处理：Ⅰ、对照组;Ⅱ、DEX;Ⅲ、p38 MAPK抑制剂;Ⅳ、DEX+p38 MAPK抑制剂;Ⅴ、JNK抑制剂;Ⅵ、DEX+JNK抑制剂;Ⅶ、ERK5抑制剂;Ⅷ、DEX+ERK5抑制剂;Ⅸ、ERK1/2抑制剂;Ⅹ、DEX+ERK 1/2抑制剂。除处理Ⅰ和处理Ⅱ外,其它处理首先用抑制剂预处理30 min,弃去培养基后,再按处理设置分别加入含DEX的培养基或者正常培养基继续处理24 h。处理结束后,分别测定细胞培养液中丙二醛(MDA)、活性氧自由基(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽硫转酶(GST)含量或活性;同时采用RT-PCR方法检测通路蛋白及SOD与GST基因表达量。【结果】 抑制剂单独处理组MDA和ROS的产生量显著低于DEX处理(P＜0.05);DEX+ERK5抑制剂处理与DEX+ERK 1/2抑制剂处理的MDA和ROS产生量显著高于ERK 5抑制剂处理和ERK1/2抑制剂处理(P＜0.05); DEX+p38 MAPK抑制剂处理与 DEX+JNK抑制剂处理组的MDA和ROS产生量与p38 MAPK处理和JNK处理的差异不显著(P＞0.05)。抑制剂单独处理组的SOD和GST活性比DEX处理高(P＜0.01);DEX+ERK5抑制剂处理与 DEX+ERK 1/2抑制剂处理的SOD和GST活性极显著低于ERK5抑制剂处理组和ERK1/2抑制剂处理组(P＜0.01),DEX+p38 MAPK抑制剂处理与DEX+JNK抑制剂处理的SOD和GST活性与p38 MAPK抑制剂处理和 JNK抑制剂处理的差异不显著(P＞0.05)。基因表达结果表明,DEX能够抑制GST和SOD基因的表达,抑制率达37%以上。与抑制ERK5和ERK1/2通路不同,抑制p38 MAPK和JNK通路后,DEX对GST和SOD基因的表达无明显抑制作用。【结论】 在DEX诱导的肉仔鸡胸肌骨骼肌SCs产生的氧化应激过程中,p38 MAPK和JNK通路起着关键作用。