花粉管法将外源除草剂基因导入红麻的有效方法及参数研究

本研究利用花粉管通道法将携带有外源抗除草剂的bar基因导入红麻,分析了不同导入方法(子房注射法、柱头滴加法)和技术参数对受体植株当代结实率、T1代种子出苗率及转化率的影响.结果表明:不同导入方法在受体当代结实率、T1代种子出苗率上存在较明显的差异.其中子房注射法结实率高于柱头滴加法,而出苗率则相反.外源DNA导入浓度和剂量对受体当代结实率、T1代种子出苗率则无显著影响;并确定除草剂PPT对红麻青皮3号受体品种的幼苗期(3-4叶期)的筛选浓度为70μg/ml,用该浓度PPT溶液筛选转化株,其T1代有12%的植株表现出对除草剂的抗性,其推断转化株的比率随外源DNA导入浓度及剂量的增大而提高,子房注射法较柱头滴加法其T1代有更高的推断转化株比率     

花粉管法将外源除草剂基因导入红麻的有效方法及参数研究

本研究利用花粉管通道法将携带有外源抗除草剂的ｂａｒ基因导入红麻，分析了不同导入方法（子房注射法、柱头滴加法）和技术参数对受体植株当代结实率、Ｔ１代种子出苗率及转化率的影响。结果表明：不同导入方法在受体当代结实率、Ｔ１代种子出苗率上存在较明显的差异。其中子房注射法结实率高于柱头滴加法，而出苗率则相反，外源ＤＮＡ导入浓度和剂量对受体当代结实率，Ｔ、代种子出苗率则无显著影响；并确定除草剂ＰＰＴ对红麻青皮     

CaCl2诱导大豆花粉管通道农杆菌转基因研究

为了提高大豆花粉管通道法转基因效率,研究直接用农杆菌转化方法的可行性,以秋大豆品种上海本地青为受体材料,用花粉管通道法在三种CaCl2浓度水平下进行质粒pCAMBIA3301转化,又以GV3101、LBA4404、EHA105三种农杆茵菌株直接导入花粉管通道为处理进行了遗传转化.以质粒为外源基因平均结实率为36.83%,T0代种子平均成活率为60.89%,T1植株喷施除草剂后平均存活率为8.24%.以农杆菌直接转化平均结实率为15.92%.T0代种子平均成活率为20.40%,T1植株喷施除草剂后平均存活率为7.79%.对存活的植株提取DNA进行PCR检测,以质粒为外源基因的处理共获得20株转化苗,三种CaCl2浓度水平的转化效率分别为0.56%、1.64%、1.40%,有两种水平的转化效率约为传统转化效率的三倍.以农杆菌直接转化的处理共获得5株转化苗,转化效率分剐为0.17%、0.33%、0.29 %.     

小麦花粉管通道法转基因研究

为了培育抗穗发芽的种质资源,以13个小麦品种(品系)的植株体为受体材料,用花粉管通道及子房注射法进行了硫氧还蛋白反义基因(Anti-TrxS,与穗发芽抗性有直接关系)的遗传转化。花粉管通道法共处理小花2036朵,收获T0代种子1616粒,结实率为79.4%,将T0代种子大田点播成株行,T1代共出苗1424棵,出苗率为88.1%。对T1代苗按品种和处理组合的方式进行抽样检测,抽样株系取10个单株分别提取叶片基因组DNA,然后将单株叶片DNA等量混合,进行株系基因组DNA的PCR检测。检测结果为31个株系中有16个株系呈阳性反应。子房注射法共转化豫麦49、豫麦70、豫麦18、郑新991和95519等5个小麦品种(品系)的小花1206朵,收获种子89粒,结实率为7.4%,T1代共出苗41棵,出苗率为46.1%。对郑新991T1代株系(12棵幼苗的叶片基因组DNA混合样)进行PCR检测,电泳结果呈阳性反应。     

