抗、感稻瘟病品种的过氧化物酶同功酶分析

用一些对稻瘟病表现抗病和感病的不同品种和近等基因系,进行了过氧化物酶同工酶电泳分析。共检测到12～13条过氧化物酶酶带,在接种和不接种稻瘟病菌的情况下,水稻过氧化物同工酶谱无明显差异,但可发现抗病品种（系）要比感病品种（系）多一条或两条弱的酶带,且个别酶带的活性也较高。表明过氧化物酶与抗病性有关,可以作为鉴定品种抗瘟性的一种生化指标。     

转PAL基因水稻抗稻瘟病性和过氧化物酶活性的研究

 用PAL(苯丙氨酸解氨酶）基因正义和反义转化水稻，获得了70株转基因植株。选择正义转化植株(1s)和反义转化植株(4a)进行稻瘟病菌([i]Magnaporthe grisea[/i])接种，针对病原物侵染，1s的PAL活性上升更快，幅度更大。观察水稻叶片超微结构发现，1s的细胞具有更强的抵抗病原菌入侵的能力，其过氧化物酶活性也比对照和4a要高。     

转Pi9抗稻瘟病基因水稻株系的比较转录组分析

【目的】在转录水平上解析Pi9基因介导的稻瘟病抗性调控机理,为培育抗病水稻品种提供理论依据。【方法】向水稻品种日本晴(NPB)及其转Pi9抗稻瘟病基因株系(NPB/Pi9)接种稻瘟菌。分别于接种后0 h、12 h、24 h、36 h提取叶组织样品,选取12503个水稻基因定制基因芯片,进行水稻基因转录组分析,并通过qRT-PCR对部分差异表达基因进行验证。【结果】NPB/Pi9在接种后12 h、24 h和36 h的基因表达量分别与其接种0 h表达量比较,共检测到7754个差异表达基因;相应地,感病水稻NPB在以上时间点共检测到7385个差异表达基因;在接种后36 h,NPB/Pi9的差异表达基因数目显著多于NPB。比较NPB/Pi9和NPB相同时间点的基因表达量,共获得4065个差异表达基因,其中接种后36 h的差异表达基因显著多于接种后0 h、12 h或24 h。因此,NPB/Pi9的稻瘟病防御反应更强烈。对NPB/Pi9与NPB相同时间点的差异表达基因进行GO和KEGG分析,细胞外区域、植物对刺激应答、转录调控、氧化还原、离子结合、次生代谢和植物激素相关的GO分类在接种后呈显著富集,苯丙氨酸代谢、类黄酮生物合成和植物激素信号途径的KEGG通路在接种后显著富集。与效应分子触发的免疫反应(ETI)相关的水杨酸信号途径、几丁质酶,以及与病原相关分子模式触发的免疫反应(PTI)相关的胞外区域、对刺激的应答、木质素合成等,均在抗感水稻之间差异表达。而且PTI/ETI共有的WRKY转录因子、MAPK激酶、茉莉酸和乙烯信号途径等发生差异表达。综上所述,NPB/Pi9和NPB的差异表达模式与ETI和PTI相关,两者相互联系并在Pi9介导的稻瘟病抗性中发挥作用。【结论】与日本晴比较,抗病基因型NPB/Pi9对稻瘟病防御反应更强烈。转录因子、激酶、NBS-LRR基因、几丁质酶、水杨酸、茉莉酸和乙烯信号途径,以及植物次生代谢在Pi9介导的稻瘟病抗病反应中发挥重要作用。     

水稻抗稻瘟病分子机制研究进展

稻瘟病是危害世界水稻生产最严重的真菌病害之一。稻瘟病菌生理小种变异快，水稻品种的抗性一般仅能维持3~5年。培育和种植抗性品种是目前最经济有效的措施。近年来，对稻瘟病菌致病机制和抗性基因分子机理的系统研究，加深了对该病原菌-宿主系统中病原相关分子模式诱导的免疫反应机制和病原菌效应蛋白诱导的免疫反应机制的了解。本文综述了水稻抗稻瘟病的两种天然免疫机制研究的最新进展，并对目前水稻抗稻瘟病分子机制研究中急需解决的问题和挑战进行探讨和展望。     

