桃ACC氧化酶cDNA片段扩增及其克隆和鉴定

采用“富集ＰＣＲ”方法,用单个特异引物和ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５从桃伤处理叶片ｃＤＮＡ 中扩增出特异性片段⒚将扩增产物分离并克隆筛选到１３ 个重组克隆,其中有６ 个克隆能与ＡＣＣ氧化酶基因组ＤＮＡ 杂交,对其中一个阳性克隆ｐＧＥＭＡＣ１２ 作酶切分析,发现其酶切图谱与已报道的桃果实成熟相关的ＡＣＣ氧化酶ｃＤＮＡ 基本一致⒚ＤＮＡ 序列分析表明,插入片段两端ＤＮＡ 序列均是 ５＇端特异引物序列,表明是由５＇端特异引物单个引物扩增出来,全序列分析表明插入片段全长８３３ ｂｐ,是ＡＣＣ 氧化酶ｃＤＮＡ 基因编码区的一部分,５＇端缺少启始密码子ＡＴＧ,３＇端缺少部分编码序列和终止密码子ＴＡＡ⒚     

野桑蚕酚氧化酶原基因PPO1的克隆及其特征(英文)

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆野桑蚕(Bombyx mandarina)酚氧化酶原基因PPO1,获得其cDNA序列;该序列长2 086bp,含有一个2 058bp的完整开放阅读框,编码一个由685个氨基酸残基组成的蛋白质;该基因推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO1基因相应的氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的PPO基因所共有的典型特征。RT-PCR检测分析表明该基因仅在野桑蚕的头部和血液中表达,而Northern杂交检测表明该基因仅在血液中有表达。这些结果为进一步研究该基因的功能提供了分子基础。     

茶树紫黄素脱环氧化酶基因的cDNA克隆及其生物信息学分析

根据GenBank中已登录的植物紫黄素脱环氧化酶（VDE）基因序列，以其高度保守的氨基酸序列设计一对简并引物，采用RT-PCR与3′/5′-RACE相结合的方法，从茶树（Camellia sinensi)中克隆出VDE的全长cDNA，长度为1632bp，分析表明，该序列的5′-端和3′-端的非编码序列长度分别为61bp和140bp，开放阅读框为1422bp，编码473个氨基酸。其转运肽长度为132个氨基酸。成熟蛋白的氨基酸序列与拟南芥，莴苣，菠菜及烟草的同源性分别为83.5%。82.7%,82.1%和83.6%。且有3个特殊的结构域；半胱氨酸富集区，脂肪结合蛋白特征区和由谷氨酸富集的高电荷区，分析表明，茶树VDE具有热稳定性。     

球孢白僵菌MZ050724对亚洲玉米螟幼虫毒力研究

利用浓度为4.0 ×104～4.0 ×108个/mL的球孢白僵菌MZ050724分生孢子液对3龄和4龄亚洲玉米螟幼虫进行毒力测定研究.结果表明,该菌株具有较高的杀虫活性,对3龄幼虫最高累计校正死亡率为88.65%,致死中浓度WEI(2.195±0.135)×104个/mL,致死中时间(4.30±0.16)d;对4龄幼虫最高累计校正死亡率为85.75%,致死中浓度为(4.362±0.088)×105个/mL,致死中时间(4.77±0.11)d.相比较对3龄幼虫的防治效果好于对4龄幼虫的防治效果.     

