柞蚕滞育蛹与非滞育蛹蛋白质表达差异初步分析

柞蚕是以蛹滞育越冬的昆虫之一,研究滞育蛹及非滞育蛹的蛋白质种类及含量的变化规律,有利于其滞育机理的解明。通过SDS-PAGE获得滞育与非滞育雄性柞蚕蛹的蛋白质图谱在分子质量16～105 kD范围内均出现清晰的25条带,其中大小为79、54、48、29 kD的蛋白质表达量较高,79 kD的蛋白质为高丰度表达的大分子质量蛋白质;采用2D-PAGE技术分析,在滞育蛹蛋白质样品中检测到的总蛋白质斑点数为400个,非滞育蛹蛋白质样品中检测到的总蛋白质斑点数为619个,非滞育蛹蛋白质斑点明显增多,二者蛋白点匹配率仅为37%,蛋白质的等电点变化剧烈,差异性较大,匹配率较低。研究结果提示柞蚕蛹滞育过程中蛋白质的数量和种类发生了明显变化。     

不同催青处理的二化性家蚕体内过氧化氢代谢

研究了25℃明催青和15℃暗催青对二化性家蚕品种丰一体内的H2O2代谢影响。在催青期,前一种处理的蚕卵体内H2O2代谢水平在中后期呈U型变化,过氧化氢酶(CAT)活性在后期迅速上升;后一种处理的蚕卵体内H2O2代谢水平在第16天出现峰值,CAT活性在后期缓慢上升。在幼虫期,两种催青处理的H2O2代谢基本相似,均是H2O2代谢水平随龄期增加而逐步下降,CAT活性在1~4龄逐步下降,而在5龄期有所回升。在蛹期,前一种处理的H2O2代谢水平分别在第2天和第9天出现峰值,CAT活性分别在第3天和第6天出现峰值;后一种处理的H2O2代谢水平在第4天出现峰值,CAT活性在第5天出现峰值。上述结果表明,不同催青条件显著改变了家蚕催青期和蛹期的H2O2代谢,滞育诱导阶段的家蚕H2O2代谢可能与滞育激素(DH)的表达密切相关。     

水牛高低活力精子的差异蛋白质鉴定和分析

本研究开展了水牛的高低活力精子差异蛋白质组分析,利用Percoll法分离水牛高、低活力精子后分别提取总蛋白质,通过双向电泳技术获得了高活力精子和低活力精子的双向电泳图谱,图像分析表明,高、低活力精子中存在差异蛋白质18个,以高活力精子为对照组,其中6个蛋白质在低活力精子中表达量下调或缺失,12个蛋白质表达量上调。使用串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)对差异蛋白质进行鉴定,成功鉴定了3种蛋白质:精子尾部结构蛋白2、α-ATP合成酶、α-琥珀酰辅酶A合成酶。这些蛋白质与精子结构形成和线粒体能量代谢有关。该研究发现了水牛高、低活力精子的蛋白质变化,为解释精子活力低下的分子机制提供的新的线索。     

水牛卵泡液差异蛋白质双向电泳方法的建立及质谱分析

旨在研究沼泽型水牛成熟前后卵泡内差异表达蛋白质的变化规律。采用双向凝胶电泳技术分离成熟卵泡液和未成熟卵泡液总蛋白质,建立和优化了卵泡液的双向电泳体系,并使用质谱鉴定差异表达蛋白点。结果显示,丙酮沉淀法处理得到的总蛋白质样品后,在24cm(pH 4～7)胶条且上样量350μg时得到分辨率较好的双向电泳图谱。软件分析得到11个差异蛋白点,以成熟卵泡液作为对照,5个蛋白点表达上调,3个蛋白点表达下调,1个蛋白点缺失,2个蛋白点在未成熟卵泡液中特异性表达。质谱成功鉴定出4个蛋白质:过氧化物酶-2、醛糖还原酶、牛纤维蛋白原的晶体结构、转甲状腺素蛋白。该研究建立了良好的卵泡液双向电泳体系,分析并鉴定一批水牛卵泡液差异蛋白质,对于研究水牛卵母细胞的发育微环境和成熟机制提供了新的研究线索。     