受稻瘟病菌诱导的水稻OsBTB基因的分子特征和功能初探

报道了1个从稻瘟病菌诱导的水稻近等基因系H7R/H7S中克隆的类GMPOZ基因--OsBTB,通过测序获其全长cDNA并分析了该基因的序列特征。根据水稻基因组序列数据库搜索,将OsBTB基因定位在水稻基因组第2染色体上。Northern和Western杂交结果表明,OsBTB基因在水稻近等基因系H7R/H7S中均受稻瘟病菌诱导表达,且在非亲和与亲和互作中表达差异明显。定量PCR结果表明该基因的表达模式与所选取的抗性及抗性相关基因的表达模式一致。综合结果提示该基因可能参与了稻瘟病菌诱导的抗性反应。     

浙江省主栽水稻品种抗稻瘟病基因的分子检测

稻瘟病是水稻的三大重要病害之一。利用稻瘟病抗病基因进行新品种培育是控制稻瘟病发生最经济有效的措施,对水稻安全生产具有重要意义。本研究在鉴定63个浙江省主栽水稻品种的叶瘟和穗颈瘟抗性水平的基础上,利用Pi1、Pi5、Pi2、Pi9、Pia、Pizt、Pigm、Pib、Pik和Pikh等10个已克隆抗稻瘟病基因的特异分子标记,对这63个品种的抗稻瘟病基因组成进行了鉴定,并进一步分析了抗病基因与稻瘟病抗性之间相关性。抗性鉴定结果显示,63个浙江省主栽水稻品种中,抗叶瘟品种占66.7%、抗穗瘟品种占50.8%。抗稻瘟病基因分析显示,有60个主栽品种聚合了多个抗病基因,含有Pizt和Pib基因的品种45个、含有Pi2和Pi5基因的品种43个,此外,抗病基因Pia、Pik、Pi1、Pi2、Pizt、Pikh、Pi5及Pib在浙江省主栽品种中分布频率整体较高,而Pigm和Pi9分布频率很低,仅3.2%。本研究揭示了浙江省主栽水稻品种抗稻瘟病基因的组成及抗稻瘟病基因对稻瘟病抗性提高的贡献,为浙江省抗病新品种的培育提供参考。     

转几丁质酶-葡聚糖酶基因水稻稻瘟病抗谱分析

用来源于云南各地属于24个稻瘟病菌（[i]Magnaporthe grisea[/i]）生理小种的33个菌株,对受体品种南29及其4个转几丁质酶 β-1,3-葡聚糖酶串联基因水稻T5代品系进行了温室接种鉴定。结果表明,不能侵染受体品种南29 的13个菌株也不能侵染转基因品系,可侵染受体品种南29 的20个菌株一般不能侵染转基因品系,转基因水稻对稻瘟病菌抗性范围较受体对照扩大,证明转几丁质酶 葡聚糖酶基因水稻对稻瘟病具有一定的广谱抗性;诱发条件下,转基因品系大田叶瘟病情指数为0～1级,穗瘟发病率为0.3%～10.23%,抗性较受体对照大幅度提高,表明这些品系在稻瘟病抗病育种中是有应用潜力的。     

水稻稻瘟病抗性基因及稻瘟病菌无毒基因研究进展

稻瘟病是水稻生产上最为重要的病害之一,可引起大幅度减产.水稻—稻瘟病菌互作机制是目前研究植物与病原物互作的模式系统.关于稻瘟病抗性基因、稻瘟病菌无毒基因的研究取得显著进展,为水稻抗稻瘟病分子标记辅助育种、基因工程育种及稻瘟病绿色防治提供了广阔的前景.对稻瘟病菌侵染机制、稻瘟病抗性基因定位与克隆、抗病基因和无毒基因的互作...     