家蚕幼虫各发育时期酚氧化酶原基因的转录活性分析

[目的]为进一步了解家蚕酚氧化酶原基因的功能奠定基础。[方法]根据GenBank上登录的家蚕酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)的cDNA序列设计2对特异引物,通过半定量RT-PCR技术检测家蚕幼虫各发育时期(蚁蚕到5龄起蚕)酚氧化酶原基因的转录活性。[结果]PPO1和PPO2基因在家蚕幼虫各发育时期的转录活性存在较大差异。PPO1基因在2龄眠蚕、4龄眠中的表达量最高,其次是2龄起蚕、3龄眠蚕3、龄起蚕和1龄眠蚕,在3龄眠中、4龄起蚕的表达量较低,在4龄眠蚕有弱表达,在其他发育时期几乎无表达。PPO2基因除了在蚁蚕1、龄眠中、2龄眠蚕无表达外,在其他时期的表达量均较高。[结论]酚氧化酶原基因在家蚕幼虫各发育时期的转录表达均具有明显的时空特异性。     

亚洲玉米螟piggyBac类似因子的克隆及序列分析

为了深入了解piggyBac转座子家族的生物学特性及分子进化特点,采用简并PCR、反向PCR、RT-PCR和RACE等方法在农业害虫亚洲玉米螟中克隆到2个piggyBac类似因子,分别命名为OfPLE1和OfPLE2。利用生物信息学软件分析Of-PLE基因编码区序列结构以及与其他物种的系统发育关系,结果表明,OfPLE1全长1 866 bp,编码607个氨基酸;OfPLE2全长1 724 bp,编码434个氨基酸。两者同源性高达70%,与粉纹夜蛾piggyBac同源性分别为32%和26%,亲缘关系较远。     

小金蝠蛾酚氧化酶原基因的克隆及表达分析

通过逆转录PCR技术克隆获得小金蝠蛾(Thitarodes xiaojinensis)幼虫酚氧化酶原(TxPPO)基因cDNA的部分序列,对其进行生物信息学分析及组织表达谱分析。克隆该基因cDNA所得的部分序列长度为2654 bp,其CDS全长为2 070 bp,编码的蛋白质由689个氨基酸残基组成,预测分子质量为79.31 ku、等电点为5.91,无信号肽。进一步对TxPPO氨基酸序列分析及系统发育树构建,发现该基因与其他鳞翅目昆虫酚氧化酶原-2(PPO2)聚为一支,同源性较高,相似度为62.45%～63.61%。此外,TxPPO含有与其他鳞翅目昆虫PPO相似的丝氨酸蛋白酶酶切位点、thiolester-like位点、3个保守的血蓝蛋白结构域、2个高度保守的铜离子结合位点及位于铜离子结合位点内的6个保守的组氨酸残基。通过实时荧光定量PCR及Western blot方法对PPO基因在小金蝠蛾幼虫各组织中的表达情况进行检测,RT-qPCR结果显示,该基因在小金蝠蛾幼虫的血细胞中转录水平最高,其次为头部、脂肪体、表皮、中肠组织;Western blot检测结果表明,该蛋白分布于小金蝠蛾幼虫的血浆、头部、表皮组织及中肠组织中,而未在脂肪体检测到其分布。     

亚洲玉米螟Pgi基因全长的同源PCR克隆

为从核酸水平上研究亚洲玉米螟Pgi基因,以GenBank中的鳞翅目昆虫Pgi基因mRNA序列为参考序列,利用MEGA 5.0软件、IDT在线程序及Primer Primer5.0软件等设计用于扩增亚洲玉米螟Pgi基因编码序列的引物,同时利用PCR扩增及序列分析验证引物的有效性。结果表明:测定的亚洲玉米螟Pgi基因编码序列与Genbank中美国白蛾、苜蓿黄蝶等鳞翅目昆虫Pgi基因mRNA序列均具有较高的相似度(达78%~85%),表明,设计的引物均具有较强的有效性,能成功地扩增出亚洲玉米螟Pgi基因编码序列。     