家蚕二化性品种(品系)转基因用蚕卵的预处理技术研究

家蚕为卵滞育昆虫,二化性家蚕品种(品系)的化性由上代卵期温度与光照等调控。将若干个二化性家蚕品种(品系)以17~18℃温度催青诱导子代蚕卵非滞育,筛选出1个经济性状较优的实用品种"秋丰"、1个突变品系P33,二者非滞育卵圈比例分别达到96.4%和89.6%,正常催青的良卵实用孵化率分别达到96.11%和98.58%,解决了采用显微注射法以家蚕实用品种构建转基因系统过程中因蚕卵滞育不能及时孵化的难题。另对利用20%盐酸-2%甲醛混合液刺激解除蚕卵滞育的方法以及非滞育蚕卵表面用70%乙醇消毒的方法进行了尝试,前者可以获得96%以上的孵化率,后者可以缩短蚕卵预处理时间。     

家蚕卵长期保存中碳水化合物和蛋白质的代谢变化

应用气相色谱法、酚—硫酸法以及聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层扫描等方法,测定了现行品种(苏5×苏6)蚕卵滞育各阶段山梨醇、糖元和主要卵黄蛋白质的代谢变化,并探讨了环境温度与蚕卵长期保存的关系。结果表明:(1)家蚕卵滞育各阶段山梨醇、糖元的含量和卵黄蛋白质的某些电泳区带发生了规律性的变化。(2)山梨醇含量的变化,可作为生化指标监测和判断蚕卵的滞育阶段。(3)0℃区的环境温度调节,是一种能及时和2充分适应蚕卵滞育各阶段生理要求的、比较理想的长期保存蚕卵的方法。     

盐酸处理蚕卵核酸和蛋白质代谢的变化

盐酸处理家蚕滞育性蚕卵后，蚕卵ＲＮＡ和ＤＮＡ的含量在处理后１０小时内未测出变化；以摄入ＲＮＡ的３Ｈ—尿嘧啶量表示的蚕卵ＲＮＡ合成能力在处理后２４小时有微弱上升。处理后４０小时内，蚕卵可溶性蛋白质的含量一直稳定于９２—９８ｍｇ／ｇ·卵；处理蚕卵的蛋白质ＳＤＳ—ＰＡＧＥ图谱与对照未浸酸蚕卵相同，处理卵有一条区带的蛋白质含量比未浸酸卵显著减少，盐酸处理后５小时内，蚕卵酯酶Ａ及酯酶Ａ４的活性有显著地提高，而未浸酸蚕卵仍处低活性状态。说明盐酸处理在激活蚕卵的遗传情报系统大量合成新物质之前，已对蚕卵内存在的某些活性物质产生了影响。     

家蚕滞育卵浸酸后易溶性蛋白的表达差异分析

探明浸酸解除家蚕卵滞育的关联蛋白,可为改进和提高蚕种的人工孵化技术提供理论依据。以经2.5℃冷藏45 d的家蚕品种"7.湘×9.芙"滞育卵为材料,采用双向凝胶电泳和图像分析技术,比较浸酸与未浸酸蚕卵易溶性蛋白的差异变化。在未浸酸蚕卵的双向电泳图谱中共检测到523个蛋白质斑点,其中特异性蛋白质斑点41个;浸酸卵共检测到526个蛋白质斑点,其中特异性蛋白质斑点44个。浸酸与未浸酸蚕卵能相互匹配的蛋白质斑点有482对,匹配率91.897%。经对比分析,浸酸活化后的蚕卵蛋白出现了一些特异性的蛋白质斑点,或某些蛋白质斑点在含量上出现了差异变化。     