水稻抗稻瘟病分子机制研究进展

稻瘟病是危害世界水稻生产最严重的真菌病害之一。稻瘟病菌生理小种变异快,水稻品种的抗性一般仅能维持3~5年。培育和种植抗性品种是目前最经济有效的措施。近年来,对稻瘟病菌致病机制和抗性基因分子机理的系统研究,加深了对该病原菌-宿主系统中病原相关分子模式诱导的免疫反应机制和病原菌效应蛋白诱导的免疫反应机制的了解。本文综述了水稻抗稻瘟病的两种天然免疫机制研究的最新进展,并对目前水稻抗稻瘟病分子机制研究中急需解决的问题和挑战进行探讨和展望。     

转小萝卜γ-硫堇蛋白基因RsAFP1水稻的获得及其稻瘟病抗性初步鉴定

将从小萝卜中分离的硫堇蛋白类基因RsAFP1通过基因工程的方法导入带有泛素Ubiquitin启动子及抗除草剂Bar基因的植物双元表达载体pCAMBIA1300中,经农杆菌介导对圣稻13进行遗传转化。对获得的阳性转基因植株进行稻瘟病菌体外及室内苗期稻瘟病菌接种抗性鉴定,结合田间自然发病情况,对转基因植株的抗稻瘟病性进行综合评价。初步结果表明,外源RsAFP1基因的导入可在一定程度上提高水稻对稻瘟病的抗性。     

生长素调控因子OsGRF4协同调控水稻粒形和稻瘟病抗性

【目的】水稻粒形为多基因控制的复杂数量性状,同时影响稻谷产量和稻米外观及碾磨品质,挖掘粒形相关基因并解析其遗传机制,对于水稻高产和优质品种选育具有重要意义。【方法】以前期利用大粒籼稻品种特大籼(TDX)为供体亲本、小粒粳稻品种日本晴(Nipponbare,NPB)为轮回亲本获得的一个大粒近等基因系,在水稻第2染色体上初定位粒形调控基因GS2.2(grain size 2.2)的基础上,对GS2.2基因进行了精细定位和候选功能基因的克隆鉴定。【结果】利用BC₄F₂群体中2887份极小粒单株及该群体中70份基因型杂合的大粒单株自交获得的BC₄F₃群体,将GS2.2基因精细定位在2M-7-1与2M-9之间的160.6 kb的区间内。该区间编码18个基因开放阅读框(ORF1-18)。测序发现ORF18基因在大粒近等基因系与小粒日本晴等位基因间存在5个SNP差异,ORF18编码生长素调控因子蛋白OsGRF4。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对大粒近等基因系中ORF18进行敲除,发现ORF18敲除株系粒长变短,证实ORF18是GS2.2的功能基因。进一步对ORF18大粒近等基因系和基因编辑敲除株系进行稻瘟菌室内离体和病圃接种鉴定,发现ORF18大粒近等基因系稻瘟病抗性增强,而基因编辑敲除株系稻瘟病抗性减弱,表明ORF18正调控水稻稻瘟病抗性。【结论】本研究发现的生长素调控因子OsGRF4协同调控水稻粒形和稻瘟病抗性,为协调水稻高产和抗性育种提供了重要的基因资源。     

Rice Blast Resistance of Transgenic Rice Plants with Pi-d2 Gene

Resistance to rice blast of transgenic rice lines harboring rice blast resistance gene Pi-d2 transformed from three different expression vectors of pCB6.3kb, pCB5.3kb and pZH01-2.72kb were analyzed. Nine advanced-generation transgenic rice lines with Pi-d2 gene displayed various resistance to 39 rice blast strains, and the highest disease-resistant frequency reached 91.7%. Four early-generation homozygous transgenic lines with Pi-d2 gene exhibited resistance to more than 81.5% of 58 rice blast strains, showing the characteristic of wide-spectrum resistance. The transgenic embryonic calli selected by the crude toxin of rice blast fungus showed that the callus induction rate of immature embryo from transgenic rice plants decreased as the concentration of crude toxin in the culture medium increased. When the concentration of crude toxin reached 40%, the callus induction rate of immature embryo from transgenic lines was 49.3%, and that of the receptor control was 5%. The disease incidence of neck blast of the transgenic rice lines in fields under induction was 0% to 50%, indicating that the rice blast resistance of transgenic rice lines is much higher than that of the receptor control.     