野桑蚕各发育时期酚氧化酶原基因的表达谱分析

酚氧化酶在昆虫的免疫防御机制中起着非常重要的作用。利用在GenBank上登录的野桑蚕酚氧化酶原基因的cDNA序列,设计正反向特异引物,通过半定量RT-PCR技术检测了酚氧化酶原基因PPO1及PPO2在野桑蚕不同发育时期(蚁蚕、一龄、二龄、三龄、四龄、五龄1~6 d、预化蛹和蛹)的转录表达活性。结果表明,PPO1基因除了五龄1 d无表达及二龄表达量较低外,其他时期的表达量均较高。PPO2基因在野桑蚕的不同发育时期中均有表达,并且没有明显的差异。说明在野桑蚕的不同发育时期,PPO1基因的表达是特异性的,而PPO2基因的表达是非特异的。     

不同类型玉米组织对亚洲玉米螟幼虫存活和生长发育的影响

亚洲玉米螟[Ostriniafurnacalis(Guenée)]是中国玉米生产上最重要的害虫,严重影响玉米的产量和质量。由于不同类型玉米对亚洲玉米螟的抗性程度不同,影响玉米螟的存活和生长发育,同一品种的不同组织器官对玉米螟的存活和发育影响也不相同。笔者在室内研究了高油玉米、糯玉米、甜玉米和普通玉米等的不同组织对亚洲玉米螟幼虫存活、生长和发育的影响。结果表明,不同类型玉米在不同生育期的组织器官对亚洲玉米螟幼虫的存活、生长和发育的影响不同。高油玉米298的心叶组织最适合玉米螟幼虫的存活和生长发育,而心叶期抗螟品种邢抗2号和的心叶不利于玉米螟幼虫的存活、生长和发育。玉米螟幼虫在高油玉米、甜单8号和白糯4号的雄穗上存活率高,幼虫体重较重,而在邢抗2号雄穗上的存活率和幼虫体重最低。甜单8号玉米苞叶总体上比较适合亚洲玉米螟幼虫生长和发育,而白糯4号和邢抗2号的苞叶对亚洲玉米螟幼虫生长发育有明显的不利影响。甜单8号、农大108和高油298的花丝适宜玉米螟幼虫生长和发育。而超甜2号和邢抗2号2个品种的花丝对玉米螟幼虫生长和发育有不利影响。超甜2号玉米的穗轴适宜玉米螟生长和发育,玉米螟幼虫在甜单8号和白糯4号穗轴上取食存活率和化蛹率高,但蛹重较轻。邢抗2号穗轴对玉米螟生长发育有不利影     

亚洲玉米螟幼虫血细胞对外源体的包囊

    亚洲玉米螟幼虫血细胞包囊具双相性.当DEAE-sephadex珠子被诱导进亚洲玉米螟幼虫的血腔内后,颗粒细胞首先在3 min内吸附到珠子表面,浆细胞随后吸附形成多层浆细胞层,注射48 h后最终形成重叠细胞层的平滑囊鞘.完整的囊鞘显示有3层明显不同的区域.颗粒细胞起着最初识别血腔中的外源体作用,一旦珠子被颗粒细胞识别为外源体,颗粒细胞将裂解释放一些公认的物质诱导浆细胞识别外源体,于是包囊被立刻启动.总之,研究结果显示亚洲玉米螟幼虫包囊明显依赖血细胞之间的互相合作.     

亚洲玉米螟两地理种群幼虫发育历期的比较

为探明亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis 幼虫对光温反应的差异,详细比较了来自2个不同地理种群的亚洲玉米螟（江西南昌28.7°N、115.9°E和广西阳朔24.8°N、110.5°E）幼虫在5 个温度和6个光周期下的发育历期。结果表明：随温度的升高和光照时间的延长,2个地理种群亚洲玉米螟幼虫期的差异呈减小趋势;在光周期为L12:D12 和L11:D13 时,仅少数幼虫化蛹,绝大多数幼虫进入滞育。其结果揭示了即使在同一种类昆虫中,不同试验条件,其幼虫发育历期的地理差异也可能不同。     