一个二化性家蚕醛酮还原酶基因的克隆及序列与表达分析

醛酮还原酶(aldo-keto reductase,AKR)超级家族成员以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作为其辅酶,将醛酮类化合物还原成相应的醇类,其作用底物范围广泛,包括糖类、脂肪醛和甾体类激素等,在许多重要生物学反应中发挥关键作用。以二化性家蚕品系秋丰为材料,利用RT-PCR分别从滞育命运组和非滞育命运组克隆出AKR蛋白的cDNA序列。AKR蛋白序列由343个氨基酸组成,与黑腹果蝇和人的AKR分别有43%和38%的序列一致性。基于蛋白质序列构建的系统发育树显示,家蚕AKR蛋白属于AKR2E亚家族,其氨基酸序列与该家族成员序列一致性超过30%,故命名为AKR2E-like。将akr2e-like基因的cDNA序列克隆进表达载体pET-28a(+)中进行原核重组表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析显示重组蛋白被成功表达。qRT-PCR分析表明,ark2e-like基因表达受发育环境调节:在滞育诱导条件下,该基因在家蚕化蛹早期的表达量持续增加,在化蛹后第4天mRNA丰度达到最高值;而在非滞育诱导条件下,化蛹后ark2e-like基因表达量并无明显波动。上述结果表明,ark2e-like基因有可能在家蚕二化性品系的滞育准备期起关键作用。     

牦牛卵泡液差异蛋白质组双向电泳图谱的构建与质谱分析

从蛋白质水平了解牦牛季节性繁殖规律,利用双向电泳与质谱鉴定技术分析牦牛卵泡液与血浆蛋白质组分变化。以青海高原牦牛卵泡液与血浆为研究对象,采用双向电泳技术构建牦牛卵泡液与血浆蛋白质双向电泳图谱,银染后利用Image Master 2D Platinum软件分析并采用MALDI-TOF-MS进行质谱鉴定。用试剂盒ProteoExtract Albumin/IgG Removal Kit去除高丰度蛋白质后,利用2-DE技术获得了分辨率较高的卵泡液与血浆蛋白质电泳图谱,卵泡液与血浆蛋白质图谱对比分析共发现了24个差异表达蛋白质点,其中2个蛋白质点表达上调,22个蛋白质点表达下调。经质谱分析,最终成功鉴定出8个蛋白质点、5个未知蛋白质点。本研究成功构建了蛋白质图谱及分离鉴定的差异蛋白质,为从蛋白质水平揭示牦牛卵泡发育规律及了解卵母细胞发育的微环境提供了试验依据。     

二化性家蚕滞育过程中谷胱甘肽S-转移酶活性的变化

二化性家蚕卵以25℃和15℃催青,可分别诱导成虫产下子代滞育和非滞育卵,而即时浸酸和5℃左右的低温处理可以分别阻止和解除胚胎滞育。利用1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)显色法测定了经上述处理后的胚胎滞育过程中谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)的活性,结果表明:胚胎发育后期的蚕卵经25℃催青,卵中的GST活性显著高于15℃催青蚕卵;蚕卵即时浸酸未显著改变胚胎滞育发动阶段蚕卵中的GST活性;5℃低温处理显著提高了滞育卵中的GST活性,但是未能显著改变即时浸酸卵的GST活性。上述结果表明,蚕卵中的GST活性变化与二化性家蚕胚胎滞育诱导和解除密切相关。     

家蚕幼虫正常个体与眠性变化个体大眠蜕皮前后血液蛋白质差异表达分析

家蚕眠性既受染色体上主基因的控制,又受其它伴性成熟基因的调控,还受环境因素的影响。为了探讨环境因素改变家蚕眠性的分子机制,以四眠蚕品种898黄绿、D92黄绿和三眠蚕品种三眠A为材料,通过催青期或小蚕期温度、湿度、营养等因素的调控诱导眠性变化,利用双向电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)技术,对这些家蚕正常个体和眠性变化个体大眠蜕皮前后的血液蛋白质表达差异进行分析鉴定。结果共获得转铁蛋白、胰凝乳蛋白酶抑制剂SCI-I、多聚腺苷酸结合蛋白2、27 kD糖蛋白前体、核糖体蛋白L20和线粒体核糖体蛋白L2等13个上调或下调的可能与家蚕眠性相关的差异表达蛋白,为进一步从蛋白质水平深入了解家蚕眠性变化的机制奠定了基础。     

