一种检测猪伪狂犬病野毒方法的建立

猪伪狂犬病是危害养猪业的重要病毒性传染病,如何鉴别疫苗接种动物和野毒感染动物是控制和净化该病的前提。本试验根据不同猪伪狂犬疫苗株gE基因缺失的特点,建立了一种猪伪狂犬病野毒病原核酸的PCR检测方法。该方法可以检出猪伪狂犬病野毒,而不能检出猪伪狂犬病疫苗株,实现了疫苗毒和野毒的鉴别检验,同时不能检测出猪常见病毒性传染病病原。最低检测限度为10~3个病毒核酸拷贝。在组织样品检测中不受宿主组织核酸干扰,能区分野毒感染动物组织和疫苗免疫动物组织,是一种值得推广的伪狂犬病毒野毒检测方法。     

广东某规模化猪场2014—2017年伪狂犬病野毒抗体水平监测结果与分析

2014—2017年4年期间对广东某规模化猪场(存栏基础母猪1 300头)多次采集送检血清样品1 262份,其中PRV gE野毒抗体检测数量为594份,检测结果发现,2014—2017年猪伪狂犬病野毒抗体阳性率分别为6.58%、7.25%、51.26%和68.34%,呈连续上升的趋势,检测结果结合猪场几年来多种疫苗毒株交替免疫的情况下PRV野毒抗体持续上升的情况表明该猪场存在PRV新型毒株的感染或毒株毒力增强的情况,需引起足够的重视。     

2012—2015年我国部分地区规模化猪场伪狂犬病血清流行病学调查

为了解我国规模化猪场猪伪狂犬病毒(PRV)野毒感染情况,对2012年1月—2015年8月送检的16个省(直辖市)包括240个规模化猪场的7 443份血清样品进行PRV gp I(gE)抗体的检测。结果显示:送检样品中PRVgp I(g E)抗体阳性率在2012年、2013年、2014年和2015年8月份前分别为39.4%,39.6%,43.8%和50.8%。对不同生长阶段的猪群检测结果分析表明,不同生长阶段猪群PRV野毒抗体阳性率差异明显,后备母猪和公猪的PRV gpI(gE)的阳性率偏高;不同季度送检的血清PRV野毒抗体阳性率也有差异。送检样品的规模化养猪场使用的猪伪狂犬疫苗均是gE基因缺失的活疫苗,因此,gE抗体阳性的猪场可以判定为PRV野毒感染阳性场。     

2018年河南省郑州市定点监测猪群伪狂犬病gE抗体检测

为了解河南省郑州市2018年规模猪场的伪狂犬病野毒感染情况,利用gE抗体ELSIA方法,对免疫过猪伪狂犬病gE基因缺失疫苗的36个不同养殖规模的定点监测猪场,进行gE抗体检测。2018年1—12月,共检测血清样品1 057份,检出阳性场27个,场群阳性率为75.0%(27/36);检出阳性样品309份,样品阳性率为29.2%(309/1 057)。结果表明,郑州市伪狂犬病野毒感染面较广,流行率较高,存在较高的疫情暴发风险。存栏500头以下规模猪场的gE抗体阳性率(69.8%)是存栏3 000头以上的规模场(19.1%)的3.65倍,表明养殖规模越小,伪狂犬病野毒感染风险越大。利用荧光PCR方法对gE抗体阳性样品进行检测,检出阳性32份,阳性检出率为35.6%(32/90),表明感染猪群的持续带毒、排毒现象较为严重。建议规模化养猪场加强gE基因缺失疫苗免疫和gE抗体检测,及时淘汰阳性猪,同时结合隔离、消毒等综合防控技术,逐步实现猪伪狂犬病的控制与净化。     

猪伪狂犬病净化技术的研究

在某600头母猪的伪狂犬病阳性猪场,应用猪伪狂犬病gE基因缺失弱毒苗对全场所有猪只严格按免疫程序进行强化免疫,8个月后对本场种猪群猪伪狂犬病开展流行病学调查,当抽样检测gE抗体阳性率低于5%时,对全群种猪进行检测并淘汰gE阳性猪只,对免疫后的后备母猪进行逐头检测,gE阴性猪只并入生产群。通过反复检测、淘汰,3年后,该场猪伪狂犬病野毒阳性率由2008年的11.53%下降为0,达到净化标准。     