家蚕酸吡哆醇氧化酶cDNA克隆、鉴定及基因结构分析

[目的]了解家蚕维生素B6关键代谢酶磷酸吡哆醇氧化酶(PNP0)的基因结构.[方法]利用生物信息学原理和PeR方法,克隆出编码家蚕(Bombyx mori)PNPO的cDNA(GenBank登录号:DQ452398);采用T7启动子/T7 RNA聚合酶原核表达系统对cDNA进行体外表达,并通过酶活检测进行表达产物的功能鉴定;依据家蚕基因组数据库信息和得到的cDNA,对家蚕PNPO基因结构进行分析.[结果]克隆到的cDNA含有771 bp的完整可读框,编码一条分子量为29.86 kD、含257个氨基酸残基的蛋白质.序列比对显示此蛋白质与人类PNPO具有51.44%的同源性,包含PNPO家族共有的保守序列,但在人和大肠杆菌PNPO中具有重要作用的几个氨基酸残基在此蛋白质中被替换.在以磷酸吡哆醇(PNP)为底物时,表达产物Pro-PNPO的酶活力约为17 nmol·min-1·mg-1.家蚕PNPO基因包含5个外显子和4个内含子,跨越3.5 kb DNA序列,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则,基因的5'端启动子调控区发现有TATA-box和CAAT-box保守基序.[结论]获得家蚕PNPO基因,可利用该基因在分子水平上研究家蚕的VB6代谢特征,弄清PNPO家族的特征及其在生物进化过程中的演变规律.     

黑曲霉木聚糖酶和β-葡聚糖酶cDNA片段克隆和序列分析

木聚糖酶（1,4-β-xylanase, EC 3.2.1.8)以内切方式水解木聚糖分子中β-1,4-木糖苷键，其水解产物主要为木二糖及木二糖以上的寡聚木糖，也有少量的木糖和阿拉伯糖。该酶不仅对于降解自然界大量存在的半纤维素起着重要作用，而且也具有潜在的应用前景，如在造纸工业中用它作为纸浆的漂白剂,饲料工业中可提高纤维类饲料的消化利用率。β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)能分解大麦中以β-1,3和β-1,4混合键连接的结构性非淀粉多糖β-D-葡聚糖，属于半纤维素物质。在啤酒工业中应用β-1,3-1,4-葡聚糖酶，可提高麦汁分离速度，减少啤酒混浊度和胶状沉淀物，从而改善啤酒质量；在大麦日粮中，可改善谷物营养价值，提高畜禽生长速度和饲料转化率。因而木聚糖酶和β-1,3-1,4-葡聚糖酶作为重要经济价值酶，对于生物资源的开发利用具有重要作用。研究结果表明，微生物的木聚糖酶存在着多态性，有关黑曲霉木聚糖酶基因在国内尚未见报道。β-1,3-1,4-葡聚糖酶及其基因方面的报道主要为芽孢杆菌，在真菌中仅报道厌氧菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因。我们克隆了黑曲霉FS6的木聚糖酶和β-1,3-1,4-葡聚糖酶的cDNA片段并分析了序列。……     

小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α亚基cDNA片段的克隆和序列分析

利用简并引物，采用PCR等分子生物学技术，对小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR)α亚基的cDNA片段进行克隆，并对序列进行分析。测序结果显示，扩增的目的基因片段包含了nAChRα亚基的3种亚型（分别命名为Pxαl，Pxα2，Pxα3）。都具有典型的α亚基的结构；2个相邻的半胱氨酸，由2个半胱氨酸之间二硫键形成包含15个氨基酸的胞外环，与烟碱和α银环蛇毒素结合有关的氨基酸残基，克隆的基因片段在氨基酸序列上和其他昆虫nAChRα亚基基因之间有高达65%-99%的同源性，表明克隆的cDNA片段是小菜蛾nAChRα亚基基因的部分序列。     