子房注射法转化五唇兰的初步研究

采用子房注射法成功地将外源DNA导入五唇兰。结果表明：外源DNA在转化植株成熟果实中种子的GUS染色率达6.7％,无菌播种后经潮霉素筛选,获得18株幼苗,每株幼苗切取幼叶及幼根进行GUS检测,均为阳性;随机挑选7株幼苗进行PCR检测,均能扩增出GUS基因和潮霉素抗性基因条带,说明外源基因已经整合到植株基因组内。子房注射法在兰科植物转基因中的成功应用,可为兰科植物育种提供一种简单高效的途径。     

BcWRKY1转录因子基因花粉管通道法转化玉米的初报

采用花粉管通道法,以LH1037、合344、05-2044等7份优良玉米自交系为试材,转化转录因子BcWKKY1基因,并优化了遗传转化体系。结果表明,当转化DNA溶液浓度为200μg/mL、授粉后9 h转化,结实率和转化率最高;转基因玉米的发芽率均低于非转基因对照。共获得T0代PPT抗性植株89株,PCR阳性植株55株,其中36株结实。T1代转基因植株的PCR和PCR-Southern阳性率为86.7%。     

利用花粉管通道技术将抗虫基因导入大豆的研究

利用花粉管通道技术，将Bt基因导入大豆品种。对132株D1代植株进行PCR检测，得到5株阳性转化植株。再将获得的5株D1代阳性转化植株的种子放在温箱中发芽，提取DNA进行检测，结果得到2株D2代稳定遗传的阳性转化植株。用X－Glue溶液对转Bt基因132株D1代植株进行检测，结果没有发现阳性反应。另外，本实验还采用荧光制片方法从植物组织结构的角度证明利用花粉管通道方法导入外源基因的可行性，并提出花粉管通道方法操作的最佳时间为授粉后6－20h。     

子房注射法转化‘紫宝石’蝴蝶兰的研究

采用子房注射法对‘紫宝石’蝴蝶兰进行外源DNA导入研究,结果表明:不同时期注射和不同注射处理方式对‘紫宝石’蝴蝶兰的落果率影响不同,对胚座组织和种子的GUS染色率的影响也不同,在授粉后65 d时,以2%DMSO为缓冲液,注射400μg/mL浓度质粒,种子的GUS染色率最高达6.14%。选取各注射时期无菌播种后获得的1 000个原球茎,经系列浓度的潮霉素筛选,结果发现授粉后65 d注射时获得的抗性植株最多,为31株,转化率为3.1%。切取转化植株幼叶及幼根进行GUS检测,均为阳性;随机挑选7株幼苗进行PCR检测,均能扩增出GUS基因和HPT基因条带,说明外源基因已经整合到植株的基因组内。此研究为兰科植物育种提供了一种简单高效的途径。      

花粉管通道介导的抗除草剂基因(bar)对大豆的遗传转化

采用花粉管通道介导法将含有bar基因的pPTN140质粒DNA导入8个黑龙江省大豆主栽品种（系）,导入1384朵花,共获得1164粒种子,经2次Basta除草剂筛选后共获得3个品种的除草剂抗性植株8株.对其进行PCR以及PCR-Southern杂交检测均为阳性结果,Southern杂交结果显示,8个除草剂抗性后代植株整合数目不同,其中2株整合单拷贝基因,另外6株分别整合3～8个拷贝的bar基因.对8个抗性植株的后代进行了除草剂抗性分析,D1-D3代均出现除草剂抗性植株,表明bar基因可以在转基因植株后代中遗传,抗性遗传分析结果表明不同株系间以及株系内除草剂抗性缺乏规律性,分离比率不符合孟德尔遗传规律.说明大豆花粉管通道法转化基因存在多拷贝共抑制现象.目前获得除草剂抗性稳定的D3代株系82个.试验说明利用花粉管通道技术进行大豆转化是可行的.     