伪狂犬病病毒野毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据伪狂犬病病毒gE基因的序列,设计和合成了一对特异的可用于检测伪狂犬病病毒野毒的PCR引物和一条Taqman荧光探针,采用Li ght Cycl e 480荧光定量PCR仪,建立了一种可实时定量检测伪狂犬病病毒野毒的荧光定量PCR技术。该方法的线性范围为1.0×102～1.0×1010拷贝,灵敏度可达4拷贝。检测速度快,仪器的运行时间仅为1 h。对13株猪伪狂犬病病毒野毒进行了检测,结果均为阳性;与伪狂犬病gE基因缺失疫苗、猪细小病毒和鸭瘟病毒无非特异性反应。与病毒分离培养比较,该方法具有快速、灵敏、特异、定量、重复性好等优点,可望用于临床上伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒的区分,伪狂犬病病毒野毒的检测和病毒分布的研究等。     

广东省东莞市2010—2014年猪伪狂犬病野毒抗体监测与分析

利用ELISA方法对猪伪狂犬病野毒（gE）抗体进行检测,分析2010—2014年连续5年来自东莞32个镇街820个养猪场点12 108份血清的检测结果。分析发现：2010—2012年,东莞猪伪狂犬病野毒感染程度整体呈下降趋势,2012年阳性率最低（8.37%）,2013年开始反弹,2014年达到46.97%;每年各季度均能检出伪狂犬病毒gE抗体,其中2014年第二季度的检出率最高,但在第四季度有所回落。分析认为,2013年后东莞市猪伪狂犬病野毒抗体阳性率上升的原因可能是出现了新变异毒株;定期监测猪群的伪狂犬病毒gE抗体水平,尤其是种猪,及时淘汰阳性猪,仍是控制猪伪狂犬病的重要手段。     

猪伪狂犬病野毒感染的临床诊断、血清学调查以及控制措施

目的为某规模化猪场猪伪狂犬病病毒野毒株感染防控工作提供科学的免疫防控方案。方法对某发病猪群（采用Bartha-K61经典毒株疫苗进行了猪伪狂犬病免疫）进行流行病学调查,并采用ELISA方法检测其猪伪狂犬病gB抗体和gE抗体水平。结果根据调查、解剖和血清抗体检测结果,初步确诊该发病猪群为猪伪狂犬病野毒感染。通过采取紧急免疫伪狂犬病HB2000毒株疫苗、调整免疫程序和配合药物治疗等措施,育肥猪死亡率从2.56%降低至0.60%;除了4周龄及12周龄猪群外,其余猪群伪狂犬病野毒抗体水平全部下降;种公猪、8周龄、10周龄、14周龄猪群伪狂犬病野毒抗体阳性率均为0。结论Bartha-K61经典毒株疫苗并不能提供完全的保护力,通过紧急免疫与流行毒株同源性较高的HB2000毒株疫苗,加强生物安全管理工作,能够有效控制猪伪狂犬病野毒感染。     

2015—2020年山东省枣庄地区部分养殖场户猪伪狂犬病流行病学调查

为了解山东省枣庄地区猪伪狂犬病野毒感染情况,2015—2020年对该地区的83家规模猪场和92家散养户采集3 634份猪血清样品,采用ELISA方法进行了猪伪狂犬病野毒感染gE抗体检测。结果显示,175家养殖场户中有73家群体显示猪伪狂犬病野毒感染阳性,群体阳性率为41.71%。3 634份血清样品中有905份样品猪伪狂犬病野毒gE抗体阳性,个体阳性率为24.90%;并对不同养殖类型、不同区域、不同年份的猪伪狂犬病野毒感染情况进行分析。结果表明,枣庄地区的部分养殖场户的猪场中存在猪伪狂犬病野毒毒株,该地区的养殖场（户）应加强对猪伪狂犬病疫苗免疫和生物安全综合防控。     

猪伪狂犬病病毒疫苗株与野毒株鉴别PCR检测方法的建立及初步应用

本试验根据疫苗株缺失gE基因、野毒株和疫苗株均有gB基因的特点,设计两对引物,建立了PCR方法,使用该方法分别对PRV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV进行PCR检测,结果只能从PRV Fa野毒株DNA提取物中扩增出354、237 bp的核苷酸片段,从PRV Bartha-K61疫苗株扩增出237 bp的片段,其他病毒均未扩出条带,达到了区分疫苗株与野毒株的目的。同时,应用该方法对吉林省各大猪场进行了临床病料检测,结果表明,在采集的205份病料中有32份检测为猪伪狂犬病病毒野毒感染,阳性率为15.6%。     