家蚕磷酸吡哆醇氧化酶cDNA克隆、鉴定及基因结构分析

【目的】了解家蚕维生素B6关键代谢酶磷酸吡哆醇氧化酶（PNPO）的基因结构。【方法】利用生物信息学原理和PCR方法,克隆出编码家蚕（Bombyx mori）PNPO的cDNA（GenBank登录号：DQ452398）;采用T7启动子/T7 RNA聚合酶原核表达系统对cDNA进行体外表达,并通过酶活检测进行表达产物的功能鉴定;依据家蚕基因组数据库信息和得到的cDNA,对家蚕PNPO基因结构进行分析。【结果】克隆到的cDNA含有771 bp的完整可读框,编码一条分子量为29.86 kD、含257个氨基酸残基的蛋白质。序列比对显示此蛋白质与人类PNPO具有51.44%的同源性,包含PNPO家族共有的保守序列,但在人和大肠杆菌PNPO中具有重要作用的几个氨基酸残基在此蛋白质中被替换。在以磷酸吡哆醇（PNP）为底物时,表达产物Pro-PNPO的酶活力约为17 nmol•min-1•mg-1。家蚕PNPO基因包含5个外显子和4个内含子,跨越3.5 kb DNA序列,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则,基因的5’端启动子调控区发现有TATA-box和CAAT-box保守基序。【结论】获得家蚕PNPO基因,可利用该基因在分子水平上研究家蚕的VB6代谢特征,弄清PNPO家族的特征及其在生物进化过程中的演变规律。     

氮和糖对亚洲玉米螟幼虫生长发育的影响

以不同含量的氮和糖两个系列人工饲料为材料，研究氮，糖对亚洲玉米螟幼虫生长发育的影响，结果表明，随着所取食人工饲料中氮和糖含量的增加，幼虫存活率和体重随之增加，历期缩短，取食不同氮和糖含量人工饲料的幼虫相对生长速率３龄均大于５龄，氮对低龄幼虫生长的作用大于高龄，而５龄幼虫的生长则明显受饲料中糖含量的影响。     

亚洲玉米螟幼虫P450基因片断的克隆与序列分析

根据G enB ank中昆虫P 450氨基酸保守序列设计了1对简并引物,以亚洲玉米螟田间自然种群基因组DNA为模板,扩增得到一条长度为603 bp的特异性DNA片段,编码201个氨基酸。将此氨基酸序列与G en-B ank中已知序列采用B last及C lusta lW EB I软件进行同源性分析,结果表明该氨基酸序列与CYP 4家族的同源性较高,达37%~53%,初步推测此序列为CYP 4家族的一员。     

克氏原螯虾酚氧化酶原mRNA组织分布特性研究

酚氧化酶原系统是甲壳动物体内与免疫相关的重要功能系统之一,对于甲壳动物的防御反应具有重要作用。本研究针对克氏原螯虾酚氧化酶原基因保守序列设计引物,利用实时荧光定量PCR法对克氏原螯虾酚氧化酶原mRNA的组织分布进行了初步研究。结果表明,克氏原螯虾酚氧化酶原基因在血淋巴、肝胰腺、卵巢和精巢中转录水平较高;在肌肉、表皮和鳃中有较弱表达;而在肠和胃中几乎无表达。此种组织表达特性可能与酚氧化酶原基因在机体生命活动过程中的功能有关。     

Bt杀虫蛋白在亚洲玉米螟幼虫体内组织中的分布

采用ELISA法检测了亚洲玉米螟取食转基因玉米后,Bt杀虫蛋白(Cry1Ab杀虫蛋白)在幼虫体内组织中的分布情况.结果表明,中肠和血淋巴中Bt杀虫蛋白含量最高,分别为267 ng·g-1和417 ng·g-1,丝腺、脂肪体、马氏管的含量较低,生殖器官中未检测到Bt杀虫蛋白;幼虫取食转基因玉米3d后改喂普通玉米的亚洲玉米螟发育成的蛹、成虫及卵中不含Bt杀虫蛋白.