利用农杆菌介导合子胚转化法将Bar基因转入玉米自交系的研究

基于农杆菌介导的合子胚转化方法是一种具有自主知识产权的转基因新方法。利用该方法转化玉米合子胚,可直接获得转化种子。以东北春玉米区玉米自交系8902、Pa91、丹340作为转化受体,通过合子转化法进行抗草丁膦除草剂基因Bar的转基因研究。在获得的3 560份材料中,通过对T_1代种子苗叶面喷施草丁膦除草剂Basta,共获得153株抗性植株,抗性频率为4.3%。PCR鉴定阳性植株为102株,转化频率为2.87%。对PCR检测出的阳性植株进行自交获得T_2代,对材料继续进行抗性筛选,对抗除草剂表型的分离比率进行抗性遗传分析。     

国槐DNA导入花生栽培品种引起性状变异的研究

以国槐为供体,花生栽培品种79266和辐8707为受体,采用花萼管注射法和柱头浸滴法将供体DNA导入受体。D1代变异率33．3％～63．4％,变异的性状包括单株果数、果形、果大小、内种皮颜色、株型、叶形、熟性、育性及产量性状。D2的大部分变异株能稳定遗传,不再分离,稳定株行占D2株行的75％～96％。试验表明,国槐DNA导入花生栽培品种,可以引起后代的变异,变异范围广,稳定快,是花生品种改良和创造新种质的有效方法途径。     

未成熟种子子叶节转化体系优化及转EPSPS/GAT基因大豆新材料创制

以丛生芽率为指标,将农杆菌介导的大豆未成熟种子子叶节转化与成熟种子转化体系进行比较,明确了诱导过程中草甘膦筛选浓度、未成熟种子生理状态,改进大豆外植体的获得方式并减少了组培环节,建立了未成熟种子子叶节转化体系。利用Jack黄熟后期的种子作为受体材料,在15 mg·L-1的草甘膦筛选浓度下获得了9株PCR检测阳性植株并且生长正常可育,T0代经测序及Southern Blot分析,进一步证明外源基因已整合进大豆基因组中,其中2个株系的T1代植株经PCR检测符合3∶1的分离比,且表型鉴定筛选出抗性转基因植株,为抗草甘膦转基因大豆育种提供了新材料。     

子房注射法将Bt基因导入超甜玉米

用子房注射法将Bt基因导入超甜玉米品种粤甜3号,获得了1株整合有Bt基因的转基因植株,定名为ZT11,以发芽成苗的植株计算,基因转化效率达9.09%。经PCR和Southernblot分析,证明抗虫基因已经整合在超甜玉米基因组中,并且为单拷贝。T1代植株PCR检测结果表明,Bt基因能够在转基因后代中稳定遗传,基因分离符合1∶1的孟德尔遗传分离规律。     

高赖氨酸蛋白基因导入小麦的研究

为了培育高赖氨酸含量的小麦新材料,利用基因枪转化法将辣椒高赖氨酸蛋白Cflr基因导入到小麦品种扬麦16中,轰击了2 500枚小麦幼胚,获得抗除草剂Basta的再生植株176株(遗传转化采用的筛选标记基因为bar基因),经PCR鉴定Cflr基因阳性的转基因植株为23株.T1代幼苗喷洒130 mg·L-1的Basra溶液进行除草剂抗性鉴定,发现T1代幼苗的除草剂抗性出现了分离.PCR-Southern杂交进一步证明外源高赖氨酸蛋白基因Cflr基因已经整合到小麦的基因组中.通过种子赖氨酸含量和总蛋白质含量的测定,发现75.00％的转基因株系的赖氨酸含量高于受体扬麦16,77.78％的转基因株系的蛋白质含量高于受体扬麦16.本试验获得了一批赖氨酸含量提高的小麦转基因株系,这些高赖氨酸含量的转基因株系可进一步用于小麦高赖氨酸分子育种研究.     