猪伪狂犬病病毒gE基因缺失苗免疫试验

为了掌握猪伪狂犬病gE基因缺失疫苗免疫效果,并制定合理的免疫程序,选用国产和进口的猪伪狂犬病gE基因缺失弱毒疫苗,用4种不同的免疫程序,对250头母猪和1000头仔猪进行了免疫试验。试验期间,按比例定时采集免疫猪的血液,用ELISA试剂盒进行抗体检测,证明猪伪狂犬gE基因缺失疫苗,无论国产苗或进口苗都可以产生良好的免疫效果;无论跟胎免疫、1年2次普免,每隔4个月定时免疫,效果均良好。种猪免疫抗体合格率达100%,仔猪49日龄前抗体合格率达100%,75日龄后抗体逐渐降低,120日龄后基本消失。为了使猪体免疫力更强,不给野毒入侵的机会,建议仔猪在首免后,适当时间进行二次加强免疫。而只给公猪、母猪春秋两季免疫,不给仔猪免疫组,仔猪在35日龄后抗体降为阴性,不能抵抗野毒的侵袭,这种免疫方法不宜推广。     

基于US区缺失位点猪伪狂犬病病毒疫苗株与野毒株鉴别诊断方法的建立

依据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒全基因组序列,针对gI、gE、28K、TK四个基因序列,设计、合成了5条引物,并对野毒株SA株、gI-/gE-/PRVSA双基因缺失株和Bartha K61疫苗株进行了扩增,得到2061bp、1323bp、801bp和963bp特异性目的条带,其中BarthaK61疫苗株基因组检测最小浓度为136pg/μL。建立了针对野毒株和两种疫苗株的鉴别诊断方法。     

猪伪狂犬病病毒gE基因缺失苗免疫试验

为了掌握猪伪狂犬病gE基因缺失疫苗免疫效果,并制定合理的免疫程序,选用国产和进口的猪伪狂犬病gE基因缺失弱毒疫苗,用4种不同的免疫程序,对250头母猪和1000头仔猪进行了免疫试验。试验期间,按比例定时采集免疫猪的血液,用ELISA试剂盒进行抗体检测,证明猪伪狂犬gE基因缺失疫苗,无论国产苗或进口苗都可以产生良好的免疫效果;无论跟胎免疫、1年2次普免,每隔4个月定时免疫,效果均良好。种猪免疫抗体合格率达100%,仔猪49日龄前抗体合格率达100%,75日龄后抗体逐渐降低,120日龄后基本消失。为了使猪体免疫力更强,不给野毒入侵的机会,建议仔猪在首免后,适当时间进行二次加强免疫。而只给公猪、母猪春秋两季免疫,不给仔猪免疫组,仔猪在35日龄后抗体降为阴性,不能抵抗野毒的侵袭,这种免疫方法不宜推广。     

江苏省南京市猪伪狂犬病血清流行病学调查

为了解南京市猪伪狂犬病野毒感染情况,2015年对南京市40个猪场660份猪血清进行了伪狂犬病毒gE抗体监测和分析。结果显示,全市共发现7个抗体阳性猪场,场阳性率为17.50%;共检出gE抗体阳性血清31份,抗体阳性率为4.69%。经产母猪gE抗体场阳性率最高,达28.57%,血清gE抗体阳性数占总数的8.57%;而8个后备母猪场均没有检测到gE阳性抗体;断奶前仔猪的gE抗体阳性也相对较低。结果表明,南京市猪场仍有伪狂犬野毒感染或因母本感染野毒导致母源抗体的存在。     

国产与进口猪伪狂犬病gE基因缺失苗免疫对比试验

为比较国产与进口猪伪狂犬病娅基因缺失疫苗免疫效果,并制定合理的免疫程序,笔者选用国产和进口的猪伪狂犬病gE基因缺失弱毒疫苗,用3种不同的免疫程序,对240头母猪和1200头仔猪进行免疫试验。试验期间,定时随机采集免疫猪的血液,用ELISA试剂盒进行抗体检测。结果表明,母猪和仔猪无论免疫国产或进口猪伪狂犬病gE基因缺失弱毒疫苗,免疫效果均良好。母猪免疫抗体合格率达100％,仔猪49日龄前免疫抗体合格率达100％,免疫效果差异不显著。但免疫猪群在75日龄后抗体逐渐降低,120日龄后基本消失。为维持猪体免疫力,不给野毒入侵的机会,建议仔猪首免后,在适当时间进行二次加强免疫。     