A set of near-isogenic lines for blast resistance genes with an Indica-type rainfed lowland elite rice (Oryza sativa L.) genetic background

A set of near-isogenic lines for blast resistance genes was developed by using an Indica-type elite rice variety, IR49830-7-1-2-2, suitable for the rainfed lowland conditions in the tropics, as a genetic background. Initially, we revealed that IR49830-7-1-2-2 harbors five blast resistance genes - Pia, Pib, Pik-s, Pita, and Pi11(t) - by using a differential system involving 19 selected standard blast isolates from the Philippines. Based on this result, we developed nine near-isogenic lines (NILs) targeting eight resistance genes - Pik, Pi7(t), Pi3, Pi5, Pita-2, Piz-5, Pish, and Pi9 - by recurrent backcrossing. The introgression of each resistance gene in the NILs was confirmed by reaction patterns to the blast isolates, allelism tests, and DNA marker analysis. In addition, a genome-wide DNA marker survey revealed that most of the chromosome regions in each NIL were of the IR49830-7-1-2-2 type. The agricultural characteristics of most of the developed NILs were almost the same as those of IR49830-7-1-2-2. Moreover, with one exception, they showed submergence tolerance similar to IR49830-7-1-2-2. The developed NILs could be used as a multiline variety suitable for the rainfed lowland in the tropics.     

Osa-mi R439 Negatively Regulates Rice Immunity Against Magnaporthe oryzae

Osa-miR439 is a rice-specific microRNA family. Here we showed that Osa-miR439 acted as anegative regulator in rice immunity against blast fungus Magnaporthe oryzae. Osa-miR439 differentiallyresponded to M. oryzae between susceptible and resistant rice accessions. The accumulation ofOsa-miR439 was constitutively more in the susceptible accession than in the resistant one. Transgeniclines overexpressing Osa-miR439a (OX439a) showed higher susceptibility associating with lower inductionof defense-related genes and less hydrogen peroxide (H2O2) accumulation at the infection sites than thecontrol plants. In contrast, transgenic lines expressing a target mimic of Osa-miR439 (MIM439) displayedcompromised susceptibility associating with increased H2O2 accumulation. Furthermore, we found thatthe expression of three predicted target genes was decreased in OX439a but increased in MIM439 incomparison to control plants, and this expression was differential in susceptible and resistant accessionsupon M. oryzae infection, indicating that Osa-miR439a may regulate rice blast resistance via these genes.Our results unveiled the role of Osa-miR439a in rice blast resistance and provided the potentiality toimprove the blast resistance via miRNA.     

多年生稻稻瘟病抗性评价

利用长雄野生稻(Oryzalongistaminata)地下茎无性繁殖特性培育多年生稻(Perennial Rice,PR)已经成功并开始示范推广.多年生稻表现出一定的稻瘟病抗性,但其所具有的稻瘟病抗性来源尚不清楚.本研究通过田间病情调查、接种鉴定以及抗性基因检测等3种方法,对育成的多年生稻23(PR23)、云大24(...     