家蚕雌性附腺分泌蛋白的双向电泳分离及质谱鉴定

采用24 cm的双向电泳可以分离出家蚕雌性附腺分泌的70多种蛋白或多肽,其中有30多个蛋白或多肽的表达量较大。从这些蛋白斑点在凝胶中的分布位置上看,大多数分布在等电点pI 4~7的范围内,主要蛋白的分子量较大。对其中表达量相对较高的33个蛋白点进行胶内酶解后质谱分析,并根据检索到的蛋白质的功能进行分类,最多的是核糖体蛋白家族,占蛋白质总量的30.4%,另外还有2个热休克蛋白。除此之外,还有一些如RNA结合蛋白、转录延长因子等功能性蛋白质。这些蛋白质共同组成了具有特殊物理性质的分泌物。     

家蚕黄血近等基因系差异蛋白组学分析

为了获取与家蚕黄血基因(Y)协同作用的相关蛋白的基础信息,通过双向电泳技术对家蚕黄血近等基因系5龄起蚕黄血个体和白血个体的中肠蛋白进行分离并作图像分析,发现分离出的较为清晰的蛋白点主要集中在14～80kD区域,等电点(pI)4～9。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对其中一些差异明显的蛋白点进行鉴定,鉴定结果较为可信的5个蛋白点包括参与能量代谢、蛋白质合成等功能蛋白,这些蛋白可能与家蚕黄血性状的形成有关。采用实时定量PCR方法,对质谱鉴定出的质子转移ATP合酶β亚基2编码基因在家蚕黄血近等基因系黄血个体和白血个体5龄不同发育时期的相对表达量进行分析,结果表明该基因在2种个体中的表达均呈现明显上升的趋势,并且在黄血个体中的表达量明显较白血个体高,5龄第1-2天的相对表达量高7倍左右,提示该基因可能与家蚕的黄血性状有关联。     

家蚕滞育性卵胚胎发育过程中蜕皮激素和保幼激素含量的变化

测定发现,家蚕滞育卵胚胎发育全过程中,蜕皮激素和保幼激素含量的变化辐度较大,保幼激素含量与胚胎发育进程的关系密切,保幼激素含量又与蜕皮激素含量有关。因此认为,虽然蜕皮激素和保幼激素对胚胎滞育性没有决定作用,但蜕皮激素和保幼激素相互拮抗又相互协调,对滞育激素控制的胚胎发育进程起某种调节作用。     

二化性家蚕滞育发动期间滞育性卵和非滞育性卵的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸变化

为了探究家蚕滞育发动期间呼吸耗氧量下降与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)含量变化的关系,用高效液相色谱法和分光光度法分别检测在25℃条件下产下后12～72 h的二化性家蚕滞育性卵与非滞育性卵中的还原型NAD(NADH)含量、氧化型NAD(NAD+)含量、乳酸脱氢酶(LDH)活性和胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)活性。滞育性卵中的NADH+NAD+含量、NADH/NAD+值及LDH活性分别在产下后18、36、24 h达到峰值,而cMDH活性处于波动中。在产下后24～72 h,非滞育性卵中的NADH/NAD+值极显著低于滞育性卵,而LDH和cMDH活性极显著高于滞育性卵。据此可以推测,滞育发动期间家蚕滞育性卵的NAD+降解增强和NAD+再生下降共同导致呼吸耗氧量下降。     

家蚕雌性附腺及其分泌物的蛋白质双向电泳分析

家蚕雌性附腺由分泌部和贮存部组成,化蛾前期分泌大量胶状粘液蛋白,产卵时胶状粘液蛋白将蚕卵固定在外界物质上。对雌性附腺分泌部及胶状粘液的蛋白质进行提取,并用双向电泳进行分离和分析,结果表明用裂解缓冲液可以得到丰度较高的蛋白质混合物,利用双向电泳技术可以获得高分辨率、高重复性的蛋白质图谱。     

家蚕滞育分子机制的研究

简述了有关家蚕滞育机制的分子生物学研究进展。家蚕的胚胎滞育是由环境条件和遗传性支配的。二化性蚕品种在胚胎中期和晚期经受高温和长光照 ,其结果是下一代胚胎滞育。不同的环境信息被神经分泌细胞“解读”和“受纳”。在特定的环境条件信息下 ,神经分泌细胞产生和分泌滞育激素 (DH)。滞育激素进入卵内 ,调节和建立滞育卵专一的内部环境。其特征是 ,滞育卵中发生有关糖原和山梨醇转换的一系列酶促反应 ,从而实现进入滞育、解除滞育等生理过程。