农杆菌介导的大豆植株整体转化

农杆菌介导的植物整体转化法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导人的受体,通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触,以完成可遗传细胞的转化,通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代.以大豆幼苗的顶端生长点和叶腋生长点为靶点,通过农杆菌介导的整体转化法--注射法进行转录因子DREB1C基因的遗传转化,最终获得6株T0代PCR阳性转基因植株,转化率为9.2%.T1代植株的PCR、Southern blot和RT-PCR鉴定结果表明获得1株阳性植侏,DREB1C基因以单拷贝形式整合于大豆基因组中,在200 mmol·L-1NaCl胁迫条件下在转录水平得到成功表达.该方法克服了大豆组织培养再生难、转化率低的缺点,是一种高频、简单、快捷的非组培遗传转化途径.     

外源DNA浓度对玉米开苞导入后代性状变异的影响

外源DNA浓度是影响玉米开苞导入技术转化效率的主要因素之一。采用玉米开苞导入技术将玉米自交系13A的总DNA以不同浓度分别导入受体玉米自交系沈109和系599中,得到了广泛的变异。结果表明,供体DNA的浓度对导入后代的结实率和转化率都有影响,供体DNA的浓度在500～800 μg/mL为宜。     

BADH基因转化水稻的方法比较

应用基因枪法与农杆菌介导法将来源于山菠菜的BADH（betaine aldehyde dehydrogenase）基因导入水稻。从获得转基因植株数量、转化率、转化植株PCR阳性率、外源基因拷贝数及其表达活性、T0代植株的结实率对两种转化方法进行了比较。结果表明,用农杆菌介导法转化BADH基因的转化效率和PCR阳性率比基因枪法更高,且用农杆菌介导法得到的转基因植株T0的结实率等农艺性状也优于基因枪法。     

根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化研究

为了建立农杆菌介导的大麦茎尖遗传转化技术,以我国大麦主推品种鄂大麦9号、鄂大麦32122为材料,以农杆菌介导法转化大麦茎尖,经PPT筛选获得了转抗除草剂基因的大麦株系。PCR鉴定表明,以鄂大麦9号茎尖为受体,筛选获得4个转基因植株,阳性率为0.59%;以鄂大麦32122茎尖为受体,筛选获得10个阳性植株,阳性率为1.96%。转基因T1代Southern杂交分析证实,外源基因确已整合到大麦基因组中,已鉴定的转基因株系均含单个转基因拷贝,不同转基因株系整合的位点不同。因此大麦茎尖可作为农杆菌转化的受体。本研究结果为拓宽大麦遗传转化受体提供了技术和方法。     

利用玉米萌动胚转化体系获得抗除草剂转基因新材料

以玉米杂交种郑单958为受体材料, 建立农杆菌介导的玉米萌动胚转化体系, 并获得抗除草剂转基因玉米材料。经过对农杆菌菌液浓度、共培养时间、乙酰丁香酮的浓度的优化, 农杆菌介导的玉米萌动胚转化法的最优参数为菌液浓度OD₆₀₀值为0.8, 共培养时间为48 h, 乙酰丁香酮的浓度为100 μmol/L。获得69株PCR阳性植株, 其中54株为bar基因金标免疫试纸条检测阳性植株, 29株获得种子;T1代植株具有草丁膦抗性, 并显示出胶体金免疫酶联反应阳性, 表明目的基因已整合玉米基因组内并有效表达, 而且能够稳定遗传给后代。     

Cry1Ab基因转化甘蔗及转基因抗虫植株的获得

构建玉米UBI启动子驱动Bt Cry1Ab基因的高效植物表达载体pUBTB，通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织，经过除草剂PPT三次连续筛选，共获得67株抗性植株，经PCR扩增检测，得到22株阳性植株，并对其进行RT-PCR检测，证明外源基因已经成功整合到其中的15株甘蔗基因组中，且得到了有效的表达。