伪狂犬病免疫净化方案的评价

从一伪狂犬病阴性场选肉仔猪77头,均在2日龄鼻内接种伪狂犬病gE基因缺失弱毒疫苗1头份,免疫前采血,以后每间隔两周采血1次直至18周龄,检测并分析每份血样中的gE和gB抗体。另从一伪狂犬病阴性场选后备母猪50头,于77、147、175日龄肌注伪狂犬病gE基因缺失弱毒疫苗,于40、60、76、91、114、143、161、173、191、226日龄采血,检测并分析每份血样中gB抗体。结果表明,肉仔猪各周龄伪狂犬病野毒抗体(gE)均为阴性,疫苗母源抗体(gB)随日龄的增加而下降,但在114日龄有5头猪gB抗体阳转;免疫伪狂犬病gE基因缺失弱毒疫苗的后备母猪,首免后抗体上升,二免后抗体明显上升、并保持高水平,第3次免疫后抗体较二免后上升不明显。     

伪狂犬基因缺失疫苗滴鼻免疫对商品猪群gE抗体的影响

伪狂犬病是严重危害规模化养猪的重要疾病之一。猪只一旦感染伪狂犬病毒,将会终身带毒,成为猪场的隐患。通过本次试验可以发现,如果使用合适的疫苗,并按照正确的操作方法,滴鼻免疫伪狂犬gE基因缺失疫苗,可以有效阻止野毒对商品猪群的感染,降低商品猪群的野毒阳性率。     

2016年江苏省部分猪场猪伪狂犬病血清流行病学调查

2011年底,我国再次暴发猪伪狂犬病疫情,并造成严重经济损失。本研究采集2016年江苏省13个地市56个规模猪场的1 741份猪血清,采用伪狂犬病病毒（PRV）gE-ELISA、gB-ELISA抗体检测试剂盒进行血清学流行病学调查。调查结果显示：猪场PRV野毒抗体阳性率为94.6%（53/56）,血清gE抗体阳性率为43.2%,其中苏北地区显著高于苏中和苏南地区;公猪野毒感染阳性率为55%,后备母猪野毒感染阳性率高达69.4%;经产母猪野毒感染阳性率为44%,gE抗体阳性率与母猪胎次密切相关。结果表明：猪伪狂犬病在江苏省流行依然广泛,野毒感染较为严重,尤其是苏北地区;应重点关注种猪群,并加强伪狂犬病的疫苗免疫和抗体检测,从而更好地防控该病。     

江苏省猪伪狂犬病流行病学调查及两种疫苗免疫效果评估

为了掌控江苏地区规模化猪场伪狂犬病野毒的感染情况及其流行性趋势,比较变异株猪伪狂犬病疫苗(C株)和Bartha-K61疫苗的免疫防控效果。于2017年5月份至2019年1月份对江苏地区59个规模场进行采样,通过间接ELISA方法检测猪群中的gE抗体来鉴定猪群是否被伪狂犬病野毒感染。另外,在一猪伪狂犬病阳性的规模猪场进行变异株猪伪狂犬病疫苗(C株)和Bartha-K61疫苗的防控效果的实验,通过检测猪伪狂犬病gE,gB抗体及中和抗体来判定猪群的猪伪狂犬病抗体保护水平。显示4 608份检测血样中,gE阳性1 681份,阳性率36%,母猪群gE阳性率46%,育肥猪群gE阳性率28%,59个猪场中育肥阶段gE阳性的猪场22个,占比37%。在其中一个商品猪群gE抗体100%阳性猪场进行2组猪伪狂犬病疫苗的实验,通过实验2组商品猪gE抗体18周龄至出栏前均为阴性,同时检测发现变异株疫苗(C株)对经典株和变异株的中和抗体效价均高于Bartha-K61疫苗。结果表明,江苏地区猪伪狂犬病感染压力较大,另外C株疫苗相对于进口的Bartha-K61株疫苗在本场的免疫效果更佳。     

南平市延平区部分规模猪场猪伪狂犬病血清学初步调查

为了了解延平区规模养殖场猪伪狂犬病（PR）野毒感染情况,2013年1-6月从本地大部分使用猪伪狂犬gE基因缺失疫苗免疫的10个规模猪场共采集了366份血清,应用酶联免疫吸附试验,进行猪伪狂犬病gE抗体检测。结果表明,猪场抗体阳性率为70％（7／10）,样品阳性率为18．03％（66／366）,说明延平区本地规模猪场不同程度受到猪伪狂犬病的野毒感染。