利用CRISPR/Cas9技术创制抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系

【目的】创制新型抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系，为高产优质杂交水稻选育提供资源。【方法】利用CRISPP/Cas9技术在水稻稻瘟病基因Pi21、温敏不育基因TMS5和香味基因Badh2的第1外显子处设计靶位点，构建多基因表达载体pC1300-2×35S::g^TMS5-g^Badh2-g^Pi21，转化优质常规籼稻品种中早70，测序鉴定分析获得纯合阳性稳定株系。利用稻瘟病喷雾接种和打孔接种方法对稻瘟病基因Pi21的纯合突变株系进行稻瘟病抗性鉴定，利用GC-MS技术对Badh2纯合突变株系的香味物质2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量进行测定。【结果】在T₀转基因株系中，Pi21、TMS5和Badh2突变频率分别为87.5%、80.0%和87.5%，突变类型多为双等位突变。从T₁代中筛选不含载体骨架的纯合突变株系，获得两种三突变纯合株系。稻瘟病接种结果表明，与野生型相比，T₂代Pi21纯合变异株系的抗性显著提高。同时，接种后纯合突变体株系内相关防卫基因的表达量显著上调，ROS积累量也显著增加。tms5纯合变异株系表现出典型的温敏不育特性，TMS5基因的表达水平与野生型相比显著降低，高温下Ub_L404基因的表达水平明显高于野生型。与野生型相比，在Badh2纯合突变体植株中Badh2的表达水平显著下调，并且香味物质2-AP含量极显著增加。【结论】利用CRISPR/Cas9技术成功对Pi21、TMS5和Badh2基因同时进行定向编辑，获得了具有高抗稻瘟病的香型温敏不育系，为高抗、香型不育系材料的选育提供参考，加快高产优质杂交水稻的选育。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性

【目的】CRISPR/Cas9基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑，以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以Pita、Pi21和ERF922为靶基因，构建共编辑载体pC1300-2×35S::Cas9-gPita-gPi21-gERF922 ，用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014，筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。【结果】在T0代转基因株系中，Pita、Pi21和ERF922突变频率分别为75%、85%和65%，突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含T-DNA成分的T1代能够稳定遗传给T2代，并从中获得Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明，与野生型相比，突变株系的抗性显著提高。同时，接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此，我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。【结论】利用CRISPR/Cas9技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系，为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性

[目的]CRISPR/Cas9 基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑,以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。[方法]利用 CRISPR/Cas9基因编辑技术,以 Pita、Pi21 和 ERF922 为靶基因,构建共编辑载体 pC1300-2×35S::Cas9-g^Pita-g^Pi21-g^ERF922 ,用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014,筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。[结果]在T0代转基因株系中,Pita、Pi21和ERF922 突变频率分别为 75%、85%和 65%,突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含 T-DNA成分的T1代能够稳定遗传给T2代,并从中获得 Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明,与野生型相比,突变株系的抗性显著提高。同时,接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此,我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。[结论]利用 CRISPR/Cas9 技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系,为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。     

Genetic Transformation of Rice with Pi-d2 Gene Enhances Resistance to Rice Blast Fungus Magnaporthe oryzae

The gene Pi-d2, conferring gene-for-gene resistance to the Chinese blast strain ZB15, was isolated from a rice variety (Digu) by the map-based cloning strategy. Here, we constructed a control plasmid pZH01-pi-d2tp309 (pZH01-tp309) and three different expression constructs, pCB-Pi-d25.3kb (pCB5.3kb), pCB-Pi-d26.3kb (pCB6.3kb) and pZH01-Pi-d22.72kb (pZH01-2.72kb) of Pi-d2, driven by Pi-d2 gene's own promoter or CaMV35S promoter. These constructs were separately introduced into japonica rice varieties Lijiangxintuanhegu, Taipei 309, Nipponbare and Zhonghua 9 through Agrobacterium- mediated transformation. A total of 150 transgenic rice plants were obtained from the regenerated calli selected on hygromycin. PCR, RT-PCR and Southern-blotting assay showed that the gene of interest had been integrated into rice genome and stably inherited. Thirty-five transgenic lines independently derived from T1 progeny were inoculated with the rice blast strain ZB15. Transformants exhibited resistance to rice blast at various levels. The lesions on the transgenic plant leaves were less severe than those on the controls and the resistance level of transgenic plants harboring the gene of interest from three vectors had no difference. The own promoter of Pi-d2, about 2.2 kb or 3.2 kb, had the similar promoter function as CaMV35S. Field evaluation for three successive years supported the results of artificial trial, and some lines with high resistance to rice leaf blast and neck blast were obtained.